Análise fitoquímica, potencial antioxidante e toxicidade do extrato bruto etanólico e das frações da espécie Senecio westermaniiDusén frente à Artemia salina

Phytochemical analysis, antioxidant potential and toxicity of crude ethanol extract and fractions of the species Senecio westermanii Dusén against Artemia salina

RESUMO

A espécie Senecio westermanii Dusén pertencente à família Asteraceae é planta endêmica e nativa do Brasil encontrada na região da Floresta Atlântica, nos estados do Paraná e São Paulo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição fitoquímica do extrato bruto etanólico e frações das partes aéreas (folha e caule) de S. westermanii utilizando-se a análise fitoquímica qualitativa e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), avaliar in vitro a toxicidade preliminar utilizando Artemia salina e o potencial antioxidante. O estudo fitoquímico qualitativo revelou a presença de alcaloides, flavonoides, iridoides, esteroides/triterpenos, heterosídeos saponínicos e aminogrupos. Através da análise realizada por CLAE-DAD obteve-se o fingerprint característico de cada amostra. No ensaio frente à A. salina houve ausência de toxicidade das amostras, o resultado da DL₅₀ para todas as amostras foi superior a 1000 μg/mL. Todas as amostras apresentaram atividade antioxidante pela redução do complexo fosfomolibdênio, com destaque para a fração clorofórmio que apresentou atividade antioxidante de 92,51% em relação ao padrão rutina. Com relação ao ensaio de redução do radical DPPH•, a fração acetato de etila apresentou IC₅₀ de 26,98 μg/mL. Pelo ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBARS) a fração hexano apresentou o melhor índice antioxidante em relação ao padrão rutina. Os resultados obtidos demonstram evidências de que a espécie é fonte potencial de antioxidantes naturais, estimulando assim novos estudos que viabilizam sua utilização no tratamento de patologias associadas aos radicais livres. Além disso, a espécie não apresentou atividade tóxica preliminar, assegurando sua aplicabilidade.

Palavras-chave
Senecio; Análise fitoquímica; Artemia salina; Antioxidante; CLAE-DAD

ABSTRACT

The species Senecio westermanii Dusén, which belongs to the Asteraceae family, is an endemic and native plant from Brazil. It is found mainly in the Atlantic Forest region, in Paraná and São Paulo states. This study aimed to evaluate the phytochemical composition using a qualitative phytochemical analysis and high performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD), to evaluate preliminary toxicity in vitro using Artemia salina and antioxidant potential. Qualitative phytochemical analysis revealed the presence of alkaloids, flavonoids, iridoids, steroids, triterpenes, saponinic glycosides and aminogroups. The analysis by HPLC-DAD provided the characteristic fingerprint of each sample. In the A. salina assay, the results of LD₅₀ over 1000 μg/mL for all samples did not indicate toxicity of the evaluated extracts. All samples demonstrated antioxidant activity by reducing phosphomolybdenum complex. The highest activity was detected in the chloroform fraction, which presented activity of 92.51% compared to the standard rutin. Regarding the trial to reduce the radical DPPH•, the ethyl acetate fraction showed an IC₅₀ of 26.98 µg/mL. In the thiobarbituric acid assay (TBARS), the hexane fraction showed the highest antioxidant activity compared to the standard rutin. These findings indicate that the Senecio westermanii is a potential source of natural antioxidants, stimulating new studies that enable their use in the treatment of disorders associated with free radicals. In addition, the species did not present toxicity in its evaluation, ensuring its applicability.

Keywords
Senecio; Phytochemical analysi; Artemia salina; Antioxidant; HPLC-DAD

INTRODUÇÃO

Estudos realizados com espécies do gênero Senecio L. evidenciaram a presença de flavonoides com a capacidade de reduzir a ação oxidante de substâncias reativas nas espécies Senecio gallicus, Senecio candicans e Senecio erraticus (Mansour & Saleh, 1981; Mezache et al., 2009; Hariprasath et al., 2012). Além dos flavonoides, Silva et al. (2006) evidenciaram a presença de alcaloides pirrolizidínicos, sendo esta classe de metabólito secundário considerado um marcador quimiossistemático para a tribo Senecioneae.

