Contribuição do polimorfismo rs1799998 no gene CYP11B2 na suscetibilidade à pré-eclampsia

Resumo

Objetivos:

avaliar a associação entre o polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 e a suscetibilidade à PE em uma população brasileira.

Métodos:

participaram desse estudo 61 mulheres com PE e 116 mulheres normotensas. O polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 foi amplificado por PCR alelo-específica. O risco do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 contribuir com a PE foi avaliado pela análise de regressão logística múltipla.

Resultados:

as frequências genotípicas observadas foram 1.64% CC, 91.80% CT e 6.56% TT no grupo PE e 11%CC, 73%CT e 16%TT grupo controle. A distribuição da frequência genotípica não estava em Equilíbrio de Hardy Weinberg em nenhum dos grupos estudados. A análise de regressão logística múltipla demonstrou diferença estatisticamente significativa para o polimorfismo rs1799998 no modelo recessivo.

Conclusão:

o presente trabalho sugere associação do genótipo C/C no modelo recessivo, do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 com a suscetibilidade a PE.

Palavras-chave:
Polimorfismo genético; Pré-eclâmpsia; Citocromo P-450

Abstract

Objectives:

the present study aimed to evaluate the association between the rs1799998 polymorphism of the CYP11B2 gene and the susceptibility to preeclampsia (PE) in a Brazilian population.

Methods:

the study group comprised 61 women who were diagnosed with PE. The control group included 116 women who did not show changes in their blood pressure levels during their pregnancies. The rs1799998 polymorphism of the CYP11B2 gene was amplified by allele-specific polymerase chain reaction (PCR). A multiple logistic regression analysis was performed using the SNPStat program to evaluate the risk of the CYP11B2 gene rs1799998 polymorphism contributing to PE.

Results:

the PE group had the following genotypes: 1.64% CC, 91.80% CT, and 6.56% TT. In the control group, the observed genotypic frequencies were: 11% CC, 73% CT, and 16% TT. The genotypic frequency distribution did not fit the Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) in either study group. The multiple logistic regression analysis showed a statistically significant difference for the rs1799998 polymorphism in the recessive model.

Conclusion:

the results suggest an association between the recessive model of C/C genotype of the rs1799998 polymorphism of the CYP11B2 gene and susceptibility to PE.

Key words:
Genetic Polymorphism; Preeclampsia; Cytochrome P-450

Introdução

A pré-eclâmpsia (PE) é definida como a presença de hipertensão após a vigésima semana de gestação, com a presença de proteinúria ou outros achados como trombocitopenia, insuficiência renal, elevação das transaminases, edema pulmonar, alterações neurológicas focais e visuais.^1,2 Afeta cerca de 5% das gestaçoes em todo o mundo, sendo a principal causa de partos prematuros no Brasil.³

Apesar da gravidade, sua patogênese ainda não é bem compreendida, sendo considerada uma doença multifatorial. Diabetes, gravidez múltipla, nuliparidade, obesidade, idade materna superior a 40 anos, doença renal, hipertensão arterial crônica, intervalo ≥ 10 anos desde a última gravidez e história pessoal ou familiar de PE são considerados fatores de risco para o desenvolvimento da doença.^4,5

Diversos genes já foram relacionados ao desenvolvimento de PE, dentre eles genes codificadores de proteínas do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), como o gene Cytochrome P450 Family 11 Subfamily B Member 2 (CYP11B2).^6-8 Este gene codifica um membro da super-família de enzimas do citocromo P450, que tem atividade 18-hidroxilase esteróide para sintetizar aldosterona. Haplótipos nesse gene já foram associados a uma rara forma mendeliana de hipertensão, o aldosteronismo remediado por glicocorticóides. Um dos polimorfismos mais estudados é um SNP rs1799998, localizado na região promotora do gene, posição-344, onde há a troca de citosina por timina^9,10 e sua associação com o desenvolvimento de PE têm sido estudada.¹¹ Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação entre o polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 e a suscetibilidade à PE em uma amostra da população brasileira.

Métodos

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (CEP/UFTM nº 1115-08) e todas as participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). O grupo de estudo foi composto por 61 mulheres maiores de 18 anos (idade média de 28.7 ± 8.3 anos), diagnosticadas com PE, seguindo os critérios estabelecidos pelo ACOG, 2013.² O grupo controle foi composto por 116 mulheres com idade superior a 18 anos de idade (idade média de 40.3 ± 11.8 anos) que não apresentaram alteração dos níveis pressóricos em suas gestações. Todas as participantes foram recrutadas no Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Clínicas da UFTM. Mulheres com histórico de doenças crônicas foram excluídas do estudo. As informações clínicas foram obtidas por entrevistas e revisão do prontuário médico.

