Composição química volátil e não-volátil de Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae

Resumos

Este trabalho descreve a composição química dos óleos essenciais e o isolamento de onze substâncias de Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação, analisados por CG-EM e avaliados quanto às suas atividades frente à enzima acetilcolinesterase. O rendimento dos óleos foi de 0,11% para as folhas e 0,03% para os talos. Os principais constituintes dos óleos foram os sesquiterpenos β-cariofileno (24,9 e 22,2%), espatulenol (17,7 e 12,4%) e epóxi-allo-aromadendreno (23,0 e 23,6%). Do extrato hexânico da parte aérea foi isolada a mistura de β-sitosterol e estigmasterol, incluindo suas formas glicosiladas, e os triterpenos acetato de taraxasterila e taraxasterol, enquanto, do extrato etanólico foram isolados os flavonóides nepetina and 3-O-glicosil-quercetina. Do extrato hexânico das raízes foram isolados os triterpenos epi-friedelanol e damara-20,24-dien-3β-ol e do extrato etanólico a cumarina 11-hidroxi-11,12-di-hidroobliquina. As estruturas de todos os compostos foram determinadas usando técnicas espectroscópica tais como IV, EM e RMN ¹H e 13C.

Eupatorium ballotifolium; Asteraceae; óleo essencial; atividade acetilcolinesterásica

This work describes the chemical composition of the essential oils and the isolation of eleven substances from Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae. The essential oils were obtained by hydrodistillation, analyzed by GC/MS and evaluated towards the acetylcholinesterase enzyme. The oils yield was of 0.11% for the leaves and 0.03% for the stems. The main constituents of the oils were the sesquiterpenes β-caryophyllene (24.9 and 22.2%), spathulenol (17.7 and 12.4%) and epoxy-allo-aromadendrene (23.0 and 23.6%). From the hexane extract of the aerial part were isolated a mixture of sitosterol and stigmasterol, its glucosides, and the triterpenes taraxasteryl acetate and taraxasterol, while from the ethanol extract were obtained the flavonoids nepetin and 3-O-glucoside-quercetin. The triterpenes epi-friedelanol and dammara-20,24-dien-3β-ol were obtained from the hexane extract of roots, while the coumarin 11-hydroxy-11,12-di-hydroobliquine was obtained from the ethanol extract. The structures of all compounds were determinate based on spectroscopic methods such as IR, MS and ¹H and 13C NMR

Eupatorium ballotifolium; Asteraceae; essential oil; acetylcholinesterase activity

ARTIGO

Composição química volátil e não-volátil de Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae

Maria Rose Jane R. Albuquerque^I,*; Hélcio S. dos Santos^I; Elnatan B. de Souza^I; Rochanne M. da Silva^I; Jane Eire Silva A. de Menezes^II; Otília Deusdênia L. Pessoa^III; Raimundo Braz-Filho^IV; Sônia Maria O. Costa^V

^ICurso de Licenciatura em Química, Coordenação de Química, Universidade Estadual Vale do Acaraú, Caixa Postal D-3, Campus da Betânia, 62040-370 Sobral-CE, Brasil

^IICurso de Licenciatura em Química, Faculdade de Educação de Itapipoca, Av. Monsenhor Tabosa s/n, 62500-000 Itapipoca-CE, Brasil

^IIIDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 12200, Campus do Pici, 60020-181 Fortaleza-CE, Brasil

^IVSetor de Química de Produtos Naturais, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28013-602 Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil

^VCurso de Licenciatura em Química, Coordenação de Química, Universidade Estadual do Ceará, Campus do Itaperi, 60740-903 Fortaleza-CE, Brasil

RESUMO

Este trabalho descreve a composição química dos óleos essenciais e o isolamento de onze substâncias de Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação, analisados por CG-EM e avaliados quanto às suas atividades frente à enzima acetilcolinesterase. O rendimento dos óleos foi de 0,11% para as folhas e 0,03% para os talos. Os principais constituintes dos óleos foram os sesquiterpenos β-cariofileno (24,9 e 22,2%), espatulenol (17,7 e 12,4%) e epóxi-allo-aromadendreno (23,0 e 23,6%). Do extrato hexânico da parte aérea foi isolada a mistura de β-sitosterol e estigmasterol, incluindo suas formas glicosiladas, e os triterpenos acetato de taraxasterila e taraxasterol, enquanto, do extrato etanólico foram isolados os flavonóides nepetina and 3-O-glicosil-quercetina. Do extrato hexânico das raízes foram isolados os triterpenos epi-friedelanol e damara-20,24-dien-3β-ol e do extrato etanólico a cumarina 11-hidroxi-11,12-di-hidroobliquina. As estruturas de todos os compostos foram determinadas usando técnicas espectroscópica tais como IV, EM e RMN ¹H e ¹³C.