Segundo Lima & Bezerra (2012) os flavonoides são metabólitos que atuam na proteção do sistema biológico contra o efeito nocivo de processos ou reações que podem causar oxidação no organismo humano, prevenindo ou amenizando doenças. Os alcaloides pirrolizidínicos são conhecidos pela sua atividade hepatotóxica caracterizada por hepatomegalocitose, fibrose e proliferação de ductos biliares (Barros et al., 2007).

Frescura et al. (2013) destacam a importância dos antioxidantes naturais, a exemplo dos flavonoides, em função das suas diversas atividades farmacológicas e terapêuticas. A ação desses metabólitos está relacionada com a melhora da perda da acuidade visual e alterações do campo de visão. Sua presença ameniza os sintomas de insuficiência dos vasos linfáticos e venosos associados com algumas doenças hemorrágicas. Além disso, promovem a normalização da permeabilidade e resistência da parede dos vasos no controle da hipertensão arterial (Frescura et al., 2013).

Os polifenóis em especial os flavonoides possuem ação terapêutica principalmente ligada a patologias que se desenvolvem através dos radicais livres, porém outras atividades como antihiperlepidêmica, anticarcinogênica e antiinflamatória foram encontradas (Becho et al., 2009). A principal propriedade dos antioxidantes é sua capacidade de neutralizar ou sequestrar os radicais livres, tanto na etapa inicial como na propagação do processo oxidativo (Sousa et al., 2007).

Alguns antioxidantes apresentam a capacidade de eliminar espécies de radicais livres, tais como o superóxido e hidroxil, além de reduzir radicais tocoferóis de volta para sua forma ativa nas membranas celulares, mantendo a sua integridade em células dos organismos aeróbios (Oliveira et al., 2011). Também podem prevenir mutações em DNA de humanos, uma vez que altas concentrações dela reduzem mutações causadas por estresse oxidativo em células humanas in vitro (Lutsenko et al., 2002). Sua presença nos alimentos tem um papel importante na preservação de nutrientes do alimento bem como no aumento do tempo de vida em prateleira. Além disso, é um nutriente essencial que deve ser ingerido diariamente (Chaves et al., 2004).

Porém muitos dos antioxidantes utilizados pelas indústrias alimentícias são sintéticos, como, por exemplo, o BHT. A estrutura fenólica do BHT possui a capacidade de doar um elétron a um radical livre, evitando dessa forma a ação destes radicais sobre os alimentos (Ramalho & Jorge, 2006).

Ensaios de toxicidade são frequentemente empregados para averiguar a segurança do uso de plantas na medicina popular, assim como extratos e outros insumos obtidos através de produtos naturais. Para Meyer et al. (1982) a utilização do microcrustáceo Artemia salina é frequentemente aplicado em ensaios de toxicidade aguda para pesquisa preliminar de atividade biológica de extratos e frações obtidos a partir de produtos naturais. Esse simples organismo pode ser usado como um monitor conveniente para a citotoxicidade de produtos, além de ser um método rápido, simples e sensível a substâncias tóxicas.

Devido a ausência de estudos referentes a Senecio westermanii Dusén e por não ser utilizada pela população como fitoterápico ou alimento, a espécie despertou um grande interesse em ser estudada devido ao gênero possuir metabólitos secundários de interesse biológico, como alcaloides e flavonoides. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização fitoquímica do extrato bruto etanólico e frações das partes aéreas (folha e caule) da planta, com relação ao potencial antioxidante in vitro e avaliar a toxicidade das amostras frente a Artemia salina.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal

As partes aéreas da espécie Senecio westermanii foi coletada na Estrada da Graciosa, localizada no município de Quatro Barras - PR, nas coordenadas 25°18’27”S e 48°56’37”W, 845 m. A identificação da espécie vegetal foi realizada no Museu Botânico Municipal (MBM) de Curitiba–PR, onde está depositada a exsicata MBM 379066. O projeto foi regularizado de acordo com a resolução nº35, de 27 de abril de 2011 do Ministério do Meio Ambiente que dispõe sobre a regularização de atividades de acesso ao patrimônio genético.