O DNA genômico foi isolado a partir de 8 mL de sangue periférico coletado por venopunção, em tubos a vácuo e estéril (BD Vacutainer^®), com EDTA, pela técnica de fenol-clorofórmio descrita por Sambrook.¹² O polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase alelo-específica (PCR ASO) utilizando os seguintes primers: CYP11B2-344C: F-5`-TTAAAAGAATCCAAGGCT-3’; CYP11B2-344T: F-5’-TTAAAAGAATCCAAGGCC-3’ e CYP11B2 Ex1 as: R-5’-AGGTGCAGGTGCTCATAA -3’. A PCR foi realizada a partir de 200 nanogramas de DNA (1µL), 20 pmoles de cada primer (1µL), tampão 10X (3µL) (Invitrogen™, Carlsbad, California, EUA), 5U Taq DNA polymerase (0,2µL), 2mM dNTP (2µL), 50mM de MgCl2 (2µL) e água ultrapura para o volume final de 30 µL. A amplificação foi realizada no termociclador Mastercycler® (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) nas seguintes condições: desnaturação 94⁰C por 5 minutos e 35 ciclos de amplificação (94⁰C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos) e extensão final a 72⁰C por 10 minutos. O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2%, corado com GelRed^®, permitindo a visualização de uma banda de 558 pb. As imagens foram adquiridas pelo sistema de captura de imagens (L-PIX^®).

A avaliação o risco do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 contribuir para a PE, foi realizada a análise de regressão logística múltipla, por meio do programa SNPStat (disponível em: http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats_web). Nessa análise, foram utilizados os seguintes modelos de herança: codominante (homozigoto selvagem × heterozigoto × homozigoto polimórfico); dominante (homozigoto selvagem × heterozigoto + homozigoto polimórfico); recessivo (homozigoto polimórfico × homozigoto selvagem + heterozigoto). O programa SNPStats também foi utilizado para verificar se a frequência genotípica nos grupos estava em Equilíbrio de Hardy Weinberg (EHW). Os resultados foram apresentados em odds ratio (OR), com intervalo de confiança (IC95%). O poder estatístico apresentou 95,5% para a detecção de associação. Foi utilizado o software G POWER 3.1 para análises. A significância estatística foi definida com p<0,05.

Resultados

Foram analisadas 177 amostras, sendo 61 com PE e 116 controles. No grupo PE 1.64% (1/61) tinham genótipo CC, 91.80% (56/61) tinham o genótipo CT e 6.56% (4/61) apresentaram o genótipo TT. No grupo controle, as frequências genotípicas foram 11% (13/116); 73% (85/116) e 16% (18/116), e exibiram os genótipos CC, CT e TT, respectivamente. As frequências alélicas foram 0,48 e 0,52 para os alelos C e T, respectivamente, em ambos os grupos. A distribuição da frequência genotípica não estava em EHW em nenhum dos grupos estudados (PE: χ²=43.09, p<0,001; C: χ²=25.43, p<0,001).

A análise de regressão logística múltipla demonstrou diferença estatisticamente significativa para o polimorfismo rs1799998 no modelo recessivo (p=0.0075) (Tabela 1).

Tabela 1
Frequência genotípica do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2.

Modelo	Genótipo	PE (N= 61)		Controle (N= 116)		OR (IC95%)	p
		n	%	n	%
	T/T	4	6,6	18	15,5	1,00
Codominante	C/T	56	91,8	85	73,3	0,35 (0,11-1,09)	0,0041
	C/C	1	1,6	13	11,2	3,42 (0,33-35,29)
Dominante	T/T	4	6,6	18	15,5	1,00
	C/T-C/C	57	93,4	98	84,5	0,39 (0,13-1,23)	0,08
Recessivo	T/T-C/T	60	98,4	103	88,8	1,00
	C/C	1	1,6	13	11,2	8,83 (1,09-71,29)	0,0075

• OR=odds ratio; .

Discussão

A PE é uma condição exclusiva de gestações humanas e de grande relevância na prática médica.¹³ A presença de um componente genético ligado à sua etiologia já foi demonstrada em um estudo onde filhas de mulheres que desenvolveram PE em suas gestações tiveram duas vezes mais risco de desenvolver a doença, quando comparadas a gestantes sem histórico familiar. O mesmo estudo demonstrou que a PE grave estava mais fortemente relacionada à hereditariedade, fortalecendo os aspectos genéticos envolvidos tanto na suscetibilidade a PE, quanto na gravidade.⁴

O SRAA mantém a concentração plasmática de sódio, a pressão arterial e o volume extracelular. O desequilíbrio nesse sistema pode resultar em diversas patologias como a obesidade, diabetes e hipertensão.¹⁴

A contribuição do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 na regulação da pressão arterial já foi investigada em diferentes grupos populacionais, relacionada ou não com pré-eclâmpia. No entanto, os resultados destes estudos são controversos, dependendo da etnia e outras variáveis sóciodemográficas.^15-17

No presente trabalho, o modelo recessivo do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 foi associado a maior suscetibilidade à PE, sugerindo que o alelo C em homizigose confere risco para o desenvolvimento da doença. Entretanto Vasconcelos et al.¹⁸avaliaram 303 mulheres brasileiras, sendo 118 gestantes saudáveis, 115 com hipertensão arterial gestacional e 70 com PE e não observaram relação entre o rs1799998 do gene CYP11B2 e síndromes hipertensivas gestacionais.