Unitermos: Eupatorium ballotifolium, Asteraceae, óleo essencial, atividade acetilcolinesterásica.

ABSTRACT

This work describes the chemical composition of the essential oils and the isolation of eleven substances from Eupatorium ballotifolium Kunth, Asteraceae. The essential oils were obtained by hydrodistillation, analyzed by GC/MS and evaluated towards the acetylcholinesterase enzyme. The oils yield was of 0.11% for the leaves and 0.03% for the stems. The main constituents of the oils were the sesquiterpenes β-caryophyllene (24.9 and 22.2%), spathulenol (17.7 and 12.4%) and epoxy-allo-aromadendrene (23.0 and 23.6%). From the hexane extract of the aerial part were isolated a mixture of sitosterol and stigmasterol, its glucosides, and the triterpenes taraxasteryl acetate and taraxasterol, while from the ethanol extract were obtained the flavonoids nepetin and 3-O-glucoside-quercetin. The triterpenes epi-friedelanol and dammara-20,24-dien-3β-ol were obtained from the hexane extract of roots, while the coumarin 11-hydroxy-11,12-di-hydroobliquine was obtained from the ethanol extract. The structures of all compounds were determinate based on spectroscopic methods such as IR, MS and ¹H and ¹³C NMR

Keywords: Eupatorium ballotifolium, Asteraceae, essential oil, acetylcholinesterase activity.

INTRODUÇÃO

O gênero Eupatorium (tribo Eupatorieae, subtribo Eupatoriinae), um dos maiores da família Asteraceae, é representado por aproximadamente 1200 espécies, distribuídas principalmente na Europa, Ásia e América do Norte (Zhang et al., 2008). As espécies pertencentes a esse gênero são utilizadas na medicina popular, em diferentes partes do mundo, no tratamento de úlceras estomacais e dores de cabeça (El-Seedi et al., 2002), malária (Lang et al., 2001), inflamação (Yang et al., 2004) e doenças do fígado (Carreras et al., 1998). Corroborando o uso popular, a literatura tem demonstrado que extratos e óleos essenciais, bem como substâncias com propriedades biológicas têm sido obtidos a partir de espécies de Eupatorium (Shen et al., 2005; De Las Herras et al., 1998; Habtemariam 1998). Muitos extratos de plantas pertencentes a esse gênero, especialmente aqueles ricos em lactonas sesquiterpênicas, podem ser fontes promissoras para o desenvolvimento de novas drogas (Zhang et al., 2008). Estudos fitoquímicos prévios envolvendo espécies de Eupatorium descrevem, entre muitos outros compostos, o isolamento de lactonas sesquiterpênicas (Boeker et al., 1986; Huo et al, 2004), flavonóides (Muschiete et al., 1994), diterpenos (González et al., 1990), compostos benzofurânicos (Habtemariam, 1998), alcalóides pirrolizidinicos (Lang et al., 2001) e cromenos (Gómez et al., 1982). Aspectos químicos e quimiotaxonômicos, sobre a subtribo Eupatoriinae, a qual inclui quatro gêneros, Austroeupatorium, Stomatanthes, Hatschbiella e Eupatorium têm sido revisados (Herz, 2001).

Como parte de um estudo multidicisplinar, cujo objetivo é investigar a composição química e atividade biológica de óleos essenciais de plantas da família Asteraceae, investigou-se a composição química de E. pauciflorum (sin. Praxelis pauciflora), E. betonicaeforme (sin. Barrosoa betonicaeformis) e E. ballotifolium (sin.: Loutergia ballotaefolia) (Albuquerque et al., 2006, 2005, 2004, 2001; Militão et al., 2004). Neste trabalho é descrita a composição química dos extratos de E. ballotifolium, incluindo seus óleos essenciais, desta vez envolvendo plantas coletadas em dois municípios do estado do Ceará, Meruoca e Acarape. Adicionalmente, foi avaliada qualitativamente, a atividade anticolinesterase dos óleos essenciais das folhas e talos da referida espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

A planta, em estágio de floração, foi coletada na serra da Meruoca, Sobral-CE, em março de 2008. A autenticação botânica foi feita pelos professores Edson Paula Nunes (Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará) e Elnatan Bezerra de Souza (Universidade Estadual Vale do Acaraú). A exsicata de nº 27.646, encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará.