Obtenção do extrato bruto e frações

O material coletado foi seco em temperatura ambiente e triturado em moinho de facas e martelo. A partir de 6,3 kg do material vegetal seco e estabilizado, o extrato bruto etanólico (355,98 g) foi obtido por meio de extração etanólica exaustiva em aparelho de Soxhlet e posteriormente concentrado em evaporador rotatório, com pressão reduzida, a temperatura de 65 °C e 150 rpm. A partir do extrato bruto foram obtidas as frações n-hexano (57,98 g), clorofórmio (80,04 g), acetato de etila (3,36 g) e hidroalcoólica remanescente (291,73 g) por partição líquido/líquido com solventes de polaridade crescente (Carvalho et al., 2009). Para o extrato aquoso foram macerados à quente 40 g do material vegetal em 200 mL de água destilada a 70ºC em banho-maria por um período de uma hora (Moreira, 1979).

Estudo fitoquímico

As frações do extrato hidroalcoólico da espécie S. westermanii foram submetidas ao ensaio fitoquímico de acordo com Moreira (1979). Os grupos químicos pesquisados foram os alcaloides; flavonoides; cumarinas; iridoides; antraquinonas; esteroides e/ou triterpenos. Para o extrato aquoso foram avaliadas a presença de heterosídeos antociânicos, saponínicos, cianogênicos; taninos hidrolisáveis e condensados; ácidos fixos e voláteis; e aminogrupos.

Análises por CLAE-DAD

As análises cromatográficas foram realizadas empregando cromatógrafo líquido de alta eficiência modelo: Merck Hitachi, detector de arranjo de diodos (DAD) L-2450, com varredura entre 220-400 nm. Coluna X-Terra RP-18 (25 cm x 4,6 mm x 5 µm) e pré-coluna (2,5 cm x 3 mm) de mesma fase da coluna. A eluição foi realizada com gradiente de concentração composta por fase A (fase ácida) e fase B (metanol) iniciando com 80% de fase A e 20% da fase B (0 a 35 min.) até 100% de fase B isocrático até 45 min com a vazão de fluxo da bomba de 1 mL.min^-1 e volume injetado de 20 µL.

Tocixidade frente ao microcrustáceo Artemia salina

Foram adquiridos os ovos do microcrustáceo da espécie Artemia salina e procedeu-se ao ensaio conforme metodologia desenvolvida por Meyer et al. (1982). Os ovos do crustáceo foram eclodidos em água salina, preparada com 14,31 g de sal marinho e disolvido em 400 mL de água purificada. Para esta quantidade, foram adicionados 200 mg dos ovos do crustáceo. O pH foi mantido entre 8,0 e 9,0 para evitar a morte dos crustáceos. A temperatura foi controlada entre 27 °C e 30 °C e a solução foi mantida sob agitação e aeração constante por 48 horas. Nas primeiras horas do processo foi mantida iluminação (20 W) sobre o recipiente. Foram preparadas as amostras em metanol nas concentrações de 1000 μL/mL, 100 μL/mL e 10 μL/mL e adiconados 10 microcrustáceos. Como controle positivo foi utilizado sulfato de quinidina para ocasionar a morte da A. salina. Após 24 horas de contato dos nauplios realizou a contagem dos crustáceos mortos. Os dados foram submetidos a análise pelo método estatístico Probitos e determinados os valores da dose letal (DL₅₀) com 95% de intervalo de confiança.

