Avaliação da atividade dos inibidores de tripsina após digestão enzimática em grãos de soja tratados termicamente

Evaluation of trypsin inhibitors activity after enzymatic digestion in heat-treated soybean

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Avaliação da atividade dos inibidores de tripsina após digestão enzimática em grãos de soja tratados termicamente

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Evaluation of trypsin inhibitors activity after enzymatic digestion in heat-treated soybean

Maria Regina Barbieri de CARVALHO²

Peter Gaberz KIRSCHNIK²

Kelli Cristina PAIVA²

Felipe Shindy AIURA²

RESUMO

Este trabalho avalia a reativação dos inibidores de tripsina, após proteólise

in vitro

, de grãos de soja tratados termicamente. Para a inativação térmica dos inibidores, os grãos foram embebidos em água destilada (1:5 p/v) durante 12 horas e aquecidos em placas sob refluxo por 30 minutos. A reativação dos inibidores foi avaliada em comparação com a atividade das amostras cruas e aquecidas. A digestibilidade

in vitro

das proteínas variou de 47% ('OC-13') a 59% (Paraná), apresentando uma melhora, em média, de 32,6% com o aquecimento. A atividade dos inibidores de tripsina para os grãos crus variou de 122 a 206 UTI/mg de amostra, e os valores correlacionaram-se negativamente com a porcentagem de digestibilidade (r = -0,9177). Os inibidores tiveram suas atividades totalmente inativadas com o aquecimento dos grãos, os quais apresentaram porcentagem de recuperação, em média, de 40%. Com o aquecimento, a inativação dos inibidores provavelmente ocorre por complexação com os componentes do grão, o que leva à recuperação da atividade com o processo de digestão enzimática.

Termos de indexação:

inibidores de tripsina, inativação térmica, digestibilidade

in vitro, reativação, digestão enzimática, feijão de soja.

ABSTRACT

This work evaluates the trypsin inhibitors reactivation, after in vitro proteolysis, of heat-treated soybean. For the inhibitors thermal inactivation, soybeans were soaked in distilled water (1:5 p/v) during 12 hours and heated on reflux plates for 30 minutes. The inhibitors reactivation was evaluated in comparison with the activity of raw and heated samples. The in vitro digestibility of proteins ranged from 47% ( 'OC-13') to 59% ('Parana'), showing an average progress of 32.6% with the heating. The trypsin inhibitors activity ranged from 122 to 206 UTI/mg for the raw sample, and the values correlated negatively with the digestibility percentage (r = - 0.9177). The inhibitors had the activities totally inactivated with the heating of soybeans, which showed an average recovering percentage of 40%. With the heating, the inactivation of inhibitors probably takes place by complexing with the soybean components, which leads to the recovering of activity with the enzymatic digestion process.

Index terms:

trypsin inhibitors, thermal inactivation, in vitro digestibility, reactivation, soybeans.

INTRODUÇÃO

Nos grãos das leguminosas verifica-se a ocorrência natural dos inibidores de tripsina. A sua presença no trato intestinal inibe a ação da tripsina, que é responsável pela digestão das proteínas, levando a um aumento na produção enzimática pelo pâncreas e à hipertrofia deste órgão.

Na nutrição humana tais fatores antinutricionais têm pequena conseqüência, pois são termolábeis e geralmente são destruídos nas condições normais de preparo, doméstico ou industrial, dos alimentos(Ojimelukwe et al., 1995). No entanto, a utilização cada vez maior de alimentos naturais ou o uso de baixas temperaturas de cozimento podem expor a população aos seus efeitos deletérios.

Vários procedimentos têm sido adotados para o tratamento térmico dos grãos, implicando em inativação dos fatores antinutricionais e em mudanças na estrutura das proteínas, elevando a digestibilidade destes nutrientes.

O aquecimento térmico tem-se mostrado bastante eficiente para os grãos inteiros, mas com efeitos reduzidos ou mesmo ineficientes quando se trata da farinha ou de inibidores purificados(Rayas-Duarte et al.,1992; Carvalho & Sgarbieri, 1997). Ellenrieder et al.(1980) concluíram que componentes de alto peso molecular, separados dos extratos de soja por filtração em gel de Sephadex G-75, aceleraram a inativação térmica dos inibidores de tripsina. Segundo Tsukamoto et al.(1983), proteínas, polissacarídeos e ácidos nucléicos provenientes do feijão são fatores inativantes, pela interação com os inibidores, e, de acordo com Galeazzi & Sgarbieri (1988), a ação do calor leva os inibidores a se complexarem com os componentes do grão, não sendo, portanto, eliminados. Desta forma, ainda não existe consenso das condições de aquecimento mais adequadas para a inativação dos inibidores de tripsina. Assim, realizou-se este trabalho com o objetivo de avaliar a reativação desses inibidores após a proteólise in vitro de amostras de grãos de soja tratados termicamente.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados cinco cultivares de soja (Glycine max L. Merril): IAC-17, IAC-31, Paraná, OC-13 e CAC-1.

