Produção in vitro de enzimas extracelulares por fungos e sua relação com os sintomas descritos em planta hospedeira

In vitro production of extracellular enzymes by fungi and their relationship with the symptoms described for the host plant

RESUMO

Os fungos fitopatogênicos habitantes de solo causam perdas econômicas em muitas culturas e são difíceis de serem controlados. Esses fungos podem ser agrupados pelos sintomas comuns que causam nas plantas, bem como pelas enzimas extracelulares que podem produzir. O objetivo do trabalho foi verificar a produção in vitro de enzimas extracelulares por fungos de solo e tentar relacionar essas enzimas com os sintomas que cada fungo causa em planta hospedeira. O ensaio foi delineado em esquema inteiramente casualizado, com dois fatores, sete fungos (Cylindrocladium spathiphylli, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Ceratocystis fimbriata, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi e Verticillium dahliae) mais testemunha e seis enzimas (amilase, carboximetilcelulase, lipase, lacase, catalase e gelatinase) com 10 repetições. Catalase e gelatinase foram mensuradas por escala de notas, enquanto que as demais pelo cálculo da área da coroa circular. O ensaio foi repetido e a análise foi realizada com os dados de dois ensaios. Os fungos que causam podridão na raiz ou no colo da planta apresentaram maior produção de lacase, enquanto os que causam obstrução, fendas ou até a destruição do sistema vascular demonstraram a prevalência da lipase.

Palavras-chave :
Fungos de solo; interação enzimas-doenças; sintomatologia

ABSTRACT

Soilborne phytopathogenic fungi cause economical losses to several crops and are difficult to control. These fungi can be grouped according to the common symptoms they cause in plants, as well as to the extracellular enzymes they can produce. The aim of this study was to verify the in vitroproduction of extracellular enzymes for soilborne fungi and to relate these enzymes to the symptoms that each fungus causes in the host plant. The assay was conducted in completely randomized design, including two factors, seven fungi (Cylindrocladium spathiphylli, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Ceratocystis fimbriata, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi and Verticillium dahliae) plus control and six enzymes (amylase, carboxymethyl cellulase, lipase, laccase, catalase and gelatinase) with 10 replicates. Catalase and gelatinase were measured based on a score scale, while the other enzymes were analyzed by calculating the circular crown area (mm²). The assay was repeated twice and statistical analysis was done by using data of both assays. The fungi that cause root and collar rot presented greater laccase production, while those that cause obstruction, fissure and even destruction of the vascular system demonstrated prevalence of lipase.

Additional key-words:
Soilborne fungi; enzymes-diseases interaction; symptomatology

Os fungos fitopatogênicos habitantes de solo causam perdas econômicas em muitas culturas. Estes fungos podem produzir estruturas de resistência e estas, aliadas ao ambiente complexo do solo onde vivem, dificultam o seu controle (2). Sendo assim, novos estudos visando o seu manejo devem ser desenvolvidos.

Bedendo (1), citando McNew (1960), classificou doenças por fitopatógenos que causam um sintoma comum em suas plantas hospedeiras, interferindo, assim, em um mesmo processo fisiológico da planta.

Pascholati (10) afirma que para um fitopatógeno infectar uma planta é preciso que o mesmo consiga penetrar e colonizar os tecidos do seu hospedeiro, retirar os nutrientes necessários para sua atividade e sobrevivência, bem como neutralizar as reações de defesa da planta. Para isso, o patógeno utiliza-se de substâncias tais como enzimas, toxinas e hormônios.

Os objetivos do presente trabalho foram investigar a produção de enzimas extracelulares in vitro por diferentes gêneros de fungos fitopatogênicos habitantes do solo e tentar relacionar a(s) enzima(s) com os sintomas que cada fungo causa em planta hospedeira. A associação pode facilitar futuras investigações do papel da(s) enzima(s) na patogênese do fungo.

Colônias dos fungos utilizadas nos ensaios foram produzidas no meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) mais 0,05 mg/mL de oxitetraciclina, incubado em BOD a 25°C, na ausência de luz, por oito dias.

Os meios específicos para a produção das enzimas estudadas foram preparados conforme metodologia descrita por Migotto et al. (8). Um disco do meio BDA, contendo cada espécie de fungo, foi transferido, separadamente, para o centro da placa e para tubos de ensaio. Os tubos foram utilizados para o ensaio com a enzima gelatinase e as placas para as demais enzimas.

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente ao acaso, em esquema de dois fatores [7 fungos: Rhizoctonia solani AG-4 HGI de crisântemo (Dendranthema sp.); Sclerotium rolfsii de ajuga (Ajuga reptans L.); Ceratocystis fimbriata de figo (Ficus carica L.); Fusarium oxysporum f. sp. dianthi de cravo (Dianthus caryophyllus L.); Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel); Sclerotinia sclerotiorum de crisântemo (Dendranthema sp.) e Verticillium dahliae de berinjela (Solanum melongena L.) e 6 enzimas: amilase, carboximetilcelulase, lipase, lacase, catalase e gelatinase], com 10 repetições. O tratamento controle dos testes (testemunha) constituiu-se de meios contendo discos de meio de cultura (BDA), sem que estivessem colonizados pelo isolado dos fungos. O ensaio foi repetido uma vez.

