Prevalência de genótipos e de mutantes pré-core A-1896 do vírus da hepatite B e suas implicações na hepatite crônica, em uma população da Amazônia oriental

Prevalence of hepatitis B virus genotypes and the occurrence of precore mutation A-1896 and to correlate them with the clinical presentation of chronic hepatitis, in a population group of the eastern Amazon region

Prevalência de genótipos e de mutantes pré-core A-1896 do vírus da hepatite B e suas implicações na hepatite crônica, em uma população da Amazônia oriental

Prevalence of hepatitis B virus genotypes and the occurrence of precore mutation A-1896 and to correlate them with the clinical presentation of chronic hepatitis, in a population group of the eastern Amazon region

Simone Regina Souza da Silva Conde^I; Lizomar de Jesus Pereira Móia^I; Maria Silvia Brito Barbosa^I; Ivanete do Socorro Abarcado Amaral^I; Esther Castello Branco de Mello Miranda^I; Manoel do Carmo Pereira Soares^II; Elizabete Maria de Figueiredo Brito^II; Olglaíze do Socorro Costa Souza^II; Marialva Tereza de Araújo^III; Sâmia Demachki^III; João Renato Pinho Rebello^IV; Michele Gomes Soares Mesquita^IV; Denis Alberto Bertollini^IV; Ricardo Ishak^III

^IFundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, Belém, PA

^IIInstituto Evandro Chagas, Belém,PA

^IIIUniversidade Federal do Pará, Belém, PA

^IVInstituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

A infecção pelo virus da hepatite B apresenta amplo espectro de manifestações clínicas. Objetivando conhecer os genótipos do HBV mais prevalentes e determinar a ocorrência da mutação pré-core A-1896, em uma população da Amazônia oriental, correlacionando com o diagnóstico clínico, foram selecionados 51 pacientes portadores crônicos de HBsAg e HBV-DNA positivos e divididos em três grupos: grupo A (n=14, pacientes assintomáticos); grupo B (n=20, sintomáticos HBeAg positivos) e grupo C (n=17, sintomáticos HBeAg negativos), sendo usado o sequenciador automático ABI modelo 377 para identificação de genótipos e mutantes pré-core. Os resultados evidenciaram o genótipo A como o mais prevalente, 81,8%, 89,5% e 93,7%, nos grupos A, B e C, respectivamente. A mutação pré-core A-1896 foi encontrada em 11,5% (3/26), sendo todos assintomáticos. Concluiu-se que na população estudada o genótipo A foi o mais prevalente e houve baixa ocorrência do mutante pré-core A-1896, ambos não se constituindo fatores agravantes da doença hepática.

Palavras-chaves: Hepatite B crônica. Genótipos. Mutação pré-core. Epidemiologia. Clínica.

ABSTRACT

Hepatitis B virus (HBV) infection presents itself with a variety of clinical manifestations. The present work aims to describe the prevalence of HBV genotypes and the occurrence of precore mutation A-1896 in a population group of the Eastern Amazon region of Brazil and to correlate them with the clinical presentation of chronic HBV infection. 51 HBsAg carriers (HBV-DNA positive) were selected and divided into three groups: A (14 asymptomatic subjects), B (20 HBeAg positive symptomatic patients) and C (17 HBeAg negative symptomatic patients). Using an automa ed DNA sequencer ABI model 377 by sequencing for determined of genotypes and precore mutation. The results showed that the genotype A was the most commonly found (81,1%, 89,5% and 93,7% in groups A, B and C, respectively) and precore mutation A-1896 was described in 11,5% (3/26) of group A subjects. Genotype A of HBV was the most prevalent (89,1%) and low occurrence of precore mutation A-1896, both not associate with the worst outcome of the chronic infection of HBV.

Key-words: Chronic hepatitis B. Genotypes. Precore mutation. Epidemiology. Clinical.

