PREPARAÇÕES DE Saccharomyces cerevisiae ELICITORAS DE FITOALEXINAS EM MESOCÓTILOS DE SORGO

PREPARAÇÕES DE Saccharomyces cerevisiae ELICITORAS DE FITOALEXINAS EM MESOCÓTILOS DE SORGO¹

N.A. WULFF^2,4; S.F. PASCHOLATI^2,3

²Depto. de Fitopatologia-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418-900, Piracicaba, SP.

³Bolsista da CAPES.

⁴Bolsista do CNPq.

RESUMO: A levedura Saccharomyces cerevisiae estimula o acúmulo de fitoalexinas e tem potencial para ser utilizada como agente de controle alternativo no tratamento de doenças fúngicas em sorgo. São descritos aqui os procedimentos iniciais para a purificação de elicitores de fitoalexinas em sorgo, os quais são extraídos das células da levedura S. cerevisiae por autoclavagem, indicando serem termoestáveis. Após precipitacão com etanol, em concentrações finais de 50 e 80%, as moléculas elicitoras permanecem em solução. O acúmulo de fitoalexinas nos mesocótilos é mais elevado quanto maiores os teores de proteínas das amostras elicitoras.

Descritores: elicitor, levedura, resposta de defesa

PREPARATIONS OF Saccharomyces cerevisiae THAT ELICIT PHYTOALEXINS IN SORGHUM MESOCOTYLS

ABSTRACT: The yeast Saccharomyces cerevisiae stimulates phytoalexin accumulation and is a potential agent for biological control of fungal diseases in sorghum. The present investigation establishes the initial steps to purify elicitor molecules of phytoalexins in sorghum from S. cerevisiae. These molecules are extracted using heat and remain in solution after ethanol precipitation. They are active even after autoclaving, thus showing to be thermostable. A correlation between phytoalexin accumulation in mesocotyls and increasing amounts of protein on elicitor samples was observed.

Key Words: elicitor, yeast, defense response

INTRODUÇÃO

As fitoalexinas são definidas como compostos antimicrobianos de baixo peso molecular, sintetizadas e acumuladas nas plantas após o contato com microrganismos (Paxton, 1981) e seu papel na resistência a patógenos é amplamente estudado (Kuc, 1995; Smith, 1996). Em sorgo são produzidos compostos fenólicos em resposta a inoculação com fungos patogênicos ou não, sendo que entre estes, foram identificadas quatro fitoalexinas derivadas de antocianidinas (luteolinidina, apigeninidina, éster do ácido cafeico de arabinosil 5-o-apigeninidina e 5-metoxi-luteolinidina) (Hipskind et al., 1990; Lo et al., 1996; Nicholson et al., 1987).

A síntese e o acúmulo de fitoalexinas, assim como a ativação de outras respostas de defesa, ocorre em resposta ao reconhecimento de moléculas elicitoras (Hahn, 1996; Smith, 1996). Elicitores são moléculas que estimulam uma de qualquer resposta de defesa nas plantas, apresentam natureza química variada incluindo carboidratos, glicoproteínas, proteínas, ácidos graxos e componentes da parede celular vegetal (Hahn, 1996; Guzzo & Moraes, 1997; Smith, 1996). Por sua vez, extrato comercial de levedura tem servido como fonte para a purificação e caracterização de elicitores glicoproteico (Basse & Boller, 1992) e oligossacarídico (Hahn & Albersheim, 1978) ou tem sido ainda utilizado como preparação elicitora bruta (Lyon et al., 1995).

As leveduras podem ser utilizadas no controle de doenças como medida alternativa (Williamson & Fokkema, 1985) e a proteção contra patógenos tem sido observada mediante o emprego de Saccharomyces cerevisiae em plantas de milho, sorgo, café, eucalipto e maracujá (Piccinin, 1995; Roveratti, 1989; Silva & Pascholati, 1992; Stangarlin & Pascholati, 1994). Nestes exemplos estudou-se somente o modo de ação da levedura sobre os patógenos, não sendo abordados os mecanismos de resistência ativados nas plantas.

A aplicação de S. cerevisiae em mesocótilos de sorgo estimula a produção de fitoalexinas (Freitas et al., 1993; Roncatto & Pascholati, 1993) e a aplicação em folhas confere proteção contra patógenos fúngicos (Piccinin, 1995). Desta forma, partindo-se de suspensão de células de S. cerevisiae, objetivou-se purificar e estudar os componentes da levedura que potencialmente tenham atividade elicitora de fitoalexinas em sorgo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material Vegetal: Sementes de sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench] cv. Brandes foram desinfectadas com etanol 50% por 2 min, hipoclororito de sódio 1% por 15 min, lavadas em água destilada e embebidas em água por um período de 6 h. Posteriormente, foram enroladas entre folhas de papel de germinação umedecidas e incubadas no escuro por um período de 72-90 h a 28±2°C. Após este período no escuro, as plântulas foram mantidas por 4 h na luz visando parar a elongação dos mesocótilos. Obtiveram-se desta maneira, plântulas com mesocótilos uniformemente elongados e adequados para o ensaio de produção de fitoalexinas (Yamaoka et al., 1990).

