Efeitos de meio de cultura, fontes de carbono e nitrogênio, pH e regime luminoso no crescimento de Mycosphaerella musicola

Effects of medium, carbon and nitrogen source, pH and light on the growth of Mycosphaerella musicola

NOTAS CIENTÍFICAS

Efeitos de meio de cultura, fontes de carbono e nitrogênio, pH e regime luminoso no crescimento de Mycosphaerella musicola¹

Effects of medium, carbon and nitrogen source, pH and light on the growth of Mycosphaerella musicola

Angélica Virgínia Valois MontarroyosI, III, ^*; Rildo Sartori Barbosa Coelho^II; Gabriela de Morais Guerra Ferraz^I; Rômulo dos Santos^I; Venézio Felipe dos Santos^I; Paulo Paes de Andrade^III

^IEmpresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária, Rua Manoel de Arruda Câmara, 120/603, Prado, CEP 50.720-140, Recife, PE, e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco, CEP 52.171-900, Recife, PE

^IIIUniversidade Federal de Pernambuco, CEP 50.670-901, Recife, PE

RESUMO

Este trabalho objetivou o estabelecimento de condições favoráveis ao crescimento micelial de M. musicola in vitro, pela avaliação em quatro experimentos, da influência de diferentes meios de cultura (BDA, BDA/IFB, V8, V8/IFB, V8/CaCO₃ e V8/CaCO₃/IFB); combinações de fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose e xilose) e nitrogênio (peptona, glicina, nitrato de potássio e de sódio); valores de pH (6,8; 6,4; 5,7 e 4,9) e regimes luminosos (escuro contínuo, alternância luminosa e claro contínuo). Observou-se um maior crescimento de M. musicola quando cultivado nos meios de cultura BDA/IFB, V8/IFB e BDA. As fontes de carbono sacarose, maltose e dextrose quando combinadas com a peptona como fonte de nitrogênio, promoveram um maior crescimento micelial de M. musicola. O meio de cultura BDA/IFB, com o valor final de pH ajustado para 5,7, em regime de escuro contínuo, apresentou-se como o melhor para o crescimento de M. musicola.

Palavras-chave adicionais:Pseudocercospora musae, mal-de-sigatoka, sigatoka amarela, banana.

ABSTRACT

This work aimed the establishment of the best growth conditions of M. musicola mycelia in vitro through the analysis of the influence of different culture media (BDA, BDA/IFB, V8, V8/IFB, V8/CaCO₃ and V8/CaCO₃/IFB), combinations of carbon (dextrose, maltose, sucrose and xylose) and nitrogen (peptone, glycine, potassium nitrate and sodium nitrate) sources, medium pH values (6.8, 6.4, 5.7 and 4.9) and photoperiods (continuous darkness, alternating darkness/lightness and continuous lightness). At the end of the evaluation period, cultural parameters and the dry weights of colonies were annotated. BDA/IFB, V8/IFB and BDA culture media promoted the best mycelial growth. The experiments also demonstrated that dextrose and sucrose when combined with peptose as a nitrogen source, are the best carbon sources as they promoted the most vigorous mycelial growth. The use of BDA/IFB culture medium, with its final pH adjusted to 5.7, and a photoperiod of continuous darkness was the best condition for the growth of M. musicola.

Additional keywords:Pseudocercospora musae, sigatoka disease, yellow sigatoka, banana.

O fungo fitopatogênico Mycosphaerella musicola Leach, forma teleomórfica de Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton (9), causador da doença sigatoka-amarela, constitui-se em um dos principais problemas da bananicultura no Brasil (3, 12, 15).

A obtenção de cultura pura de M. musicola é dificultada pelo seu lento crescimento e baixa esporulação in vitro (14). A composição do meio de cultura, as fontes de carbono e nitrogênio, o pH do meio de cultura e os regimes de luminosidade são mencionados como os principais fatores para a obtenção de culturas in vitro de diversos fungos fitopatogênicos (2, 6, 13).

Este trabalho objetivou o estabelecimento de condições de cultivo que promovam um maior crescimento micelial de M. musicola in vitro. O trabalho conduzido constou de quatro experimentos nos quais foi utilizado um isolado de M. musicola obtido de folhas infectadas de bananeira "Pacovan", proveniente do município de Igarassu, PE.