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) apresenta distribuição universal, reconhecendo-se a existência de 350 milhões de portadores crônicos, sendo responsável por um milhão de óbitos por ano¹¹. O estudo da história natural da hepatite B evidenciou manifestações clínicas variáveis, na dependência de fatores relacionados ao hospedeiro e ao próprio vírus, sendo descritos quadros agudos assintomáticos ou oligossintomáticos ou ictéricos, possibilidade de hepatite fulminante, cronificação e desenvolvimento de portadores inativo, cirrose hepática e hepatocarcinoma^{5 18}.

O HBV é o protótipo da família Hepadnaviridae e em seu genoma composto por DNA de fita dupla incompleta se reconhece quatro principais regiões de transcrição (ORF): a) o gene P que codifica a polimerase viral; b) o gene pré-C/C (core) responsável pela codificação do HBcAg e de outra proteína não estrutural, o HBeAg; c) o gene pré-S1/S2 e S (superfície) codificante do HBsAg e das proteínas conhecidas como L e M, e d) o gene X que através de sua transcrição produz a proteína X ¹². O seqüenciamento da região S do genoma do HBV revelou a presença de sete genótipos do HBV, de A a G^{33 34 41}, os quais possuem uma distribuição geográfica peculiar.

A presença do HBeAg no soro é epidemiologicamente relacionado com a replicatibilidade e contagiosidade do vírus. Porém, em estudos pioneiros Carman et al⁷ e Okamoto et al³⁵ identificaram mutantes que não sintetizavam o HBeAg, não interferindo, porém, no ciclo replicativo do mesmo, surgindo o termo mutação pré-core. A principal causa desta mutação deve-se à substituição da G (guanina) pela A (adenina) na posição do nucleotídio (nt) 1896, e mais raramente no nt 1899, modificando o códon TGG específico para o aminoácido triptofano para um códon de parada precoce TAG, principalmente nos genótipos que possuem a timina (T) no nt 1854, portanto no B, C, D e F, e raro no A genótipo^{9 14}.

Vários estudos tentam correlacionar os diferentes genótipos com a maior ou menor gravidade dos quadros clínicos resultantes da infecção crônica pelo HBV^{20 43 44 45}, assim como a presença da mutação pré-core. Nesta última situação, os resultados ainda são mais controversos, visto que a prevalência destes mutantes em hepatopatas crônicos é elevada nas regiões do Mediterrâneo^{4 14 38}, no Oriente Médio²³ e no leste asiático^{13 24 28 32}, porém baixa ao norte europeu, EUA e Brasil^{8 29 39}; ainda são identificados mutantes em portadores inativos do vírus^{15 32 36}.

Sendo a região Amazônica considerada uma área de alta prevalência do HBV e a falta de estudos sobre a prevalência de genótipos e mutantes pré-core nesta população, o presente trabalho objetiva conhecer os genótipos mais prevalentes do HBV e a descrição da prevalência de mutação pré-core A_1896 entre os pacientes portadores de hepatite crônica B, em uma população da Amazônia oriental, assim como correlacionar com as características epidemiológicas, clínicas e virológicas.

MATERIAL E MÉTODOS

População de estudo. Selecionou-se 51 pacientes portadores crônicos do HBsAg (HBV-DNA positivo) atendidos no Programa de Hepatopatias Crônicas do Hospital da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, localizado na cidade de Belém. Excluíram-se do estudo pacientes com infecção simultânea pelo vírus da hepatite C (HCV), delta (HDV) ou vírus da imunodeficiência humana (HIV), ou os que utilizaram qualquer tipo de tratamento antiviral prévio. O total de pacientes selecionados foi divido em três grupos: grupo A formado por pacientes assintomáticos HBeAg positivos e negativos (n: 14); grupo B, por aqueles pacientes sintomáticos HBeAg positivos (n: 20); e grupo C, por pacientes sintomáticos HBeAg negativos e anti-HBe positivos (n: 17). Estes foram submetidos a exames clínicos, laboratoriais, sorológicos, ultra-sonográficos, endoscópicos e, quando indicado, a biópsias hepáticas para estadiamento. Após a identificação destes grupos, procedeu-se a genotipagem de todos os espécimes e o seqüenciamento da região pré-core nos portadores do HBV com HBeAg negativo, tanto assintomáticos quanto sintomáticos.