Os grãos de soja, após maceração em água destilada (1:5 p/v) durante 12 horas em temperatura ambiente, foram aquecidos em água fervente, sob refluxo, por 30 minutos. Após resfriamento rápido em banho de gelo, as amostras foram secas em estufa (60ºC) com circulação de ar e moídas até a granulometria de 70 mesh.

A extração dos inibidores foi realizada agitando-se, durante uma hora em temperatura ambiente, 0,5.g da amostra (previamente desengordurada a frio, com éter de petróleo) em 25 mL de HCl 0,025 M. A suspensão foi então filtrada em papel Whatman n.2 e o filtrado utilizado para determinação da atividade dos inibidores de tripsina. Esta atividade, em amostras cruas, tratadas termicamente e hidrolisadas, foi determinada utilizando-se o benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) como substrato para a tripsina, conforme procedimentos descritos por Kakade et al.(1969).

Alíquotas do extrato protéico 0,2 a 1,0mL foram pipetadas, em triplicatas, e o volume final foi ajustado para 1mL com tampão Tris 50 mM, pH 8,2, contendo CaCl₂ 20mM. A cada tubo, previamente acondicionado em banho-maria a 37ºC, adicionaram-se 1mL da solução de tripsina (0,08 mg/mL de HCl 0,001 N) e, após 10 minutos, 7,0mL de BAPNA (0,3mg/mL de tampão Tris 50 mM, pH 8,2, contendo CaCl₂ 20 mM), previamente aquecidos a 37ºC. A reação foi interrompida após 10 minutos pela adição de 1,0 mL de ácido acético 30%. A absorbância foi lida a 410 nm, contra os brancos aos quais adicionou-se o ácido acético antes do BAPNA. Uma unidade de tripsina (UT) foi definida arbitrariamente como o aumento de 0,01 unidade de absorbância a 410 nm por 10 mL do meio de reação. Os resultados foram expressos como unidades de tripsina inibida (UTI) por mg de amostra.

A digestibilidade in vitro foi determinada, basicamente, segundo o procedimento de Akeson & Stahman(1964), o qual utiliza um sistema enzimático composto por pepsina/pancreatina e ácido tricloroacético (TCA) para a precipitação da proteína não hidrolisada. No hidrolisado foram identificadas a quantidade de nitrogênio (método semi-microkjeldahl) e a atividade dos inibidores de tripsina.

A porcentagem de digestibilidade foi determinada correlacionando-se o nitrogênio total da amostra analisada com o nitrogênio contido no hidrolisado. A reativação dos inibidores de tripsina foi avaliada em comparação com a atividade das amostras cruas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A qualidade nutricional dos cultivares de soja em estudo foi avaliada através da digestibilidade in vitro das proteínas e os resultados obtidos (Tabela 1) evidenciam uma variação de 47% ('OC-13') a 59% ('Paraná'). Com o aquecimento dos grãos em água fervente, houve uma melhora na digestibilidade, ocorrendo um acréscimo, em média, de 32,6 ± 5,94%. Os cultivares OC-13 e CAC-1 apresentaram os menores valores, tanto para a amostra crua quanto para a aquecida; no entanto, obtiveram os maiores acréscimos após o tratamento térmico, ou seja, 38% e 39%, respectivamente. A melhora na digestibilidade com o tratamento térmico é atribuída às alterações estruturais das proteínas, aumentando a susceptibilidade à hidrólise enzimática (Deshpande & Damodaran, 1989; Carbonaro et al., 1992).

A atividade variou de 122 a 206 UTI/mg de amostra, respectivamente, para os cultivares Paraná e OC-13. Os inibidores de tripsina estão envolvidos com as funções fisiológicas das plantas, e a sua presença, ainda que em proporções variáveis, durante o ciclo vital das sementes, sugere sua importância ao vegetal (Tabela 2).

Os inibidores de tripsina, presentes nos cultivares de soja analisados, tiveram suas atividades totalmente inativadas com o aquecimento dos grãos em água fervente por 30 minutos. A sua estabilidade térmica é bastante variada, estando na dependência, entre outros fatores, da temperatura, duração e forma de aquecimentos, do tamanho das partículas, do conteúdo de umidade, da conformação estrutural do inibidor. Em alguns cultivares de feijão a atividade dos inibidores é destruída em menos de 10 minutos, com aquecimento a 120ºC, enquanto em outros ela pode ser detectada após 60 minutos de tratamento a 100ºC (Sgarbieri & Whitaker, 1982). A resistência oferecida pelos inibidores à inativação térmica pode ser devida à sua configuração compacta, como conseqüência do elevado número de ligações dissulfídicas nas suas moléculas (Sgarbieri & Whitaker, 1982).