Avaliação da atividade antioxidante

Ensaio de redução do complexo fosfomolibdênio

A reação para formação do complexo requer o preparo de um reativo que consiste de uma solução com fosfato de sódio 0,1 mol/L (28 mL), molibdato de amônio 0,03 mol/L (12 mL) e ácido sulfúrico 3 mol/L (20 mL), sendo o volume final ajustado H₂O para 100 mL. O extrato bruto e as frações foram preparados na concentração de 200 μg/mL em metanol, assim como os padrões utilizados, vitamina C e rutina. Em tubos de ensaio foram colocados alíquotas de 0,3 mL de cada amostra e adicionado 3 mL de solução reagente do complexo fosfomolibdênio. Os tubos foram fechados e incubados a 95 °C por 90 minutos. Após resfriamento, a leitura das absorbâncias foi realizada em espectrofotômetro UV-1601 PC Shimadzu^® no comprimento de onda 695 nm. O branco era constituído de 0,3 mL de metanol e 3 mL de reativo. Todo o ensaio foi realizado em triplicata (Prieto et al., 1999).

A capacidade antioxidante das amostras foi expressa em atividade antioxidante relativa (AAR) em relação aos padrões, conforme a equação:

A partir dos resultados de AAR(%) realizou-se a análise estatística dos resultados pelo teste de Scott-Knott (1974) (p<0,05).

Redução do radical DPPH•

A avaliação do potencial de redução do radical DPPH• foi realizada de acordo com a metodologia proposta por Mensor et al. (2001). Para cada amostra do extrato bruto, frações e dos padrões vitamina C e rutina, foram preparadas concentrações crescentes as quais ficaram em meio reacional com 1 mL de solução de DPPH a 0,03 mmol/mL. Para cada amostra foi preparado um branco com 2,5 mL da solução da amostra e 1 mL de metanol para cada concentração. Paralelamente foi realizado um controle com 2,5 mL de metanol e 1 mL de DPPH. Após 30 minutos as absorbâncias foram medidas em espectrofotômetro a 518 nm.

A atividade sequestrante do radical DPPH foi expressa em porcentagem de atividade antioxidante (AA), conforme a equação:

Para comparar os resultados obtidos foi estabelecida a concentração inibitória (IC₅₀), calculada por regressão linear. No intervalo linear foi estabelecida a equação da reta do tipo y=ax+b, sendo dessa forma, determinada para cada amostra analisada os valores de IC_50. Para a análise estatística dos resultados foi utilizado o teste de Scott-Knott (1974) (p<0,05).

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

O ensaio foi realizados de acordo com Morais et al. (2006). Em tubos de ensaio, foram adicionados 0,5 mL de solução de gema de ovo (10% p/v), 0,1 mL de amostra ou padrão (BHT) 1000 ppm e o volume foi completado com água destilada para 1 mL. Em seguida, foi acrescentado a cada um dos tubos de ensaio 0,05 mL de solução de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto (ABAP) 0,07 mol.L^-1, 1,5 mL de solução de ácido acético 20% (pH 3,5) e 1,5 mL de solução de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,8% p/v em solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) 1,1% p/v. Os tubos de ensaio foram submetidos ao banho-maria (95 ̊C) por 1 hora. Após resfriamento, foi acrescentado 5 mL de n-butanol a cada tubo, que foi centrifugado durante 10 minutos a 3000 rpm. Os sobrenadantes foram submetidos ao espectrofotômetro em 532 nm.

A atividade antioxidante foi determinada pelo Índice Antioxidante (IA), segundo equação:

A partir dos reultados de IA(%) realizou-se a análise estatística dos resultados pelo teste de Scott-Knott (1974) (p<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O resultado do estudo fitoquímico qualitativo indicou por meio de reações características para o extrato hidroalcoólico a presença de alcaloides (Mayer, Dragendorff e Bertrand), flavonoides (leucoantocianidinas, heterosídeos flavônicos e oxálico bórico), iridoides (floroglucinol e ácido sulfúrico/vanilina) e esteroides/triterpenos (Liberman-Bouchard e Keller-Kelliani) (Tabela 1). Porém para o extrato aquoso constatou-se heterosídeos saponínicos (teste de formação de espuma) e aminogrupos (Tabela 2). Através desses ensaios a espécie em estudo revelou um perfil químico semelhante ao encontrado para outras espécies do gênero.

