Homocisteína plasmática total e fator von Willebrand no diabete melito experimental

Resumos

OBJECTIVES: To determine the plasma homocysteine and von Willebrand factor levels as markers of endothelial dysfunction in rats with diabetes mellitus induced by streptozotocin. METHODS: Thirty-five adult male rats (Rattus norvegicus albinus) (weight between 180-200g) were randomized into three groups: control group (n=10), which received no drugs or vehicles; sham group (n=10), which received streptozotocin solution; and diabetic group (n=15), which received streptozotocin. Eight weeks after diabetes mellitus induction, the animals were weighed and anesthesized; blood samples were collected from abdominal aorta for plasma total homocysteine, von Willebrand factor and glucose levels. RESULTS: The experimental model was reproducible in 100% of animals. The mean plasma homocysteine levels were: 7.9 µmol/l (control), 8.6µmol/l (sham) and 6.1µmol/l (diabetic), with difference among the groups (p<0.01). Multiple comparison analysis among the groups showed that values in the diabetic group were lower than in the sham group (p<0.01). The mean von Willebrand factor values were 0.15 U/l (control), 0.16U/l (sham) and 0.18 U/l (diabetic), with difference among the groups (p=0.03). The mean value was higher in the diabetic group than in the control group (p<0.05). Correlation between homocysteine and von Willebrand factor was not observed in the diabetic group. CONCLUSION: Reduced homocysteine levels and increased von Willebrand factor levels were observed in diabetes mellitus induced by streptozotocin; nevertheless, there were no correlations between them and with final glucose levels.

Homocysteine; von Willebrand factor; diabetes mellitus; epidemiology; experimental

ARTIGO ORIGINAL

Homocisteína plasmática total e fator von Willebrand no diabete melito experimental

Renato Delascio Lopes; Lindalva Batista Neves; Vânia D'Almeida; Gleice Margarete de Souza Conceição; Alexandre Gabriel Junior

Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP-EPM - São Paulo, SP

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVOS: Determinar os valores plasmáticos de homocisteína e fator von Willebrand, como marcador de disfunção endotelial, em ratos com diabete melito induzido por estreptozotocina.

MÉTODOS: Trinta e cinco ratos (rattus norvegicus albinus), machos, adultos (180-200 g), randomizados em três grupos: controle (n=10) não receberam agente ou veículo; sham (n=10) receberam solução veículo da estreptozotocina; e diabético (n=15) receberam estreptozotocina. Após oito semanas de indução do diabete melito, os animais foram pesados, anestesiados e tiveram sangue colhido da aorta abdominal para determinação dos valores de homocisteína plasmática total, fator von Willebrand e glicemia.

RESULTADOS: O modelo experimental foi reprodutível em 100% dos animais. A média das concentrações plasmáticas de homocisteína foi: 7,9 µmol/l (controle); 8,6 µmol/l (sham) e 6,1 µmol/l (diabético), com diferença entre os grupos (p<0,01). Pelo método de comparações múltiplas entre os grupos, observou-se que os valores no grupo diabético foram menores que no sham (p<0,01). A média dos valores do fator von Willebrand foi 0,15 U/l (controle), 0,16 U/l (sham) e 0,18 U/l (diabético), com diferença entre os grupos (p=0,03). A média dos seus valores no grupo diabético foi maior que no grupo controle (p<0,05). No grupo diabético não houve correlação entre homocisteína e fator von Willebrand.

CONCLUSÃO: No diabete melito induzido por estreptozotocina constataram-se valores reduzidos de homocisteína e elevados de fator von Willebrand, sem, contudo, haver correlações entre si e com níveis de glicemia final.

Palavras-chave: Homocisteína / sangue, fator de von Willebrand, diabete melito, epidemiologia, experimental.

Introdução

O diabete melito (DM), doença caracterizada fundamentalmente por distúrbio no metabolismo dos hidratos de carbono, cursa habitualmente com macro e microangiopatia, neuropatia periférica, de nervos cranianos e autossômica, que acarretam isoladamente ou associados, importantes complicações clínicas, com elevado índice de mortalidade.

No que diz respeito à vasculopatia, o endotélio é o principal responsável e vários elementos têm sido incriminados pela sua disfunção.

O objetivo deste trabalho é estudar as possíveis alterações dos níveis plasmáticos da homocisteína (He) e do fator von Willebrand (fvW), sabidamente relacionados à patogênese da disfunção endotelial, em ratos portadores de DM induzida por estreptozotocina (STZ).

Métodos

Trata-se de um estudo experimental. Foram utilizados ratos da linhagem rattus norvegicus albinus, Rodentia, mammalia, machos, adultos, pertencentes à mesma faixa etária, com pesos entre 180 e 200 g. Os animais foram pesados no início do experimento e semanalmente até o dia do sacrifício e randomizados em três grupos: Grupo I (controle): os animais permaneceram em regime de alimentação normal e água ad libitum; Grupo II (sham): receberam somente solução veículo da STZ (tampão citrato 0,1M, pH 4,5) e permaneceram em iguais condições locais e de alimentação aos do grupo I; Grupo III (diabete): receberam injeção de STZ (Sigma^® IP).