Instrumentação e material cromatográfico

Os pontos de fusão foram obtidos em equipamento de Microdeterminação digital da Mettler Toledo com placa aquecedora FP82HT e central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidas. Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 1000-FT, utilizando-se pastilhas de brometo de potássio (KBr). Os espectros de RMN ¹H e ¹³C, uni- e bidimensionais foram obtidos em espectrômetro Bruker, modelo DRX-300 (300 MHz para ¹H e 75 MHz para ¹³C) e Avance DRX-500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C). Os espectros de massas dos óleos essenciais foram obtidos em espectrômetro de massa Hewlett-Packard, modelo HP-5971 A, acoplado a cromatógrafo gás-líquido, modelo HP-5890 A, série II (CG/EM), provido de coluna capilar DB-5 com 25,0 m de comprimento, 0,20 mm de diâmetro interno, utilizando um gradiente de aumento de temperatura de 4 ºC/min de 50 a 180 ºC e 20 ºC/min de 180 a 280 ºC, sendo a temperatura do injetor de 250 ºC. Os espectros de massa dos constituintes não-voláteis foram obtidos em espectrômetro de massa Shimadzu, modelo QP 5000, DI-50, por impacto eletrônico a 70 eV. Nas cromatografias de adsorção utilizou-se gel de sílica 60 da Vetec (Ø µm 70-230 mesh) e Merck (Ø µm 230-400), enquanto nos fracionamentos cromatográficos por exclusão molecular foi empregado Sephadex LH-20. As cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) foram realizadas com gel de sílica 60, (Ø µm 5-40, Merck) com indicador de fluorescência na faixa de 254 ηm (F₂₅₄), sobre cromatofolha de poliéster. As substâncias foram reveladas com solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida de aquecimento em estufa (≈100 ºC), por aproximadamente 5 min. As rotações ópticas foram obtidas utilizando Polarímetro digital da Perkin-Elmer 341 à temperatura de 25 ºC e concentração de 1 mg para 2 mL de solvente.

Extração dos óleos essenciais

Porções de folhas (185,68 g) e talos (224,02 g) de E. ballotifolium foram acondicionadas, separadamente em balão de 5 L, juntamente com 1,5 L de água e submetidos ao processo de hidrodestilação em aparelho tipo-Clevenger por um período de 2 h. Os óleos obtidos foram secos com sulfato de sódio anidro (~1 g), filtrados e mantidos sob refrigeração antes da análise. Óleos amarelados e com odor agradável foram obtidos em teores de 0,11% (oleo I, folhas) e 0,03% (óleo II, talos), calculado com base no peso do material vegetal fresco.