Bioensaio para Produção de Fitoalexinas em Mesocótilos de Sorgo: A capacidade de causar o acúmulo de fitoalexinas deoxiantocianidinas em sorgo (atividade elicitora), pelas preparações obtidas a partir de Saccharomyces cerevisiae Meyen, foi feita com base na determinação espectrofotométrica do acúmulo destes compostos em mesocótilos estiolados de sorgo (Nicholson et al., 1987; Roncatto & Pascholati, 1993; Yamaoka et al., 1990). Cinco mesocótilos (4-5 cm) foram excisados 0,5 cm acima do nó escutelar e colocados em tubos de ensaio (1,2 x 10,0 cm) contendo 3 mL da preparação elicitora. Estes tubos foram mantidos em câmara úmida, a 25°C sob luz fluorescente por um período de 60 h. Mesocótilos controle foram incubados em água destilada esterilizada.

Para a avaliação do acúmulo de fitoalexinas, os mesocótilos foram retirados dos tubos de ensaio e secos, sendo os 5 mm basais de cada mesocótilo excisados e descartados. A porção superior (2,0 cm) foi excisada, pesada e colocada em metanol 80% acidificado com HCl a 0,1% (v/v) (Nicholson et al., 1987). Para a extração do complexo de pigmentos foi mantida a proporção 1:50 entre massa de tecido vegetal fresco (g) e volume de metanol (mL). Os mesocótilos cortados foram mantidos a 4°C no metanol por um período de 96 h, para permitir a completa extração do complexo de pigmentos, o qual foi avaliado a 480 nm (Nicholson et al., 1987), sendo os dados expressos em A 480 nm por grama de tecido fresco (A _{480 nm} gtf ^-1).

Determinação da Concentração de Proteínas e Carboidratos: Para a quantificação do teor de proteína das preparações foi utilizado o método de Bradford (1976), tendo albumina de soro bovino como padrão. Os carboidratos foram quantificados pelo método de Lever (1972), tendo glicose como padrão.

Preparações Elicitoras: A levedura de panificação (S. cerevisiae), produto comercial Fermento Biológico Fresco Fleischmann®, foi utilizado como fonte de células. Inicialmente, foi utilizado procedimento semelhante ao descrito por Roveratti (1989), no qual partindo-se de uma suspensão de células de levedura (20 mg mL^-1) foram preparados filtrados (membranas tipo Millipore com poros de 0,45 mm e 0,2 mm de diâmetro) das suspensões de células, autoclavadas ou não. Este experimento teve como objetivo avaliar a necessidade ou não das células para o acúmulo de fitoalexinas, bem como testar a estabilidade a autoclavagem.

Em outro ensaio, foram utilizados o filtrado da suspensão de células e o filtrado da suspensão de células autoclavadas, partindo-se da concentração de 200 mg mL^-1, bem como do sobrenadante de precipitação etanólica a 50%. A partir destas preparações foram feitas diluições, produzindo amostras com a concentração final de proteínas e carboidratos variando de 0 a 470 mg mL^-1.

Precipitação Etanólica: A precipitação etanólica a 50% foi efetuada com o filtrado de células de levedura autoclavadas (25 min a 121°C) na concentração de 250 mg mL^-1. Por sua vez, a precipitação etanólica fracionada foi efetuada com o filtrado da suspensão de células autoclavadas, na concentração de 400 mg mL^-1. Os precipitados obtidos foram individualmente dissolvidos em água e concentrados em evaporador rotativo (45°C) a pressão reduzida, sendo que os sobrenadante a 50 e 80% de etanol também foram concentrados em evaporador rotativo a pressão reduzida. Finalmente, os precipitados e os sobrenadantes obtidos com a precipitação etanólica a 50% e precipitação etanólica fracionada (20, 40, 60 e 80%), foram utilizados no bioensaio para o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo. Para que fosse possível a comparação direta entre os tratamentos, a concentração de cada solução foi ajustada ao equivalente a 40 mg de levedura por mL, a partir da solução obtida para cada fracionamento (Guzzo & Moraes, 1997).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Acúmulo de Fitoalexinas: Os mesocótilos tratados com as preparações obtidas a partir de S. cerevisiae, apresentaram pigmentação característica, com os tecidos variando a coloração em intensidade, do laranja-escuro a vermelho. O tempo de coleta dos mesocótilos foi estabelecido em 60 h, período no qual as fitoalexinas já foram sintetizadas e são extraídas pelo solvente (Lo et al., 1996). Estes pigmentos apresentam absorbância máxima entre 480 e 490 nm e quatro deles foram identificados como fitoalexinas (Nicholson et al., 1987; Hipskind et al., 1990; Lo et al., 1996) (Figura 1). No tempo de coleta empregado (60 h), os mesocótilos controle também acumularam fitoalexinas, provavelmente como uma resposta à injúria provocada pela excisão na base dos mesmos (Lopez & Pascholati, 1992) (TABELA 1).