TABELA 1
Resultado da análise fitoquímica a partir do extrato hidroalcoólico da espécie S. westermanii

Grupos Fitoquímicos		FH		FCL		FAE		FHR
Alcalóides		-		+		-		-
Flavonoides		-		+		+		+
Cumarinas		-		-		-		-
Iridoides		+		-		-		-
Antraquinonas		-		-		-		-
Esteroides/T riterpenos		+		-		-		-

• Fração Hexano (FH), Fração Clorofórmio (FCL), Fração Acetato de Etila (FAE), Fração Hidroalcoólica Remanescente (FHR); (+) positivo, (-) negativo

TABELA 2
Resultado da análise fitoquímica do extrato aquoso da espécie S. westermanii

Grupos Fitoquímicos		Extrato Aquoso
Heterosídeos antociânicos		-
Heterosídeos saponínicos		+
Heterosídeos cianogênicos		-
Taninos hidrolisáveis		-
Taninos condensados		-
Ácidos fixos		-
Ácidos voláteis		-
Aminogrupos		+

• (+) positivo, (-) negativo

O perfil cromatográfico do extrato bruto etanólico e frações das partes aéreas de S. westermanii foram comparados entre si empregando como parâmetros o tempo de retenção (Tabela 3) e o espectro de absorção molecular obtido através do detector de arranjo de diodos. Os sinais que apresentaram similaridade com relação aos parâmetros monitorados para as amostras foram numerados. Os picos foram tratados como sinais, pois pode haver mais de uma substância em um mesmo sinal.

TABELA 3
Tempo de retenção dos sinais monitorados presentes nas análises das frações e extrato bruto hidroalcóolico de S. westermani

Pico		Amostras		λAbs		TR
1		EB, FAE		281; 328		19,74
2		EB, FHR		284; 326		20,38
3		EB		286; 326		21,27
4		EB, FCL, FAE		284; 328		21,65
5		FCL		310		13,62
6		FCL		280; 308		25,62
7		FCL		280; 315		26,38
8		FAE		256; 294; 350		20,29
9		FHR		292; 326		14,39

• λ_Abs: Bandas de absorção (nm); TR: Tempo de Retenção (min)

Analisando o cromatograma das amostras (Figuras 1-4) observa-se que o sinal 1 está presente no extrato bruto etanólico e na fração acetato de etila. O sinal 2 está presente no extrato bruto etanólico e fração hidroalcoólica remanescente. O sinal 3 presente apenas no extrato bruto etanólico. O sinal 4 está presente no extrato bruto etanólico e na frações clorofórmio e acetato de etila. O sinal 5 está presente apenas na fração clorofórmio. O sinal 6 está presente apenas na fração clorofórmio. E os sinais 7, 8 e 9 estão presentes, respectivamente, nas frações clorofórmio, acetato de etila e hidroalcoólica remanescente.

FIGURA 1
Perfil cromatográfico do extrato bruto etanólico das partes aéreas de S westermanii

FIGURA 2
Perfil cromatográfico da fração clorofórmio das partes aéreas de S westermanii

FIGURA 3
Perfil cromatográfico da fração acetato de etila das partes aéreas de S westermanii

FIGURA 4
Perfil cromatográfico da fração hidroalcoólica das partes aéreas de S westermanii

Apesar dos tempos de retenção semelhantes para os demais sinais presentes nos cromatogramas, porém não apresentaram similaridade quanto ao espectro de absorção molecular indicando que são substâncias diferentes.

De acordo com Araújo et al. (2010) o bioensaio de toxicidade frente a Artemia salina possui o intuito de monitorar extratos vegetais em diversos laboratórios de produtos naturais. Porém diversos ensaios biológicos simples têm sido desenvolvidos para a mesma função, mas a A. salina tem sido inclusa na rotina laboratorial para monitorar o estudo de extratos e frações de plantas, além disso para auxiliar no isolamento, purificação e elucidação estrutural de componentes isolados dessas amostras. O ensaio permite a avaliação da toxicidade geral e é considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de amostras com potencial atividade biológica.