Testes sorológicos e de pesquisa do HBV-DNA. Para os exames sorológicos das hepatites B, C e D foram utilizados EIE, tipo ELISA, com kits comerciais. Todos os soros foram examinados para a presença de HBsAg (Organon Teknika®, Holanda), anti-HBc (Organon Teknika®, Holanda), anti-HBs (Abbott®, EUA) e anti-HCV (Ortho Clinical Diagnostics®, Alemanha). Nas amostras positivas para o HBsAg foi efetuada a pesquisa do HBeAg, anti-HBe, anti-HBc IgM a anti-HD (Organon Teknika®, Holanda).

O HBV-DNA foi pesquisado do modo qualitativo e quantitativo utilizando-se kits comerciais do laboratório Roche® (AMPLICOR HBV MONITOR^TM), que utiliza a PCR para a amplificação e hibridização do DNA.

Genotipagem do HBV. Para detecção da região S do HBV-DNA no soro por PCR, foi empregada a técnica de extração desenvolvida por Kaneko et al¹⁹ e por Kwok & Higuchi²⁵ com poucas modificações. A extração do DNA viral se procedeu pelo NaOH e os primers utilizados nas PCR foram o FHBS1 (GAG TCT AGA CTC GTG GTG GAC TTC), o RHBS1, para a primeira reação e o FHBS2 (CGT GGT GGA CTT CTC TCA ATT TTC) e RHBS2 (GCC ARG AGA AAC GGR CTG AGG CCC) para a segunda.

A análise do produto de PCR se procedeu com a aplicação em gel de agarose, submetido à corrente elétrica de 150 V por 35 minutos e revelada a reação com a utilização de uma fonte de ultravioleta (UV). O produto foi fotografado com máquina tipo Polaroid. As amostras foram consideradas positivas quando apresentaram uma banda de 450pb, quando comparadas ao padrão. As amostras positivas foram seqüenciadas por PCR, derivada da metodologia de Sanger et al³⁷ utilizando-se didesoxinucleotídeos (dNTPs) contendo marcadores fluorescentes, conforme o kit ABI Prism^R BigDye^TM Terminator (PE Applied Biosystems).

A análise dos genótipos foi realizada por meio da comparação das seqüências obtidas com as já conhecidas dos diferentes genótipos de HBV. Para esta análise foram utilizados os programas EditSeq e Megalign do pacote DNAstar (Lasergene Inc, USA).

Seqüenciamento da região Pré-core do HBV. O seqüenciamento da região pré-core do HBV foi efetuado nas amostras HBeAg negativas dos grupos A e C. A extração do DNA viral se procedeu com a utilização da solução de isotiocianato de guanidina (solução GT) e os primers para a primeira e segunda PCR foram o EP1.1 (TCA TGG AGA CCA CCG TGA AC) e EP1.2 (GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA) e o EP2.1 (CAT AAG AGG ACT CTT GGA CT) e EP2.2 (GGC AAA AAA GAG AGT AAC TC), respectivamente. Após a colocação do produto em gel de agarose a 1% e submetido a corrente elétrica, revelou-se a reação com a utilização de uma fonte de ultravioleta (UV), fotografando com máquina tipo Polaroid, sendo consideradas positivas quando apresentaram uma banda de 300pb.

Os produtos das reações de amplificação foram aplicados em gel de policrilamida e submetidos à eletroforese no sequenciador automático, modelo ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer). As seqüências da região pré-core foram alinhadas a uma seqüência conhecida da mesma região, livre de mutações, utilizando-se para isto os programas EditSeq e Megalign do pacote DNAstar (Lasergene Inc, USA). Posteriormente, analisou-se os pontos das seqüências que foram marcados por serem diferentes da seqüência consenso, visando o encontro de mutações A-1896 e A-1899, além de outras citadas em publicações científicas.