Os meios de cultura utilizados nos experimentos foram autoclavados durante 15 minutos a 121ºC, tendo os valores de pH sido aferidos posteriormente. A inoculação do isolado nos meios de cultura foi realizada por meio da transferência direta de esporodóquios do fungo, obtidos de fragmentos de tecido foliar infectado, mantidos em câmara úmida durante 24 horas. Foram efetuadas três inoculações por placa de Petri. Os experimentos foram conduzidos em condições de alternância luminosa (12 h claro/ 12 h escuro), a exceção do experimento de regimes luminosos, e temperatura de 28ºC ± 2ºC.

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, tendo sido considerados seis tratamentos para o experimento de meios de cultura, quatro para o de valores de pH e três para o de regimes luminosos. O experimento sobre fontes de carbono e nitrogênio foi conduzido em arranjo fatorial 4 x 4, sendo quatro fontes de carbono e quatro de nitrogênio, perfazendo um total de 16 tratamentos. Em todos os experimentos foram utilizadas seis repetições por tratamento, sendo cada parcela representada por uma placa de Petri com três colônias.

Foram realizadas cinco avaliações com intervalos de sete dias, quando foram anotadas os seguintes parâmetros: crescimento micelial obtido por meio da medição do diâmetro da colônia, em dois sentidos diametralmente opostos; taxa de crescimento calculada entre as leituras efetuadas aos 7 e 14 dias de incubação conforme Lilly & Barnett (10); e peso seco obtido após a última avaliação, segundo metodologia descrita por Reeslev & Kjoller (16). Os dados obtidos foram transformados com (x + 0,5)^1/2 e analisados por meio do programa SWNTIA (5). As médias foram comparadas entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As características culturais foram descritas em função da morfologia e coloração das culturas.

Efeito de diferentes meios de cultura - O crescimento de M. musicola foi avaliado em seis meios de cultura: BDA (200g de batata, 20g de dextrose, 1000mL de água destilada), BDA/IFB (BDA acrescido de infuso de 200g de folhas de bananeira), V8 (200mL de suco vegetal V-8 da Campbell Soup Company, USA, 17g de agar, 800mL de água destilada), V8/IFB (V8 acrescido de infuso de 200g de folhas de bananeira), V8/CaCO₃ (V8, 3g de CaCO₃) e V8/CaCO₃/IFB (V8/CaCO₃ acrescido de infuso de 200g de folhas de bananeira).

Foram encontradas diferenças estatísticas significativas quanto ao crescimento micelial e peso seco de M. musicola entre os diferentes meios de cultura avaliados (Tabela 1). As maiores médias foram observadas para os meios de cultura BDA/IFB, V8/IFB e BDA, os quais não diferiram estatisticamente entre si. As maiores médias de peso seco obtidas nos meios quando comparadas com as dos meios sem a infusão de folhas de bananeira, sugerem uma influência positiva de sua inclusão, no crescimento do fungo in vitro. De fato, decoctos, extratos e sucos oriundos de folhas ou de outras partes vegetais, têm sido apontados como estimuladores do crescimento micelial e a esporulação de vários fungos (4).

Efeito de diferentes fontes de carbono e nitrogênio - Foram avaliadas como fontes de carbono a dextrose (D), maltose (M), sacarose (S) e xilose (X), e como fontes orgânicas de nitrogênio a peptona (P) e glicina (G) e inorgânicas o nitrato de potássio (NP) e o de sódio (NS). Foi utilizado como meio de cultura básico (MB) o descrito por Lilly & Barnett (10), tendo sido avaliadas as seguintes combinações: MB/D/P, MB/D/G, MB/D/NP, MB/D/NS, MB/M/P, MB/M/G, MB/M/NP, MB/M/NS, MB/S/P, MB/S/G, MB/S/NP, MB/S/NS, MB/X/P, MB/X/G, MB/X/NP, MB/X/NS.