Bednarczuk et al. (2010) comentam que a A. salina são bastante utilizadas em ensaios toxicológicos por serem de fácil manuseio, baixo custo, fácil cultivo e obtenção. Os ensaios de letalidade são largamente empregados em testes toxicológicos podendo-se obter a dose letal mediana (DL₅₀), dose necessária para ocasionar a morte de 50% dos microcrustáceos nas amostras em estudo.

Dessa forma para o extrato bruto etanólico e frações das partes aéreas de S. westermanii no ensaio de toxicidade ao microcrustáceo A. salina obteve-se uma DL₅₀ superior a 1000 µg/mL para todas as amostras analisadas. De acordo com Nguta et al. (2011) amostras com valores de DL₅₀ inferiores 100 µg/mL são considerados altamente tóxicas, valores entre 100 e 500 µg/mL são moderadamente tóxicas, entre 500 e 1000 µg/mL são suavemente tóxicas e acima de 1000 µg/mL são atóxicas.

Estudos realizadas com algumas espécies do gênero Senecio mostraram se tóxicas frente ao microcrustáceo como exposto por Bardón et al. (2007), onde os extratos clorofórmico e metanólico da mistura das folhas e flores da espécie Senecio santelisis apresentaram uma DL₅₀ de 49 e 1 μg/mL, respectivamente. E para a espécie Senecio puchii os extratos clorofórmico e metanólico apresentaram uma DL₅₀ de 109 e 202 μg/mL, respectivamente (Bardón et al., 2007). Apesar dos alcaloides pirrolizidínicos extraídos das espécies do gênero Senecio demonstrarem toxicidade em bovinos (Barros et al., 2007; Lucena et al., 2010), mas de acordo com Bolzan et al. (2007) esses metabólitos não estão presentes em todas as espécies do gênero.

Dessa forma, algumas espécies do gênero não apresentaram atividade tóxica preliminar frente ao microcrustáceo A. salina como expôs Bardón et al. (2007) para os extratos clorofórmico e metanólico das folhas de Senecio leucostachys e Cuadra et al. (2005) para o extrato etanólico das folhas de Senecio miser. Com isso, o extrato bruto etanólico e as frações da espécie em estudo não apresentaram toxicidade preliminar para a A. salina apresentando uma DL₅₀ >1000 µg/mL, quando comparada ao sulfato de quinidina com valor de DL₅₀ em 89,41 µg/mL.

Para Campos & Frasson (2011) definir uma metodologia mais eficiente de extração de compostos antioxidantes pode não ser fácil, pois estes compostos podem sofrer influência de diversos fatores como a natureza do vegetal, tamanho das partículas, solvente utilizado, tempo e temperatura de extração. Com isso, há diversos métodos para a extração dos componentes antioxidantes em vegetais, dentre eles os tradicionais métodos com solventes orgânicos como a água, etanol, éter e metanol. Para avaliar o desempenho da atividade antioxidante do extrato bruto e frações da espécie S. westermanii foram utilizados os métodos fosfomolibdênio, DPPH e TBARS.

Para Martelli & Nunes (2014) os antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação, inibindo os radicais livres e prevenindo a formação de doenças, tornando-se essenciais para o equilíbrio entre os radicais livres e o sistema de defesa antioxidante do corpo humano. De acordo com Sousa et al. (2007) os radicais livres e outros oxidantes são considerados como grandes causadores de doenças para o ser humano ocasionando declínio do sistema imune, câncer, doenças cardiovasculares, catarata, disfunções cerebrais e diabetes mellitus tipo I. Dessa forma, uma dieta baseada em substâncias essenciais tem um papel importante na prevenção dessas doenças devido a combinação de substâncias presentes nos vegetais, reduzindo o risco de desenvolvimento de doenças crônicas (Pereira & Cardoso, 2012).