Para a análise estatística foram utilizados os programas EPIINFO 6.04 b e Biostat 2.0³. Utilizaram-se testes estatísticos paramétricos da ANOVA de um e de dois critérios e os não-paramétricos de Kruskal-Wallis e de Kolmogorov-Smirnov, nos casos de análise de variância de mais de duas amostras. Para duas amostras independentes, os testes não paramétricos empregados foram o qui-quadrado e o teste exato de Fisher. Estabeleceu-se em 0,05 (5%) o nível de rejeição da hipótese de nulidade (valor de p < 0,05).

O presente trabalho foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, e os pacientes selecionados foram conscientizados sobre os objetivos do estudo e assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, permitindo assim a realização da investigação.

RESULTADOS

Os três grupos formados se caracterizaram por um predomínio total do sexo masculino, cada um dos quais apresentando apenas um paciente do sexo feminino. A média das idades foram de 32,4 + 12,3 anos (variação de 10-60 anos) para o grupo A, 41,6 + 26,3 anos (variação de 1-84 anos) para o B e 52,3 + 15,3 anos (variação de 6-72 anos) para o C. A diferença destas médias se mostrou estatisticamente significante entre os grupos A e C, com valor de p igual a 0,028.

As complicações clínicas em decorrência da doença hepática, ocorridas em 7/20 (35%) pacientes do grupo B e em 9/17 (53%) do grupo C, e a letalidade de 15% (3/20) dos pacientes do grupo B e 35,2% (6/17) do C não apresentaram diferenças estatísticas entre si.

Nas dosagens de AST, ALT, bilirrubina total, FA, GGT e globulinas, o grupo A apresentou menores valores do que no grupo B (p: 0,005) e C (p: 0,001). As médias das dosagens de albumina e atividade protrombínica foram menores nos grupos B e C em relação ao A (Tabela 1) e a diferença mostrou-se estatisticamente significante (p: 0,001 e p: 0,007, respectivamente).

Com relação às cargas virais, o grupo B apresentou níveis superiores às do A e C, com valor de p igual a 0,004 (Figura 1). Ressalta-se que o único indivíduo HBeAg positivo do grupo A possuía carga viral de 7,332 (log₁₀), muito acima dos demais membros deste mesmo grupo.

O diagnóstico final dos pacientes do grupo B e C encontram-se expostos na Tabela 2. Não foi possível demonstrar diferença estatística entre eles.

Genotipagem do HBV. Das 51 amostras de soro de pacientes processadas para genotipagem, conseguiu-se êxito em 11 (79%) do grupo A, 19 (95%) do grupo B e 17 (94%) do grupo C. As amostras que não se conseguiu efetuar a extração do ácido nucléico apresentaram carga viral baixa, inferior a 2.500 cópias/mL (Figura 2).

A genotipagem das 46 amostras positivas revelou a presença do genótipo A na grande maioria dos pacientes, 89,1% (41/46), seguido dos genótipos F em 8,7% (4/46) e D em 2,2% (1/46). A distribuição dos genótipos encontrados nos grupos estudados está resumida na Tabela 3.

Quanto à procedência destes pacientes (Figura 3), observou-se que a maior parte dos pacientes com genótipo A, 68,3% (28/41), procediam da região metropolitana de Belém e da região sudeste do Pará. O paciente com genótipo D procedeu de Belém, assim como dois outros com genótipo F. Deste último genótipo, um terceiro paciente era oriundo de Cametá (Baixo Tocantins) e o quarto, de Vizeu, nordeste do Estado do Pará.

As características demográficas dos pacientes (Tabela 4) não mostraram diferenças estatísticas, quando distribuídas de acordo com o genótipo encontrado.

A presença do HBeAg entre os indivíduos portadores do genótipo A foi de 43,9% (18/41), taxa semelhante a encontrada nos do genótipo não A.

A média da carga viral (em log₁₀) das 41 amostras com genótipo A, 7.008 cópias/mL, e a dos cinco pacientes com genótipos não A, 6.716 cópias/mL não apresentaram diferença estatística significante (Figura 4).

