Expressão de neurotrofinas e de seus receptores no osteossarcoma primário.

RESUMO

Objetivo:

determinar a expressão de neurotrofinas e seus receptores tirosina quinases em pacientes com osteossarcoma (OS) e sua correlação com desfechos clínicos.

Métodos:

biópsias de tumores primários de pacientes com OS tratados em uma única instituição, consecutivamente, entre 2002 e 2015, foram analisados através de imuno-histoquímica para expressão de receptores de tirosina quinase A e B (TrKA e TrKB), fator de crescimento neural (NGF) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). De forma independente, dois patologistas classificaram os marcadores de imuno-histoquímica como negativos (negativos e focais fracos) ou positivos (moderado focal/difuso ou forte focal/difuso).

Resultados:

foram analisados dados de 19 pacientes (10 do sexo feminino e 9 do masculino) com mediana de idade de 12 anos (5 a 17,3 anos). Dos tumores, 83,3% estavam localizados em membros inferiores e 63,2% dos pacientes eram metastáticos ao diagnóstico. A sobrevida global em cinco anos foi de 55,3%. BDNF foi positivo em 16 pacientes (84%) e NGF em 14 pacientes (73%). TrKA e TrKB apresentaram coloração positiva em quatro (21,1%) e oito (42,1%) pacientes, respectivamente. A análise de sobrevida não demonstrou diferença significativa entre receptores TrK e neurotrofinas.

Conclusão:

amostras de OS primário expressam neurotrofinas e receptores TrK através de imuno-histoquímica. Estudos futuros podem auxiliar na identificação do papel das mesmas na patogênese do OS e determinar se há possível correlação prognóstica.

Descritores:
Osteossarcoma; Fatores de Crescimento Neural; Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo; Receptor trkA; Receptor trkB

ABSTRACT

Objective:

to determine the expression of neurotrophins and their tyrosine-kinase receptors in patients with osteosarcoma (OS) and their correlation with clinical outcomes.

Methods:

we applied immunohistochemistry to biopsy specimens of patients consecutively treated for primary OS at a single institution between 2002 and 2015, analyzing them for expression receptors of tyrosine kinase A and B (TrKA and TrKB), neural growth factor (NGF) and brain derived neurotrophic factor (BDNF). Independently, two pathologists classified the immunohistochemical markers as negative (negative or weak focal) or positive (moderate focal/diffuse or strong focal/diffuse).

Results:

we analyzed data from 19 patients (10 females and 9 males), with median age of 12 years (5 to 17.3). Tumors’ location were 83.3% in the lower limbs, and 63.2% of patients had metastases at diagnosis. Five-year overall survival was 55.3%. BDNF was positive in 16 patients (84%) and NGF in 14 (73%). TrKA and TrKB presented positive staining in four (21,1%) and eight (42,1%) patients, respectively. Survival analysis showed no significant difference between TrK receptors and neurotrophins.

Conclusion:

primary OS samples express neurotrophins and TrK receptors by immunohistochemistry. Future studies should explore their role in OS pathogenesis and determine their prognostic significance in larger cohorts.

Keywords:
Osteosarcoma; Nerve Growth Factors; Brain-Derived Neurotrophic Factor; Receptor, trkA; Receptor, trkB

INTRODUÇÃO

O osteossarcoma (OS) é um tumor ósseo maligno encontrado preferencialmente em indivíduos entre dez e 25 anos de idade. Ao diagnóstico, até 30% dos pacientes apresentam metástases, o que é considerado o principal fator relacionado ao prognóstico. O desenvolvimento de quimioterapia em altas doses aumentou a sobrevida consideravelmente. No entanto, desde o início dos anos 2000, esta opção terapêutica atingiu seu platô. De modo geral, não houve progresso significativo quanto ao tratamento do OS durante este período^1-6. Consequentemente, a procura por terapias baseadas no perfil molecular do tumor tem crescido consideravelmente⁷.

Neurotrofinas e seus receptores de tirosina quinase (Trk) são responsáveis pela modulação sináptica do sistema nervoso central. Estudos recentes têm demonstrado em amostras de sarcomas, a expressão do receptor TrkA e do seu ligante, fator de crescimento nervoso (NGF), que tem sido usado como um potencial marcador de prognóstico e tratamento. O aumento da expressão de NGF pode eventualmente estar associado com o estágio tumoral e risco de metástases em certas neoplasias. A sinalização de TrkA tem também sido descrita como promotora de atividade mitótica e antiapoptótica em osteoblastos de diferentes linhagens celulares^8-10.