Estudo realizado na África do Sul envolvendo 200 gestantes com PE de inicio precoce, 200 com PE de início tardio e 200 gestantes normotensas, infectadas ou não pelo vírus da imunodeficiência humana, investigou o polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 e não encontrou associação entre essa variante e a suscetibilidade a PE. Contudo, a frequência do alelo C foi maior no grupo de gestantes com PE tardia sem HIV do que no grupo controle.⁶

Ramírez-Salazar et al.¹⁹ avaliaram o papel do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 na pressão arterial e nos níveis de aldosterona circulantes em gestantes e observaram apenas uma tendência marginal para menores níveis pressóricos em mulheres portadoras do genótipo TT no grupo de gestantes normotensas e nenhuma associação entre os genótipos investigados e os níveis de aldosterona circulantes. No entanto, níveis elevados de aldosterona já foram associados com menor pressão arterial materna e variantes de ganho de função do gene CYP11B2 parecem reduzir o risco de desenvolver PE.²⁰

Um estudo realizado na Polônia com 59 gestantes diagnosticadas com PE e 109 controles também não encontrou associação entre o polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 e a PE, mas observou o genótipo TT mais frequente no grupo de estudo do que em gestantes normotensas.¹¹

Além de polimorfismos genéticos, alterações epigenéticas no gene CYP11B2 podem ser responsáveis por variações interindividuais e interétnicas na suscetibilidade às doenças.²¹ A expressão significativamente maior de miRNA-4421, um regulador do gene CYP11B2, já foi observada em placenta de mulheres com PE, associada a elevação da pressão arterial, presença de proteinúria e baixo peso ao nascimento dos fetos. A hiperexpressão de miRNA-4421 regula negativamente a expressão do gene CYP11B2, inibindo a proliferação trofoblástica e bloqueando o ciclo celular, sugerindo a presença de outros mecanismos regulatórios envolvidos na expressão gênica que contribuem com o desenvolvimento da PE, que devem ser considerados.²²

No presente trabalho, tanto o grupo controle quanto o grupo de estudo não estavam em EHW. O EHW depende de um número de suposições, incluindo herança mendeliana simples em organismos diploides, acasalamento ao acaso, população infinita e ausência de mutação, migração, ou seleção. Além da quebra dos pressupostos, a inobservância do EHW pode ser causada por erro de genotipagem, que pode originar resultados falsos positivos em estudos de associação genética e por amostragem não aleatória.^23,24

Em uma amostra verdadeiramente aleatória, cada indivíduo da população tem uma oportunidade igual de ser amostrado, fato praticamente impossível de ser alcançado em qualquer situação real. Esse viés é minimizado através dos indivíduos heterozigotos, já que estes são mais ou menos prováveis de serem amostrados do que poderia ocorrer por mero acaso.^25,26 No presente trabalho, aparentemente não ocorre esse viés amostral, tendo em vista a elevada frequência de heterozigotos em ambos os grupos. A inobservância do EHW em nossa amostra sugere que os pressupostos que mantém o EHW é que não estão sendo seguidos, influenciando o modo como os alelos são distribuídos ao longo das gerações. No entanto, não é possível identificar com precisão qual pressuposto está sendo violado.

Dentre as limitações do presente estudo está a nossa casuística. No entanto, ressaltamos que a amostra selecionada incluiu mulheres apenas com PE, sem outras comorbidades, garantindo a homogeneidade dos dados. Estudos futuros com uma casuísta maior, em colaboração com outros centros de pesquisa, fazem-se necessários para ampliar o conhecimento dos aspectos moleculares envolvidos na etiologia da PE. Além disso, estudos adicionais que realizem a investigação conjunta de outros polimorfismos do SRAA em um número maior de pacientes e a influência de possíveis fatores ambientais são necessários para validar nossos dados e determinar se o polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 pode, no futuro, ser utilizado como um marcador molecular capaz de rastrear precocemente a suscetibilidade a PE.

O presente trabalho sugere associação do genótipo recessivo C/C do polimorfismo rs1799998 do gene CYP11B2 com a suscetibilidade a PE.

Agradecimentos

Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Ago 2020
• Data do Fascículo
  Apr-Jun 2020

Histórico

• Recebido
  18 Set 2019
• Aceito
  28 Fev 2020