O caso de genótipo D encontrava-se na condição de assintomático. Nos quatro indivíduos com genótipo F, cada grupo de diagnóstico, assintomático, hepatite crônica, cirrose hepática e hepatocarcinoma, recebeu um representante. Os representantes do genótipo A eram em 22% (9/41) assintomáticos, em 26,8% (11/41) portadores de hepatite crônica, 36,6% (15/41) portadores de cirrose hepática e, finalmente, 14,6% (6/41) portadores de CHC (Tabela 5).

Mutação pré-core A-1896/ A-1899 do HBV. No total de amostras testadas, 11,5% (3/26) mostraram-se positivas para as mutações pesquisadas (Tabela 6). No grupo A (Figura 5), a presença de mutação pré-core foi encontrada em três (25%) amostras, sendo uma do tipo A-1896, uma do tipo A-1899 e uma do tipo combinado A-1896 com A-1899. No grupo C, não foi possível evidenciar tal mutação. Ainda assim, o resultado não mostrou diferença estatística entre os dois grupos analisados (valor de p igual a 1).

A presença do mutante pré-core foi observada em dois casos de genótipo A, nos quais também a mutação T-1858 estava presente, e em um caso de genótipo D. Contudo, outras mutações também foram encontradas, entre as quais destacam-se a T-1762 e a A-1764 (Tabela 7).

Os três indivíduos portadores do HBV mutante pré-core A-1896/ A-1899 eram do sexo masculino, procedentes da região metropolitana de Belém e com idades de 22, 34 e 29 anos e assintomáticos. As médias das cargas virais (em log₁₀) dos três indivíduos 4,735 cópias/mL, e a do restante dos 23 sem mutação pré-core A-1896/A-1899, 4,922 cópias/mL, não apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre si, com p: 0,399.

DISCUSSÃO

Na caracterização dos grupos estudados, observou-se um predomínio do sexo masculino e da faixa etária adulta nos três. Contudo, o grupo A possuía média de idade inferior aos demais, com significância estatística em relação ao grupo C. Este dado se assemelha com os trabalhos de Mangia et al²⁹ e Niitsuma et al³², em que os pacientes portadores assintomáticos do HBV eram mais jovens em relação aos doentes crônicos HBeAg negativos. O grupo B, composto de pacientes HBeAg positivos, foi o que apresentou a maior média de carga viral (em log₁₀), com valores significativamente maiores do que os encontrados nos grupos A e C (p: 0,004). Chu et al¹⁰ ao analisarem 79 pacientes com hepatite crônica B, todos comprovados histologicamente, encontraram níveis séricos do HBV-DNA por dot-blot de 944 pg/mL nos HBeAg positivos, sendo maior do que os 58pg/mL encontrados nos anti-HBe positivos. A média de idade e a carga viral se mostraram inversamente proporcionais no grupo B e foi menor do que nos pacientes do grupo C.

A genotipagem das amostras do HBV mostrou que 89,1% pertenciam ao genótipo A, 8,7% ao F e 2,2% ao D. Os estudos de genotipagem descrevem uma ocorrência variada de genótipos de acordo com a situação geográfica examinada.

O genótipo A é o mais prevalente no norte europeu, na África (seguido em menor proporção pelo D e E), EUA e em descrições de prevalência de populações urbanas com alto fluxo migratório de países da América do Sul^{27 30 33 34 39}.

A genotipagem das amostras provenientes de cinco países da América Central (Nicarágua, Costa Rica, Guatemala, El Salvador e Honduras) detectou a presença do genótipo F em 79% das amostras, além de 14% do genótipo A, 6% do D e 1% do C 2, sugerindo ser o F o genótipo nativo da região². Moraes et al³¹ demonstrando uma técnica de PCR específica para genotipar amostras de HBV, identificou em 54 espécimes provenientes de Manaus (AM) e Macapá (AP) 69% de genótipo A, 31% de D e 7,4% de F, e sugeriu que em outros estudos houve uma superestimação do genótipo F. Em trabalho recente, Bertolini et al⁶ demonstraram em três comunidades indígenas da região Amazônica o predomínio total do genótipo F e em uma quarta 100% dos pesquisados pertenciam ao genótipo A, sendo que esta comunidade mantinha um alto grau de aculturação e contato com populações tri-híbridas.