O receptor de Trk B (TrkB) apresenta afinidade pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). O aumento da expressão do BDNF tem demonstrado estar intimamente relacionado à viabilidade tumoral, migração e invasão de tecidos saudáveis em diversas malignidades. Amostras diferentes de leiomiossarcoma uterino humano têm demonstrado expressão de BDNF e TrkB, e o aumento da expressão de TrkB e de seus ligantes nesta neoplasia mesenquimal tem sido associada com resistência a múltiplos agentes quimioterápicos. O aumento da expressão de TrkB e seus ligantes também tem sido associado a desfechos clínicos desfavoráveis em alguns tumores de origem neuroectodérmica^11-18.

OS é um tumor ósseo de origem mesenquimal que pode compartilhar algumas características comuns a outros sarcomas e tumores que metastatizam para os ossos. Estudos correlacionando OS com TrkA, TrkB e neurotrofinas (NGF e BDNF) são raros⁷ e ainda não incluem seres humanos. No presente estudo, analisamos a expressão de TrkA, TrkB e seus ligantes (NGF e BNDF) em amostras de tumores de pacientes com OS.

MÉTODOS

Pacientes e amostras histológicas

O estudo foi aprovado e registrado pelo Conselho de Revisão institucional do Hospital de Clínicas de Porto Alegre através do Escritório de Pesquisa e Pós-Graduação (IRB nº 00000921) com o número de referência 15-0499.

Os participantes elegíveis foram todos os pacientes com OS tratados em uma única instituição de acordo com as diretrizes do Grupo Brasileiro de Tratamento do Osteossarcoma (BOTG) e do Grupo Latino-Americano de Tratamento de Osteossarcoma (GLATO) em dois protocolos de tratamento consecutivos (BOTG V, GCBTO 2006) entre 2002 e 2015. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido previamente à sua inclusão nos protocolos BOTG V e GCBTO de 2006^3,19.

Pacientes sem tratamento prévio, metastáticos ou não, que tiveram suas biópsias analisadas no Departamento de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, foram incluídos no estudo. Detalhes dos regimes quimioterápicos foram publicados anteriormente^3,19. Os critérios de exclusão foram presença de material insuficiente para a realização dos testes imuno-histoquímicos e não ser incluído no protocolo de tratamento citado.

Todos os pacientes incluídos tiveram suas biópsias analisadas por imuno-histoquímica para os seguintes marcadores tumorais: BNDF, NGF, TrkA e TrkB. Informações médicas e cirúrgicas foram extraídas dos registros médicos dos pacientes. O grau de necrose tumoral foi graduado de acordo com a classificação Huvos-Ayala²⁰.

Imuno-histoquímica

Todas as amostras foram fixadas em parafina, cortadas em lâminas de 4µm de espessura, incubadas e re-hidratadas em álcool. A recuperação antigênica foi realizada em um forno de micro-ondas. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação das lâminas em peróxido de hidrogênio, e os sítios de ligação não específicos foram bloqueados com soro normal. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário, com uma diluição de 1:50, por 12 horas a 4ºC, depois foram imunomarcadas com o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako) e desenvolvidos com tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB Kit, Dako). Os anticorpos primários foram anti-NGF policlonal de coelho (sc-33603; Biotecnologia Santa Cruz), anti-BDNF (sc-20981, Biotecnologia Santa Cruz), TrkB policlonal de camundongo (sc-377218, Biotecnologia Santa Cruz) e anti-TrkA policlonal de cabra (sc-20539, Biotecnologia Santa Cruz).

As lâminas foram avaliadas independentemente por dois especialistas em patologia cirúrgica e imuno-histoquímica para a expressão de NGF, BDNF, TrkB e TrkA. Em caso de discordância entre os patologistas, as lâminas eram revisadas em conjunto até o consenso ser alcançado. A coloração imuno-histoquímica foi pontuada de acordo com a intensidade em uma escala de 0 a 3, onde 0 indica ausência de coloração (negativa); 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; e 3, coloração forte. Com relação à porcentagem de células imuno positivas, 1 indicava menos de 10% das células coradas (focal) e 2 indicava mais de 10% das células coradas (difusas). Os pacientes foram divididos em dois grupos: negativo e focal fraco (negativo); focal moderado/difuso e focal forte/difuso (positivo).