A presença dos inibidores de tripsina nos grãos de leguminosas contribuem para a redução da digestibilidade de suas proteínas(Liener, 1979). Esta situação também foi verificada neste estudo, pois os valores de atividade dos inibidores correlacionaram-se negativamente (r = -0,9177) com a porcentagem de digestibilidade. Deste modo, o cultivar OC-13, que apresentou a maior atividade para os inibidores (206 UTI/mg de amostra), obteve o menor valor para digestibilidade in vitro (47%).

Os resultados obtidos para a atividade dos inibidores de tripsina nos grãos tratados termicamente e submetidos à digestão enzimática, bem como as porcentagens de recuperação da atividade em relação à amostra crua, estão apresentados, também, na Tabela 2. A atividade variou de 46 UTI/mg de amostra ('Paraná') a 95 UTI/mg de amostra ('OC-13'), havendo uma correlação positiva (r = 0,9656) com os valores de atividade dos grãos crus. A porcentagem de recuperação da atividade foi, em média, 40±3,74%, sendo o maior valor observado para o cultivar OC-13 (46%). Galeazzi & Sgarbieri (1988) também observaram a regeneração, em até 100% da atividade, após digestão enzimática de amostras de feijão autoclavadas.

O mecanismo de inativação pode ocorrer, portanto, pela complexação dos inibidores. Desse modo, com a ação do calor os inibidores se ligam com outros componentes do grão e se tornam inativos, indicando assim que essa inativação não deve ter ocorrido pela desnaturação térmica das moléculas dos inibidores. Ao serem submetidos à hidrólise enzimática, apresentam-se novamente ativos, mostrando que a ação do calor é benéfica na inativação dos inibidores, porém não os elimina completamente.

Os inibidores de tripsina apresentam características próprias em relação à sua hidrólise proteolítica. O inibidor do tipo Bowman-Birk não é hidrolisado pela papaína(Sgarbieri, 1979) nem pela pepsina(Tsukamoto et al., 1983), enquanto o tipo Kunitz tem esta propriedade em relação a estas duas substâncias (Vaintraub & Yattara, 1995).

Em um estudo sobre a ação das enzimas pepsina e papaína sobre a atividade do inibidor de Kunitz da soja, foi observado que a hidrólise degradava os inibidores em peptídeos pequenos, os quais retinham toda a atividade inibitória(Vaintraub & Yattara, 1995). Esse inibidor possui baixos teores de meia cistina e de grupos ácidos nas moléculas(Sgarbieri, 1979), conferindo-lhe a propriedade de sofrer alterações conformacionais e desnaturação parcial em meio ácido, de maneira a expor as ligações peptídicas à ação da pepsina.

Os inibidores do tipo Bowman-Birk, em virtude da predominância de grupos ácidos na molécula e do elevado teor de pontes dissulfeto, apresentam resistência à desnaturação, tanto térmica como pela ação da pepsina (Sgarbieri, 1979).

Como na soja estão presentes os dois tipos de inibidores, tem-se a possibilidade de estes alcançarem o trato gastrointestinal nas suas formas ativas, pois se apresentam resistentes à hidrólise enzimática, ou, quando fragmentados, retêm a atividade inibitória.

A regeneração da atividade de inibidor de tripsina em amostras tratadas termicamente e hidrolisadas in vitro pode ser conseqüência dos seguintes fatores: interação dos inibidores, por ação do calor, com outras substâncias próprias do grão, levando-os à inativação; e retenção da atividade inibitória pelos fragmentos obtidos com a degradação proteolítica.

CONCLUSÃO

O tratamento térmico inativou os inibidores de tripsina e elevou a digestibilidade in vitro da proteína. Esta inativação, com o aquecimento, parece ocorrer por complexação com os componentes do grão, o que leva à recuperação da atividade com o processo de digestão.

Recebido para publicação em 5 de setembro de 2000 e aceito em 7 de novembro de 2001.

²Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista. Rodovia Paulo Donato Castellani, 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. Correspondência para/Correspondence to: M.R.B. CARVALHO. E-mail: [e-mail]

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Pesquisa parcialmente financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP), Processo n. 98/06748-5.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Jan 2006
• Data do Fascículo
  Set 2002

Histórico

• Aceito
  07 Set 2001
• Recebido
  05 Set 2000