Especificamente para os fungos R. solani, S. rolfsii e S. sclerotiorum, os meios permaneceram na BOD a 25 °C, no escuro, por dois dias, em função do rápido crescimento destes fungos. Os demais permaneceram por cinco dias na BOD.

A avaliação das enzimas estudadas foi feita de forma semelhante a metodologia descrita por Migotto et al. (8).

Forner et al. (5) verificaram a produção in vitro de enzimas extracelulares por S. rolfsiide Ajuga reptans e por C. spathiphylli de Spathiphyllum wallisi e constataram que a enzima com maior área de atividade por ambos os fungos foi a lacase. No presente trabalho (Tabela 1), constatou-se a mesma enzima com maior atividade produzida por estes fungos.

Tabela 1
Produção de enzimas extracelulares in vitro por Rhizoctonia solani, Cylindrocladium spathiphylli, Sclerotium rolfsii, Ceratocystis fimbriata, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi e Verticillium dahliae em meios de cultura específicos mantidos em estufa tipo BOD e relação das enzimas com os principais sintomas causados pelos fungos em planta hospedeira.

Fungos	Sintomas	Amilase	Carboximetilcelulase	Lipase	Lacase	Catalase	Gelatinase
		Área da coroa circular (mm2)				Escala de notas5
Rhizoctonia solani	Podridão de raiz e colo	0,0* b1 C2	0,0 c C	198,7 d B	392,5 c A	2,0* b3 B4 (2,0±0,0)6	2,9 a A (3,0±1,0)
Cylindrocladium spathiphylli		0,0 b C	0,0 c C	870,0 b B	1013,4 b A	2,0 b A (2,0±0,0)	1,6 b B (1,0±2,0)
Sclerotium rolfsii		0,0 b C	0,0 c C	185,9 d B	1483,2 a A	2,0 b A (2,0±0,0)	1,4 b B (1,0±1,0)
Ceratocystis fimbriata		0,0 b C	0,0 c C	167,4 d B	1091,7 b A	2,5 ab A (2,0±1,0)	1,0 b B (1,0±0,0)
Sclerotinia sclerotiorum	Podridão de raiz e colo, fendas e até destruição do sistema vascular	0,0 b C	38,8 b B	1184,4 a A	0,0 e C	2,0 b A (2,0±0,0)	1,0 b B (1,0±0,0)
Fusarium oxysporum f. sp. dianthi	Obstrução do sistema vascular	0,0 b C	0,0 c C	1041,3 b A	54,8 d B	2,7 a A (3,0±1,0)	1,3 b B (1,0±1,0)
Verticillium dahliae		165,1 a B	367,2 a A	430,8 c A	0,0 e C	2,0 b A (2,0±0,0)	1,0 b B (1,0±0,0)
Testemunha		0,0 b A	0,0 c A	0,0 e A	0,0 e A	1,0 c A (1,0±0,0)	1,0 b A (1,0±0,0)

• ^*
  Média de dois ensaios. Cada ensaio com 10 repetições, totalizando 20 repetições por isolado e por enzima;
• ¹
  Letras minúsculas iguais, na coluna, para as enzimas amilase, carboximetilcelulase, lipase e lacase não diferem entre si segundo o teste de Scott-Knott com 5% de probabilidade. Os dados foram transformados em √x+0,5, sendo x os valores das áreas;
• ²
  Letras maiúsculas iguais, na linha, para as enzimas amilase, carboximetilcelulase, lipase e lacase não diferem entre si segundo o teste de Scott-Knott com 5% de probabilidade;
• CV= 31,04%;
• ³
  Letras minúsculas iguais, na coluna, para as enzimas catalase e gelatinase não diferem entre si segundo o teste de Kruskal-Wallis com 1% de probabilidade;
• ⁴
  Letras maiúsculas iguais, na linha, para as enzimas catalase e gelatinase não diferem entre si segundo a análise de Mann-Whitney com 5% de probabilidade;
• ⁵
  Escala de notas, sendo 1=ausência; 2=fraca; 3=moderada e 4=intensa, sendo que para catalase refere-se ao tamanho das bolhas formadas e para a gelatinase quanto à liquefação ou não do meio;
• ⁶
  Mediana e semi-amplitude interquartílica.

Firmino (4) caracterizou isolados de Ceratocystis sp. de diferentes hospedeiros quanto à produção in vitro de enzimas extracelulares, constatando que os isolados do fungo produziram protease, peroxidase, amilase e lacase, enquanto que a lipase, celulase e pectatoliase não foram produzidas e não sendo possível afirmar a enzima prevalente. Diferentemente, neste trabalho, o isolado de C. fimbriata testado produziu lipase e teve a lacase como a enzima de maior produção (Tabela 01). Os principais sintomas descritos para C. fimbriata em planta hospedeira são podridão no colo, lenho, córtex e câmbio, e colonização do sistema vascular (7).