Estatística

As variáveis foram expressas em frequências absolutas e relativas, com exceção da idade, expressa em média e desvio padrão. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student para idade e pelo teste exato de Fisher para todas as outras variáveis. O teste log-rank foi utilizado para comparar as curvas de sobrevida global e sobrevida livre de doença, estimadas pelo método de Kaplan-Meier. Um P=0,05 foi considerado significativo. Os dados foram analisados no SPSS versão 18.0 e no Epi Info.

RESULTADOS

Características e marcadores dos pacientes

De um total de 28 pacientes tratados por OS nesse Serviço, foram excluídos quatro por amostra insuficiente ou indisponível para realização do estudo imuno-histoquímico e cinco que não entraram no protocolo do BOTG V e GCBTO 2006 (por escolha do oncologista, do paciente ou condições clínicas que impossibilitassem realizar o tratamento). Os pacientes que apresentaram má resposta à quimioterapia e necessitaram trocar a linha de tratamento durante o estudo não foram descartados. Analisamos, portanto, os dados de 19 pacientes (9 homens e 10 mulheres; com uma média de idade de 12 anos) de uma única instituição que foram incluídos nos estudos BOTG V e GCBTO 2006. As características da amostra foram salientadas na tabela 1.

Tabela 1
Características da amostra.

Variáveis	N=19
Idade (anos), média (±DP*) [mín.-máx.]	12,0 (±3,6) [5-17,3]
Sexo, N (%)
Masculino	9 (47,4)
Feminino	10 (52,6)
Metástase, N (%)
Não	12 (63,2)
Sim	7 (36,8)
Huvos-Ayala, N (%)
<90%	5/11 (45,5)
=90%	6/11 (54,5)
Recidiva, N (%)
Não	15 (78,9)
Sim	4 (21,1)

• Fonte: banco de dados do autor.
• ^*
  DP= desvio padrão.

A mediana de idade foi de 12 anos (variação de 5 a 17,3 anos) e o tempo mediano de acompanhamento foi de 2,7 anos (amplitude de variação de 0,6 a 14 anos). Quinze tumores (78,9%) localizavam-se nas extremidades inferiores, dois (10,5%) nas extremidades superiores, um (5,3%) na pelve e um (5,3%) não teve registro de localização. Doze (63,2%) pacientes eram metastáticos e sete (36,8%) tinham tumor localizado. O principal sítio metastático foi o pulmão (83%), seguido por ossos (17%). A resposta à quimioterapia foi ruim em cinco pacientes, boa em seis e não registrada em oito pacientes. Quatro (21,1%) pacientes apresentaram progressão de doença, sendo dois locais e duas recorrências sistêmicas. Dos 19 pacientes, 17 foram operados, dos quais nove (52,9%) submetidos a procedimentos que permitiram a conservação do membro e oito (47,1%) à amputação.

O BDNF foi considerado positivo em 16 (84,2%) pacientes, enquanto o NGF foi positivo em 14 (73,7%) (Figura 1). Por outro lado, TrkA e TrkB foram mais frequentemente negativos do que positivos, apresentando quatro (21,1%) e oito (42,1%) casos de coloração positiva, respectivamente, dentre os 19 pacientes (Figura 2). Houve diferença significativa entre os marcadores positivos e negativos da amostra (P<0,001) (Tabela 2).

Figura 1
Expressão de BDNF 100x (A) e NGF 400x (B) em células de osteossarcoma. Setas indicam células coradas.

Figura 2
Expressão de TrkA (A) e TrkB (B) em células de osteossarcoma (100x). Setas indicam células coradas.

Tabela 2
Dados sobre os marcadores imuno-histoquímicos.

Variáveis	N=19
BDNF*, N (%)
Negativo e focal fraco	3 (15,8)
Positivo, fraco e forte	16 (84,2)
NGF**, N (%)
Negativo e focal fraco	5 (26,3)
Positivo, fraco e forte	14 (73,7)
TrkA***, N (%)
Negativo e focal fraco	15 (78,9)
Positivo, fraco e forte	4 (21,1)
TrkB****, N (%)
Negativo e focal fraco	11 (57,9)
Positivo, fraco e forte	8 (42,1)

• Fonte: banco de dados do autor.
• ^*
  BDNF= fator neurotrófico derivado do cérebro;
• ^**
  NGF= fator de crescimento nervoso;
• ^***
  TrkA= receptor de tirosina quinase A;
• ^****
  TrkB= receptor de tirosina quinase B. Houve diferença significativa na positividade entre os marcadores (P<0,001).