Figura 1 -
Espectro de absorbância dos extratos metanólicos de mesocótilos de sorgo tratados com a preparação elicitora de Saccharomyces cerevisiae (a) ou com água (b). Extratos obtidos 60 h após o tratamento.

A capacidade das células de S. cerevisiae em causar o acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo foi demonstrada por Freitas et al. (1993) e Roncatto & Pascholati (1993), porém não foram conduzidos estudos visando caracterizar a natureza química das moléculas elicitoras.

Fracionamento dos Componentes Elicitores-Ativos a Partir de S. cerevisiae: A autoclavagem com posterior filtração das células, representou forma apropriada como um passo inicial tanto para a separação das células, assim como para a solubilização de moléculas (Figura 2), pois o filtrado de células autoclavadas causou o maior acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo (TABELA 1). Portanto, o tratamento térmico não afetou a capacidade de componentes das células de levedura em estimular o acúmulo de fitoalexinas em sorgo, demonstrando a natureza termoestável das moléculas elicitoras.

Figura 2 -
Teores de proteínas e carboidratos nos filtrados obtidos a partir de suspensões de células de Saccharomyces cerevisiae (20 mg mL^-1), submetidos ou não a autoclavagem.

Precipitação Etanólica: Como ilustrado na Figura 3, observa-se que somente os sobrenadantes das precipitações etanólicas (a 50 e 80 %) apresentaram atividade elicitora acima do valor atingido pelo tratamento com água (controle). O sobrenadante a 50% de etanol (S 50) causou um acúmulo de fitoalexinas mais elevado do que o sobrenadante da precipitação etanólica fracionada (80 % de etanol - S 80). Desta forma, pode-se empregar diretamente a precipitação a 50 % de etanol como um passo inicial no processo de purificação de possíveis moléculas elicitoras, visto representar um processo mais rápido que a obtenção do sobrenadante de precipitação etanólica fracionada (S 80).

Figura 3 -
Acúmulo de fitoalexinas em mesocótilo de sorgo tratados com amostras de Saccharomyces cerevisiae provenientes de precipitação etanólica (concentração equivalente a 40 mg levedura mL^-1). P = precipitado; S = sobrenadante; ctle = controle; números após abreviaturas referem-se a concentração de etanol (20, 40, 50, 60 e 80%).

Acúmulo de Fitoalexinas em Resposta a Concentrações Variáveis de Proteínas nas Preparações: O acúmulo de fitoalexinas nos mesocótilos de sorgo aumenta de acordo com valores crescentes de proteínas nas amostras elicitoras (Figura 4). Embora as curvas contidas na Figura 4 exibam perfil semelhante, observa-se que no tratamento com o sobrenadante de precipitação etanólica a 50%, um elevado acúmulo de fitoalexinas é atingido com concentrações menores de proteínas do que no tratamento com o filtrado de leveduras autoclavadas. Deve-se ressaltar que, em concentrações elevadas da preparação elicitora, ocorreu o desenvolvimento de bactérias, sendo que neste caso os valores destas amostras não foram utilizados na construção dos gráficos e análise dos resultados.

Figura 4 -
Acúmulo de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo mediante tratamento com preparações obtidas de Saccharomyces cerevisiae, contendo diferentes concentrações de proteínas. Filtrado de suspensão de células (-ÿ-); filtrado de células autoclavadas (-

Em leveduras, notadamente em S. cerevisiae, entre os polímeros presentes na parede celular e extraíveis mediante autoclavagam, estão as b-glicanas e as manoproteínas, sendo estes últimos os únicos componentes da parede celular de levedura a apresentarem natureza glicoproteica (Cabib et al., 1982). A precipitação com etanol é um meio empregado na obtenção dos componentes estruturais de leveduras (Cabib et al., 1982; Vallentin et al., 1984) e foi empregada neste trabalho, com o objetivo de permitir o fracionamento inicial do filtrado de leveduras autoclavadas. As moléculas que exibem a capacidade de induzir o acúmulo de fitoalexinas mostram-se resistentes a autoclavagem. Assim, fica evidente que a purificação e caracterização de moléculas elicitoras a partir de S. cerevisiae pode ser iniciada pelo tratamento térmico das suspensões de células, com posterior precipitação etanólica.

Recebido para publicação em 27.10.97

Aceito para publicação em 13.01.98

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¹ Parte da dissertação de mestrado apresentada a ESALQ/USP.

Parte da dissertação de mestrado apresentada a ESALQ/USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Nov 1998
• Data do Fascículo
  Jan 1998

Histórico

• Aceito
  13 Jan 1998
• Recebido
  27 Out 1997