Os fungos que não produziram a lacase foram S. sclerotiorum e V. dahliae, enquanto S. rolfsii foi o maior produtor (Tabela 1).

Os fungos S. rolfsii, C. spathiphylli e R. solanicausam em planta hospedeira principalmente podridão de raiz e colo, com sintomas reflexos de amarelecimento e murcha foliar até a morte da planta (7).

Bueno et al. (3) verificaram a produção in vitro de enzimas extracelulares por isolados de Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi, constatando que a enzima com maior produção foi a lipase. Semelhantemente, neste trabalho, a enzima com maior produção por F. oxysporum f. sp. dianthi e V. dahliae foi, também, a lipase. Especificamente para V. dahliae, as enzimas lipase e carboximetilcelulase não apresentaram diferenças significativas entre si quanto à produção (Tabela 01).

Os fungos F. oxysporum f. sp. dianthi e V. dahliae causam em planta hospedeira os principais sintomas de avermelhamento, escurecimento e obstrução do sistema vascular, culminando em amarelecimento e murcha foliar até a morte da planta (7).

O fungo S. sclerotiorum causa, inicialmente, podridão na raiz e no colo com sintomas reflexos de amarelecimento, murcha e seca da parte aérea tal como os fungos R. solani, S. rolfsii, C. spathiphylli e C. fimbriata (7). Diante disto, era de se esperar que S. sclerotiorum produzisse em maior quantidade a enzima lacase. Contudo, a lipase, que foi produzida por todos os fungos, foi preponderante em S. sclerotiorum (Tabela 01). Diferentemente dos demais fungos, S. sclerotiorum, após sua ação patogênica inicial na planta, ataca o sistema vascular, causando fendas e até a destruição do mesmo (7), assim como os outros fungos que comprometem o sistema vascular, como F. oxysporum f. sp. dianthi e V. dahliae.

Quanto à enzima carboximetilcelulase, os únicos fungos que a produziram foram S. sclerotiorum e em destaque V. dahliae (Tabela 01). Segundo Hasan et al. (6), o fungo Verticillium lecaniiproduz em meios específicos as enzimas protease, amilase e lipase. No entanto, não foi possível afirmar qual enzima prevaleceu em termos quantitativos. O trabalho de Hasan et al. (6) corrobora com a produção in vitro das enzimas extracelulares amilase, lipase e carboximetilcelulase por V. dahliae. Além disto, este foi o único fungo que produziu amilase (Tabela 01). Oliveira et al. (9) constataram em meios específicos, principalmente quando suplementado com células de parede celular de feijão (Phaseolus vulgaris), a produção de poligalacturonase, CMCase (celulases), glucanase e xilanase por S. sclerotiorum. A produção de carboximetilcelulase por S. sclerotiorum de crisântemo (Tabela 01) é corroborada pelos dados do trabalho de Oliveira et al. (9).

Catalase e gelatinase quando produzidas foram de maneira fraca. Todos os fungos testados produziram catalase, destacando-se F. oxysporum f. sp. dianthi. A gelatinase apenas R. solani a produziu (Tabela 01).

Fazendo-se uma relação de enzimas extracelulares produzidas por fungos versus sintomas descritos em planta hospedeira, os fungos que causam podridão de raiz e colo (R. solani, C. spathiphylli, S. rolfsiie C. fimbriata) produziram com prevalência a lacase. Para os fungos que causam obstrução, fendas ou até a destruição do sistema vascular (S. sclerotiorum, F. oxysporum f. sp. dianthi e V. dahliae), a lipase foi a enzima prevalente. Devido à fraca produção de catalase e a quase ausência de gelatinase não foi possível relacionar essas enzimas com os sintomas que cada fungo causa em planta hospedeira (Tabela 01).

Segundo as referências de Migotto et al. (8), as lacases podem ser produzidas por fungos, plantas superiores e, também, por bactérias. Em fungos, as lacases estão envolvidas em degradação de lignina, produção de pigmento e, também, na patogênese de plantas. De acordo com Pascholatti (10), a maioria dos fitopatógenos pode produzir uma variedade de enzimas extracelulares. No entanto, os estudos da comprovação do papel destas enzimas na infecção de plantas são escassos.

Bedendo (1), citando McNew (1860), classificou doenças analisando fungos de gêneros diferentes que causam sintomas comuns na planta hospedeira. No presente trabalho, verificou-se que fungos de gêneros diferentes e que causam sintoma comum na planta produzem também uma enzima em comum. Essa observação pode ajudar nas pesquisas futuras do papel da(s) enzima(s) produzida(s) pelo fungo na sua patogênese. Além disto, essa observação pode abrir uma nova porta para controle de doenças baseado em enzimas. Em hipótese, suprimindo a ação da enzima responsável pelo início da patogênese, supõe-se que não haverá o desenvolvimento da doença.

O próximo passo agora do trabalho é seguir os moldes do artigo de Oliveira et al. (9), que além de verificarem a produção de enzimas em condições in vitro, infectaram a planta hospedeira e mediram a produção das mesmas enzimas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Oct-Dec 2015

Histórico

• Recebido
  25 Nov 2015
• Aceito
  04 Maio 2015