Análise global

A sobrevida global em cinco anos para todos os 19 pacientes foi de 55,3%. A sobrevida acumulada em cinco anos foi de 40% para doença metastática e 60% para doença localizada (Relação de risco [RR]=2,04; P=0,39). Apesar de não significativa, a sobrevida acumulada em cinco anos foi de apenas 25% (hazard ratio [HR]=3,02) para pacientes com recidiva da doença, sendo de 72,5% para pacientes sem recidiva (P=0,17).

Análise imuno-histoquímica

A sobrevida cumulativa de cinco anos foi maior nos pacientes que apresentaram coloração positiva para BDNF e NGF do que para aqueles com coloração negativa (61,3 vs. 33,3%; 66,7 vs. 33,3, respectivamente). A RR para pacientes com coloração positiva para BDNF e NGF foi de 0,51 (intervalo de confiança de 95% [IC 95%]: 0,09-2,8), 0,69 (IC 95%: 0,13-3,81), respectivamente. No entanto, a sobrevida foi maior em pacientes com coloração negativa para TrkA e TrkB do que para aqueles com coloração positiva (58,2 versus 37,5%; 56,3 versus 54,7%, respectivamente). Não houve diferença significativa entre neurotrofina e receptores Trk na análise de sobrevivência. A RR para pacientes com coloração positiva para TrkA e TrkB foi de 3,48 (IC 95%: 0,62 a 19,70) e 1,84 (IC 95%: 0,37 a 9,20), respectivamente. Tanto o receptor TrkA quanto as características de recorrência foram submetidos à análise ajustada ao risco, pois o valor de P foi menor que 20%; entretanto, nenhum deles apresentou diferenças estatisticamente significantes associadas ao risco de morte (Tabela 3).

Tabela 3
Análise univariada.

Variáveis	Morte
	5 anos	RR* (IC** 95%)	P
Todos os pacientes (N)	55,3%	-	-
Idade (anos)		0,98 (0,74-1,30)	0,889
Sexo
Masculino	30,0%	1,45 (0,29-7,24)	0,648
Feminino	68,6%	1,00
Metástase
Não	66,0%	1,00
Sim	40,0%	2,04 (0,40-105)	0,392
Huvos-Ayala
<90%	40,0%	¥	0,427
=90%	75,0%	1,00
Recidiva
Não	72,2%	1,00
Sim	25,0%	3,02 (0,60-15,1)	0,178
BDNF***
Negativo e focal fraco	33,3%	1,00
Positivo, fraco e forte	61,3%	0,51 (0,09-2,80)	0,436
NGF****
Negativo e focal fraco	33,3%	1,00
Positivo, fraco e forte	66,7%	0,69 (0,13-3,81)	0,669
TrkA#
Negativo e focal fraco	58,2%	1,00
Positivo, fraco e forte	37,5%	3,48 (0,62-19,70)	0,158
TrkB##
Negativo e focal fraco	56,3%	1,00
Positivo, fraco e forte	54,7%	1,84 (0,37-9,20)	0,457

• Fonte: banco de dados do autor.
• ^*
  RR= relação de risco;
• ^**
  IC 95%= intervalo de confiança de 95%;
• ^***
  BDNF= fator neurotrófico derivado do cérebro;
• ^****
  NGF= fator de crescimento nervoso;
• ^#
  TrkA= receptor de tirosina quinase A;
• ^##
  TrkB= receptor de tirosina quinase B.
• ^¥
  O risco não pôde ser estimado devido ao pequeno tamanho da amostra.

Apesar da conhecida afinidade entre TrkA e NGF, os tumores coraram positivamente para ambos os marcadores apenas em três (15,7%) casos, e negativos para ambos os marcadores em quatro (21,1%). Com relação à ligação TrkB-BDNF, os tumores coraram positivamente para ambos os marcadores em oito (42,1%) casos e negativos para ambos os marcadores em três (15,7%). As combinações entre ligação positiva de TrkA-NGF, ligação negativa de TrkA-NGF, ligação positiva de TrkB-BDNF e ligação negativa de TrkB-BDNF não foram significativamente associadas à sobrevivência.