Não ocorreu interação significativa entre fonte de carbono, nitrogênio e épocas de avaliação. Entretanto, verificaram-se interações significativas para as combinações: fonte de carbono x tempo e fonte de nitrogênio x tempo, indicando que a suplementação dessas fontes no meio de cultura afetaram o crescimento micelial de M. musicola. Interação altamente significativa foi observada entre carbono x nitrogênio, tendo sido constatadas as maiores médias de crescimento radial e peso seco para as fontes de carbono, sacarose, maltose e dextrose, quando combinadas com a peptona como fonte de nitrogênio (Tabela 2). O resultado obtido era esperado, uma vez que essas fontes estão entre as mais importantes para o metabolismo dos fungos em geral (2, 6, 8).

A utilização da xilose como fonte de carbono, independente da fonte de nitrogênio, resultou nas menores médias, sugerindo um efeito inibidor desta fonte no crescimento micelial de M. musicola. Baixa resposta a xilose também foi observada no crescimento micelial de Botryodiplodia theobromae Pat. (11). O insucesso da xilose, como fonte de carbono poderia estar relacionado a sua conformação molecular, a qual dificultaria a assimilação pelo fitopatógeno (1).

Efeito de diferentes valores de pH - Foi avaliada a influência de quatro valores de pH: 6,8; 6,4; 5,7 e 4,9, utilizando-se como meio de cultura o BDA/IFB. Diferenças estatísticas significativas foram observadas para o parâmetro crescimento radial apenas entre os valores de pH 5,7 e 4,9, com a maior média verificada para o primeiro. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos para o parâmetro peso seco, apesar da maior média ter sido constatada também para o pH 5,7.

Efeito de diferentes regimes luminosos - Foi utilizado o meio de cultura BDA/IFB, com pH de 5,7, avaliado sob três regimes luminosos: alternância luminosa (12 h claro/12 h escuro), luz contínua e escuro contínuo. Foram observadas diferenças estatísticas significativas entre os parâmetros nos regimes luminosos avaliados. Os melhores resultados foram obtidos para os cultivos mantidos no escuro contínuo e os menores valores médios foram observados para o regime luminoso claro contínuo. Melhor crescimento micelial foi igualmente constatado no regime de escuro contínuo para Mycosphaerella fijiensis (7).

Apesar do peso seco ser considerado um parâmetro mais eficiente na avaliação do crescimento de fungos (2), em nosso estudo os valores obtidos mediante a utilização do diâmetro da colônia para medir o crescimento micelial foram compatíveis com os observados para o parâmetro peso seco, e por ser uma metodologia mais simples, pode ser empregada com eficiência em estudos futuros de crescimento de fungos.

Quanto às características culturais das colônias não foram observadas diferenças expressivas entre os experimentos. A coloração do anverso foi sempre preta; a do verso variou do cinza a rosa acinzentado com centro variegado de cinza escuro, branco ou rosa; as bordas apresentaram-se onduladas ou irregulares e os micélios aéreos, densos, com centros elevados em projeções globulares. Maiores variações foram observadas no experimento de fontes de carbono e nitrogênio, que apresentou colônias com coloração do verso preta e micélio submerso, plano e sem forma definida. Diferenças na morfologia das colônias podem ser resultado da influência das condições de cultivo as quais o isolado foi submetido (3, 12).

Com base nos resultados obtidos neste trabalho pode-se recomendar para a indução de um maior crescimento micelial de M. musicola in vitro, o acréscimo da infusão de folhas de bananeira ao meio de cultura BDA com o subseqüente ajuste do valor final do pH para 5,7 e cultivo sob regime de escuro contínuo. O crescimento micelial também poderá ser favorecido com o acréscimo de sacarose, maltose ou dextrose, como fontes de carbono combinadas com peptona, como fonte de nitrogênio.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer à FACEPE pelo financiamento da pesquisa e concessão da bolsa de fixação de pesquisadora a primeira autora, bem como ao Dr. Elton Oliveira dos Santos pela cessão dos materiais biológicos.

Data de chegada: 27/07/2005.

Aceito para publicação em: 02/02/2006.

Pesquisa financiada pela Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco FACEPE, APQ 0234-2.02/02

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1

Este trabalho é parte da tese de doutorado da primeira autora pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco

*

Autora para correspondência: Angélica Virgínia Valois Montarroyos

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Mar 2007
• Data do Fascículo
  Mar 2007

Histórico

• Aceito
  02 Fev 2006
• Recebido
  27 Jul 2005