Extração e isolamento dos constituintes

A parte aérea (1200 g) e raízes (600 g) de E. ballotifolium foram secas à temperatura ambiente, trituradas e submetidas à extração exaustiva com hexano a frio, seguido de etanol. As soluções obtidas de cada solvente foram destiladas sob pressão reduzida, resultando nos respectivos extratos: hexânicos (21,6 g, parte aérea, Ext. A; 4,3 g, raízes, Ext. B) e EtOH (50,3 g, parte aérea, Ext. C; 16,1 g, raízes, Ext. D). O extrato A (21,6 g), após fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica (80,0 g), resultou nas seguintes frações: éter de petróleo (8,1 g), hexano (0,7 g), CH₂Cl₂ (6,6 g), AcOEt (5,7 g) e MeOH (0,3 g). Durante a evaporação da fração éter de petróleo formou-se um precipitado, o qual após filtração à vácuo e recristalização em acetona resultou no isolamento de 1 (1,5 g, p.f. 215-217 ºC), identificado como o triterpeno acetato de taraxasterila (Ahmad & Rahman, 1994). A fração hexânica (0,7 g), após fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica utilizando hexano, hexano-CHCl₃ (9:1, 1:1) e CHCl₃, forneceu a substância 2 (6,0 mg, p.f. 255-257 ºC), identificada como o triterpeno taraxasterol (Mahato & Kundu, 1994), por eluição com hexano-CHCl₃ 9:1. A fração CHCl₃ (6,6 g), após fracionamento cromatográfico utilizando a mesma metodologia, resultou em 2,01 g da mistura dos esteróides β-sitosterol (3) e estigmasterol (4), por eluição com hexano-CHCl₃ 1:1. O extrato B (4,3 g) foi submetido a cromatografia sobre gel de sílica (74,6 g), utilizando os solventes éter de petróleo, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias. Foram obtidas 74 frações de 30 mL, as quais foram concentradas sob pressão reduzida e analisadas por CCDA. A fração resultante da eluição com éter de petróleo/AcOEt 9:1, forneceu a substância 5 (40,1 mg; p.f. 276-278 ºC; lit. 279-281 ºC), identificada como o triterpeno epi-friedelanol (Kiem et al., 2004). As frações 14 a 22, resultantes da eluição com éter de petróleo/AcOEt nas concentrações de 9:1 e 8:2, foram reunidas, obtendo-se 1,3 g de material que foi sujeito a fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica (30,2 g) utilizando os solventes hexano e AcOEt, puros ou em misturas binárias, seguido de MeOH. Deste fracionamento foram obtidas 68 frações de 10 mL. As frações 21-25 (70,1 mg), resultantes da eluição com hexano/AcOEt 1:1, após recristalização em acetona, resultou no composto 6 (19,2 mg; p.f. 118-120 ºC; lit. 133,0-134,0 ºC), identificado como o triterpeno damara-20,24-dien-3β-ol (Leong & Harrison, 1999). O extrato C (50,3 g) foi submetido a fracionamento cromatográfico sobre 75,2 g de gel de sílica, utilizando CHCl₃, AcOEt e MeOH, como eluentes. A evaporação dos solventes resultou nas frações CHCl₃ (39,6 g), AcOEt (1,4 g) e MeOH (2,9 g). A fração CHCl₃ (39,6 g) foi fracionada sobre 93,8 g de gel de sílica, utilizando os solventes hexano, AcOEt, acetona e MeOH, puros ou em misturas binárias. Este fracionamento resultou em 83 frações de 50 mL, que foram concentradas sob pressão reduzida e analisadas por CCDA. Entre as frações reunidas, na de número 57-78 houve a formação de um precipitado que após adição de hexano/AcOEt 5%, seguido de filtração, resultou no isolamento do composto 7 (500,0 mg; p.f. 259-260 ºC; lit. 276-278 ºC), identificado como o flavonóide nepetina (Agrawal, 1989). A fração 81 (11,3 g), foi acondicionada sobre 70,0 g de gel de sílica e sujeita a fracionamento cromatográfico empregando os solventes hexano, AcOEt, e MeOH, puros ou em misturas binárias, resultando em 106 frações de 30 mL. As frações 77-81, obtidas com AcOEt, foram reunidas após análise em CCDA. Durante a evaporação do solvente ocorreu a formação de um precipitado que foi filtrado, resultando na mistura (8,9 mg) dos glicosídeos sitosterol (8) e estigmasterol (9). A fração AcOEt (1,4 g) foi disposta sobre 21,0 g de gel de sílica e submetida a eluições com os solventes hexano, CHCl₃, AcOEt, acetona e MeOH, puros ou em misturas binárias. Após análise em CCDA, obteve-se as frações: CHCl₃I (410,9 mg) , CHCl₃ II (258,0 mg) CHCl₃/AcOEt 1:1 (84,8 mg), AcOEt/acetona 1:1 (473,1 mg) e MeOH 1(172,2 mg). A fração CHCl₃ II, após cromatografias em Sephadex LH-20 (CH₂Cl₂/MeOH 1:1) forneceu a substância 10 (17,6 mg; p.f. 233-234 ºC; lit. 225,0-227,0 ºC), identificada como o flavonóide isoquercitrina (Markham et al., 1978). O extrato D (16,1 g) foi submetido a cromatografia sobre gel de sílica (34,0 g) utilizando os solventes CH₂Cl₂, AcOEt, acetona e MeOH. A evaporação do solvente resultou nas frações CH₂Cl₂ (1,7 g), AcOEt (3,4 g), acetona (3,1 g) e MeOH (0,9 g). A fração CH₂Cl₂, (1,7 g) foi acondicionada sobre 36,5 g de gel de sílica e eluída com os solventes hexano, AcOEt, acetona e MeOH, puros ou em misturas de escala crescente de polaridade. Foram coletadas 85 frações de 10 mL, que após análise em CCDA foram reunidas com base em seus Rfs. As frações 42-46, obtidas da eluição com hexano-AcOEt 6:4, foram reunidas (58,6 mg) e submetidas a várias colunas em Sephadex LH-20, utilizando uma mistura binária dos solventes acetona/MeOH 1:1, resultando no isolamento do composto 11 (11,0 mg; p.f 150-151 ºC; lit. 167 ºC), identificado como a cumarina 11-hidroxi-11,12-di-hidroobliquina (Bohlmann et al., 1980; Herz et al., 1981).