DISCUSSÃO

Este é o primeiro estudo a avaliar a expressão de neurotrofinas e seus receptores TrK em tumores primários de OS em humanos. Nós encontramos coloração positiva por imuno-histoquímica para BDNF, NGF, TrkA e TrkB em 19 amostras de tumores de pacientes com OS tratados em uma única instituição dentro dos ensaios BOTG V e GCBTO 2006 conduzidos por Petrilli et al.^3,19. Além disso, o grupo analisado apresentou características semelhantes às relatadas nos estudos BOTG V e GCBTO 2006, com alta prevalência de metástase e taxa de sobrevida de aproximadamente 55%¹⁹. As taxas de sobrevida em relação à presença de metástases, recidiva e sexo (masculino), seguiram o padrão e valores aproximados aos já constatados em outros estudos, apesar de não se mostrarem estatisticamente significativos (provavelmente devido ao pequeno tamanho da amostra)^3,19. Da mesma forma, a expressão dos marcadores avaliados por imuno-histoquímica não foi significativamente associada à sobrevida, presença de metástases, recorrência ou resposta à quimioterapia. Porém houve tendência de associação entre sobrevida, recidiva e presença de TrkA positivo (p<0.20).

Embora a ligação TrkA-NGF esteja frequentemente presente no reparo e proliferação do tecido ósseo, estudos que investigam essas proteínas em células de OS são raros. Um estudo em células caninas de OS demonstrou que o bloqueio in vitro da ligação TrkA-NGF pode induzir apoptose e inibir a proliferação celular. Além disso, os receptores TrkA foram identificados em tumores primários e metástases pulmonares⁷. Encontramos coloração positiva para TrkA em 21% dos casos e para o seu ligante NGF em 73%. Nosso estudo sugere uma menor sobrevida com expressão positiva de TrkA quando comparada a expressão negativa (37% versus 58% em cinco anos, respectivamente). Ao analisar as amostras de NGF, observou-se maior sobrevida em pacientes sem expressão de NGF (66% versus 33% aos cinco anos, respectivamente). Embora os resultados não sejam estatisticamente significativos, talvez devido ao tamanho da amostra, a ligação de TrkA-NGF pode ter um papel potencial no prognóstico de OS.

A sinalização do TrkB, através do seu ligante BDNF, tem sido relacionada ao prognóstico de certas malignidades. No neuroblastoma, a presença de BDNF e TrkB demonstrou maior resistência à quimioterapia e agressividade do tumor local. Da mesma forma, em casos de leiomiossarcoma uterino, ensaios in vitro indicam que a sinalização endógena da via TrkB está associada ao crescimento do tumor. Consequentemente, o TrkB e o BDNF foram investigados em maior detalhe devido à sua possível relevância como alvos para a terapia antineoplásica^17,18,21-28.

No presente estudo, TrkB e BDNF foram expressos em 42% e 84% das amostras de OS, respectivamente. Entre os pacientes positivos para TrkB, 80% tiveram uma baixa taxa de necrose e 25% apresentaram recidiva do tumor. Entre os pacientes negativos para TrkB, apenas 16% tiveram uma baixa taxa de necrose e 18% apresentaram recorrência do OS. Os pacientes positivos para TrkB tendem a mostrar menor sobrevida do que os pacientes com coloração negativa, embora a diferença não tenha sido estatisticamente significativa (P=0,44). Por outro lado, os pacientes com células que expressam BDNF apresentaram maior taxa de necrose, apresentaram menor frequência de metástases e maior sobrevida do que aqueles com coloração negativa (P=0,42). Mais estudos são necessários para investigar se o BDNF-TrkB desempenha um papel na patogênese do OS.

Os dados na literatura sobre a expressão dos receptores de neurotrofina e Trk são muito limitados e, até onde sabemos, somos os primeiros a relatar a expressão desses receptores em amostras de OS em humanos. Nossos achados mostraram uma prevalência considerável desses marcadores. Acreditamos que estudos com amostras maiores e estudos moleculares associados, bem como, a estratificação de pacientes por critérios de morbidade, possam contribuir para um melhor uso desses marcadores em pacientes com OS.

• Fonte de financiamento: Ricardo Gehrke Becker e Carlos Roberto Galia foram apoiados pelo Fundo de Pesquisa e Promoção de Eventos (FIPE/HCPA) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (outorga nº 15-0499).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Instituto do Câncer Infantil (ICI-RS), ao Fundo de Pesquisa e Promoção de Eventos (FIPE/HCPA) e ao Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) pelo apoio contínuo

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Maio 2019
• Data do Fascículo
  2019

Histórico

• Recebido
  21 Dez 2018
• Aceito
  05 Fev 2019