O genótipo D é o predominante no sul da Europa e parte do Oriente Médio. Ao norte e sudoeste do continente asiático se destacam os genótipos B e C^{27 33 34}. Trabalhos realizados com aborígenes australianos evidenciaram a presença do genótipo C¹.

Ao descreverem o genótipo G, em pacientes norte-americanos e franceses cronicamente infectados pelo HBV, Stuyver et al⁴¹ observaram que o genótipo A também era o mais prevalente, com 54% do total de casos, seguido do D (19%), C (12%), G (11%), B (3%) e E (1%). Neste estudo, o genótipo F não foi encontrado.

Como se pode observar, a extensão geográfica do Brasil, as diferenças regionais de cultura, diferenças de poder aquisitivo, composição étnica, padrões de conforto, educação, dentre outros, conseguem influenciar na grande variabilidade não só da prevalência do HBV⁴⁰, como também de seus genótipos de acordo com a classificação atual no seqüenciamento da região S^{6 31 39}.

Comunidades epidemiologicamente fechadas conseguem ter introduzido um genótipo e mantê-lo como o único circulante, enquanto que aqueles grupos em que acontece a circulação de vários genótipos, as freqüências de ocorrência são variadas e não existe, aparentemente, algum fator biológico do vírus que favoreça o predomínio de um ou outro genótipo. A maior influência, provavelmente, se dá pelos fatores associados à transmissão do HBV.

No presente trabalho, não foi possível mostrar a influência de possíveis variações genotípicas com as manifestações clínicas e a gravidade da doença hepática crônica pelo HBV, como já proposto em outros estudos^{20 21 43 45}.

A procura da mutação pré-core A-1896 e/ou A-1899 nos pacientes HBeAg negativos, grupos A e C, mostrou que nos 12 seqüenciamentos dos pacientes assintomáticos, três (25%) possuíam esta mutação, enquanto que em 14 pacientes do grupo sintomático HBeAg negativo, em nenhum foi possível mostrar a mutação. A baixa prevalência desta mutação, 11,5% (3/26) já era esperada devido a alta prevalência do genótipo A nos grupos estudados.

A mutação pré-core A-1896 em pacientes assintomáticos HBeAg negativos foi descrita por diversos autores^{15 23 29 32} em uma proporção extremamente variável, de 17, 6% a 57,2%, de acordo com a região estudada. Nos locais onde predominam os genótipos B, D ou C, nos pacientes hepatopatas crônicos HBeAg negativos, a mutação pré-core é encontrada em 35% a 100% dos casos^{14 16 23 38 46}, enquanto nos países de maior prevalência do genótipo A, a mutação A-1896 se situa entre 28,5% a 45,2%, encontrada principalmente em pacientes com genótipos diferentes do A, nestas populações^{29 39 45}.

A presença da mutação mesmo em uma freqüência baixa era esperada no grupo C. Por outro lado, a diferença entre os grupos A e C não foi estatisticamente significante, denotando não ser este um fator influenciador na evolução clínica dos pacientes em questão.

No presente trabalho, outras mutações nas regiões promotoras do core e pré-core também foram identificadas. Merecem destaque as mutações T-1762 e A-1764, as quais foram encontradas em 76,9% dos casos, incluindo os três grupos. A presença dessas mutações foi descrita por Takahashi et al^{42 43} e Karasawa et al²², os quais associaram a combinação das mesmas com a mutação A-1896 e descreveram a possibilidade das mutações influenciarem na evolução clínica dos pacientes infectados pelo HBV.

Estudos futuros com casuísticas maiores deverão ser efetuados para se buscar uma análise mais abrangente sobre a influência dos genótipos e mutação pré-core do HBV na evolução clínica dos pacientes cronicamente infectados, na Amazônia oriental, assim como o significado da presença das mutações promotora do core, T-1762 e A-1764.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Set 2014
• Data do Fascículo
  2004