Teste da atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase

A atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase (AChE), foi realizada através do método de Ellman (1961), modificado por Rhee e colaboradores (2001). Este bioensaio consiste na aplicação das amostras em CCDA, seguida da pulverização da placa com o reagente de Ellman (DTNB) e uma solução de ATCI em tampão apropriado. Em seguida, pulveriza-se a placa com a enzima AChE (3 U/mL). Decorridos aproximadamente 5 min, a inibição enzimática pode ser constatada pela ausência da cor amarela, e concomitante, o surgimento de uma mancha branca. O método de Ellman é um procedimento fidedigno para atividade da acetilcolinesterase e pode ser rotineiramente empregado para avaliar a atividade inibitória de constituintes químicos. Para a realização deste ensaio foram preparadas as seguintes soluções: (A) 50 mM Tris/HCl pH 8 (solução tampão); (B) 50 mM Tris/HCl pH 8, contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA) (solução tampão); (C) 1 mM de ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (DTNB ou reagente de Ellman) e (D) 1 mM de iodeto de acetiltiocolina (ATCI). A enzima AChE (C-3389 sigma) previamente liofilizada foi dissolvida na solução tampão (A) para fazer uma solução estoque de 1000 U/mL. Para se fazer a diluição da enzima utilizou-se a solução tampão (B). Alíquotas de 5 µL dos óleos essenciais I e II dissolvidos em clorofórmio, na concentração de 2 mg/mL, foram aplicados em CCDA (DC-Alufolien, Silicagel 60 F254, 0,2 mm de espessura da Merck). Em seguida pulverizou-se a placa com as soluções (C) e (D). Após completa secagem das soluções, pulverizou-se a placa com a enzima AChE (3 U/mL). Decorridos aproximadamente 5 min, observou-se o desaparecimento da cor amarela e o aparecimento de manchas brancas. Como controle positivo foi usado a fisostigmina.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

A composição química dos extratos hexânico e etanólico de E. ballotifolium, originário do norte do Brasil e Venezuela foi previamente investigada, tendo sido isolados lactonas, sesquiterpenos, derivados do timol, uma cumarina e um triterpeno, o qual na época, não foi caracterizado (Bohlmann et al., 1980; Triana, 1984). Apesar disto resolveu-se investigar os extratos de E. ballotifolium do Nordeste do Brasil, região cujo principal bioma é a caatinga. Conforme os resultados, nenhuma lactona foi isolada, entretanto, triterpenos e flavonóides foram os constituintes predominantes nos extratos de E. ballotifolium, de origem do nordeste do Brasil. Do extrato hexânico das raízes foram isolados os triterpenos friedelanol e damara-20,24-dien-3β-ol, do extrato etanólico foi obtido a cumarina 11-hidroxi-11,12-di-hidroobliquina. Os compostos 2, 5, 6 e 7 estão sendo estão relatados pela primeira vez a partir de E. ballotifolium.

Os óleos essenciais das partes aéreas obtidos das folhas e talos de E. ballotifolium, coletados em abril de 2003, apresentaram rendimentos de 0,11 e 0,03%. A análise por CG-EM permitiu a identificação e a quantificação de onze compostos (Adams, 2007), organizados por ordem de eluição em coluna DB-5, correspondendo a 83,2 e 96,4% da composição química dos óleos (Tabela 1). Foi observado que os óleos essenciais das partes aéreas e talos não apresentaram diferenças na composição química tendo como principais constituintes β-cariofileno (24,9 e 22,2%), espatulenol (17,7 e 12,4%) e epóxi-allo-aromadendreno (23,0 e 23,6%). Os óleos foram predominantemente constituídos de sesquiterpenos, demostrando a ausência de derivados de outras rotas metabólicas como fenilpropanóides e compostos alifáticos, além de cromenos e sesquiterpenos furânicos, encontrados em óleos essenciais de outras espécies de Eupatorium (Albuquerque et al, 2004; Zhang et al, 2008).

A atividade anticolinesterase apresentada pelos óleos essenciais das folhas e talos de E. ballotifolium foram avaliadas em CCDA, frente à enzima acetilcolinesterase. O resultado deste bioensaio mostrou que tanto o óleo essencial das folhas como dos talos foram ativos. Neste ensaio utilizou-se como controle positivo a fisostigmina. Os resultados demonstram o potencial anticolinesterásico dos óleos essenciais de E. ballotifolium como forte candidatos naturais que possam vir a auxiliar no tratamento do mal de Alzheimer.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem as Instituições de fomento CNPq, FUNCAP e PRONEX pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho e ao CENAUREMN na pessoa do Prof. Edilberto Rocha Silveira pela obtenção dos espectros e pelas sugestões na elaboração do manuscrito.

Received 21 November 2008; Accepted 25 June 2010

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Set 2010
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Recebido
  21 Nov 2008
• Aceito
  25 Jun 2010