De acordo com Prieto et al. (1999) a avaliação pelo método fosfomolibdênio possui a vantagem de avaliar a capacidade antioxidante de componentes lipofílicos e hidrofílicos. Além disso, o método utilizado permite avaliar a capacidade total de uma mistura complexa de compostos (extratos e frações obtidos de plantas) de maneira simples e barata. A partir dos resultados obtidos através desse método (Tabela 4) observa-se que a fração clorofórmio demonstrou potencial antioxidante, com atividade de 92,51% em comparação com a atividade da rutina, utilizada como controle positivo. Segundo Balestrin et al. (2008) a atividade antioxidante no ensaio de fosfomolibdênio pode estar relacionada a uma mistura complexa de componentes químicos, ocorrendo um sinergismo entre eles.

TABELA 4
Análise antioxidante utilizando os métodos Fosfomolibdênio, DPPH e TBARS do extrato bruto e frações das partes aéreas de S. westermani

		REDUÇÃO DO COMPLEXO FOSFOMOLIBDÊNIO				REDUÇÃO DO RADICAL DPPH		TBARS
Amostra		Atividade Antioxidante em Relação à Rutina - AA (%) ± DP		Atividade Antioxidante em Relação à Vitamina C - AA (%) ± DP		IC50 (μg) ± DP		IA(%) ± DP
BHT		-		-		-		33,98 ± 6,11 n
Vitamina C		-		100 d		4,92 ± 0,07 h		-
Rutina		100 a		-		6,15 ± 0,08 h		-
EB		24,33 ± 0,02 c		8,70 ± 0,02 g		169,52 ± 3,50 l		3,68 ± 7,80 p
FH		64,44 ± 0,04 b		23,04 ± 0,04 f		346,96 ± 1,83 m		23,04 ± 10,82 o
FCL		92,51 ± 0,04 a		33,08 ± 0,04 e		71,46 ± 0,21 j		1,05 ± 8,51 p
FAE		53,74 ± 0,02 b		19,22 ± 0,02 f		26,98 ± 0,77 i		4,85 ± 10,35 p
FHR		20,05 ± 0,02 c		7,17 ± 0,02 g		146.72 ± 0,12 k		15,50 ± 6,44 o

• Extrato Bruto (EB), Fração Hexano (FH), Fração Clorofórmio (FCL), Fração Acetato de Etila (FAE), Fração Hidroalcoólica Remanescente (FHR), Butil Hidroxi Tolueno (BHT). AA: Atividade Antioxidante. IC₅₀: Concentração Inibitória. IA: Índice Antioxidante. DP: Desvio Padrão. *Resultados seguidos pela mesma letra não diferem estatisticamente (p < 0,05) entre si, pelo teste de Scott-Knott (1974).

As substâncias existentes no extrato bruto etanólico e frações da espécie S. westermanii também possuem a capacidade em reagir com o radical livre instável DPPH• e convertê-lo no 2,2-difenil- 1-picril hidrazina. A capacidade ou a atividade de atuar como um antioxidante é visível quando há mudança de cor nas soluções preparadas. A fração acetato de etila foi a amostra que mais se aproximou da atividade antioxidante comparada aos controles vitamina C e rutina (Tabela 4), assim como as outras frações e o extrato bruto. A atividade antioxidante medida através do radical DPPH• mostra a capacidade de substâncias pertencentes ao extrato e frações das partes aéreas de S. westermanii em sequestrar radicais livres do meio existente.

De acordo com Andrade et al. (2007) substâncias com núcleo fenólico, como flavonoides, ácidos fenólicos e o tocoferol atuam como captadores de espécies reativas de oxigênio, desta forma possuem características antioxidantes. Os flavonoides atuam como antioxidantes primários, sendo as flavonas e os flavonóis as classes mais encontradas nas plantas. Porém, dependendo do estado de oxidação da cadeia heterocíclica dos flavonoides, tem-se inúmeras atividades biológicas relacionadas a esse metabólito secundário, como atividade antiinflamatória, antitumoral, agregação plaquetária, redução da fragilidade e permeabilidade capilar, inibição na destruição do colágeno e redução na incidência de doenças cardiovasculares (Pereira & Cardoso, 2012). Além disso os flavonoides são comunente isolados da fração acetato de etila como exposto por Paula et al. (2014) e Hirota et al. (2012). Isso explica a uma maior atividade antioxidante da fração acetato de etila da espécie S. westermanii.

No ensaio de peroxidação lipídica pelo método TBARS observa-se que as frações hexano e hidroalcoólica remanescente tiveram atividade antioxidante semelhante ao controle BHT (Tabela 4). Observando-se que a fração hexânica possui um melhor resultado devido sua característica lipofílica, permitindo uma melhor interação com a matriz lipídica. Porém, Santi et al. (2014) comentam que os compostos fenólicos em vegetais abrange uma gama de substâncias, desde moléculas simples até aquelas com alto grau de polimerização, comprovando a atividade antioxidante dos ácidos fenólicos na inibição da peroxidação lipídica.

A peroxidação lipídica promove a perda da fluidez da membrana plasmática e a liberação de proteínas intracelulares, ocasionando lesões de tecidos e afetando biomoléculas no organismo humano (Júnior & Pereira, 2008). Além disso pode ocorrer inativação enzimática, ruptura de membrana, aumento da aterogenicidade de lipoproteínas plasmáticas, mutações e à morte celular (Cerqueira et al., 2007).

Apesar da grande produção de antioxidantes em indivíduos saudáveis, os componentes celulares não são protegidos por antioxidantes endógenos em sua totalidade, sendo necessário a busca de antioxidantes exógenos para a complementação do sistema de defesa, isso faz com que o organismo seja protegido de substâncias oxidantes (Cerqueira et al., 2007).

A inibição da peroxidação lipídica é uma das principais preocupações sobre a questão do estresse oxidativo, a inibição está relacionada com a ação dos fitosteróis no corpo humano, onde agem como transportadores de elétrons. Por serem estruturalmente semelhantes aos lípides de membrana, os fitoesteróis agem na cadeia de transporte de elétrons evitando a oxidação celular do organismo, agindo quimicamente como antioxidantes em membranas celulares e estabilizando-as (Yoshida & Nikki, 2003).

Os fitoesteróis são constituintes das membranas celulares das plantas e são biologicamente comparáveis ao colesterol nos animais, apenas diferem por conterem grupos metilo ou etilo na cadeia lateral da molécula (Ellegard et al., 2007).

Através da análise fitoquímica preliminar foi possível identificar classes de metabólitos secundários de interesse farmacológico presentes nos extrato bruto etanólico e frações de S. westermanii. Para complementar foram realizados fingerprint das amostras através da análise por CLAE-DAD para comprovar a presença de vários componentes secundários nas amostras analisadas, observando-se que alguns sinais possuem o mesmo tempo de retenção e espectro de absorção para mais de uma amostra.

Para auxiliar de forma complementar os estudos fitoquímicos, utilizou-se o bioensaio de toxicidade sobre A. salina, isentando o extrato bruto etanólico e as frações de apresentarem toxicidade preliminar. Além disso as amostras analisadas de S. westermanii mostrou-se excelente perante a atividade antioxidante por diferentes mescanismos, como capacidade redutora (complexo fosfomolibdênio), capacidade de sequestro de radicais livres (DPPH) e efeito protetor contra a peroxidação lipídica (TBARS). Aliado a isso, tem-se a ausência de toxicidade frente à A. salina mostrando que a espécie em estudo possui potencial para o desenvolvimento de fitoterápicos, uma vez que outras espécies do mesmo gênero, cuja rota metabólica é semelhante, tem apresentado interesse por parte da indústria farmacêutica, visto que muitas doenças estão relacionadas diretamente com distúrbios oxidativos.

AGRADECIMENTOS

À CAPES e CNPQ pela concessão das bolsas de estudo e financiamento do projeto e ao Museu Botânico Municipal da Prefeitura de Curitiba (MBM), pela identificação da espécie vegetal.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2015

Histórico

• Recebido
  16 Out 2014
• Aceito
  15 Abr 2015