Para indução do DM utilizou-se STZ (dose única de 60 mg/kg de peso), intraperitoneal, diluída em 0,3 ml de solução tampão citrato 0,1M^1-3. Nas primeiras 48 horas, aos ratos diabéticos foram oferecidas soluções de glicose (2,5% e 5%) substituindo a água, para evitar hipoglicemia por hiperinsulinemia resultante da destruição das células beta do pâncreas. Durante as primeiras 72 horas após administração de STZ, a glicemia foi determinada diariamente, sempre no mesmo horário, para comprovar a reprodutibilidade do método, utilizando-se aparelho Advantage (Roche^®) com sangue obtido por punção da veia da cauda dos animais. Foram considerados diabéticos os ratos cujos valores de glicemia foram iguais ou superiores a 250 mg/dl^1-5.

Após oito semanas de indução do DM, os animais foram pesados, tiveram suas glicemias aferidas e foram submetidos a anestesia com tionembutal (Sigma^®) intraperitoneal (50 mg/kg de peso) para posterior coleta de sangue e sacrifício.

A coleta de sangue foi realizada através de punção de artéria aorta abdominal e 3 ml de sangue foram colocados em tubos contendo EDTA como anticoagulante, centrifugado a 3.000 rpm e o plasma aliquotado em "vails" de 1 ml e acondicionados em congelador a -20ºC até a determinação dos níveis de He total plasmática. O sangue restante foi colocado em tubo seco, centrifugado, e o soro foi aliquotado em "vails" de 1,5 ml, congelados a -20°C, para a determinação do fvWe glicemia.

A determinação da He total plasmática foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), por detecção fluorimétrica, seguindo protocolo padronizado e baseado na metodologia descrita por Pfeiffer e cols.6 e utilizado por Cruz e cols.7. O plasma passou por três etapas de preparação: redução, precipitação de proteínas e derivatização. O sistema utilizado foi da Shimadzu®, constando de auto-injetor modelo SIL-10 Advp, bombas e detector de fluorescência modelo RF – 10AXL. A separação foi com uma coluna Prodigy ODS2, 150 x 3,2 mm com micropartículas de 5 µm (Phenomenex®) e por uma pré-coluna de Adsorbosphere® C18 de 7,5 x 4,6 mm com micro-partículas de 5 µm (Alltech®). A detecção foi feita com o detector ajustado para excitação a 385 µm e emissão a 515 µm.

Para dosar a glicemia de jejum inicial (Glic inicial) e ao término do experimento (Glic final) utilizou-se o método enzimático-colorimétrico, glicose oxidase/peroxidase (GOD PAP-Celm), e considerando-se valores de referência entre 75-99 mg/dl. O fvW foi determinado pela técnica de Elisa, utilizando-se kit von Willebrand factor (DAKO^®).

O trabalho foi avaliado e devidamente aprovado pelo CEP 1341/05. Durante a análise estatística, para avaliar se as médias das variáveis em estudo eram as mesmas nos três grupos, utilizou-se à análise de variância (ANOVA) com o fator fixo (grupo) e três níveis (controle, sham e diabete). Para a variável glicemia final, utilizou-se a transformação inversa, para estabilizar a variância. Quando a ANOVA mostrou que as médias dos grupos não eram idênticas, utilizou-se o procedimento de comparações múltiplas de Tukey para identificar quais grupos eram responsáveis por essas diferenças. Foram construídos diagramas de dispersão e calculados os coeficientes de correlação de Pearson para avaliar a presença de associação linear entre as variáveis em estudo. O nível de significância foi fixado em 5% em todas as análises.

Resultados

O modelo experimental de DM foi reprodutível em 100% dos animais. A tabela 1 mostra valores da média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo para as variáveis em estudo em cada grupo. As figuras de 1 a 4 contêm os box-plots para essas variáveis.

A tabela 1 também apresenta o nível descritivo da análise de variância empregada para comparar as médias dos três grupos, para cada variável. Segundo essa análise, não houve diferença entre as médias da glicemia inicial nos três grupos (p=0,23). Para as demais variáveis (He plasmática, fvW e concentração sérica de glicemia no dia do sacrifício), as médias não foram iguais nos três grupos (p<0,01, p=0,03 e p<0,01, respectivamente).

Segundo o procedimento de comparações múltiplas de Tukey, a He média foi menor no grupo de animais diabéticos do que nos grupos controle e sham, não havendo diferença entre as médias dos grupos controle e sham (p<0,05). Em relação ao fvW, a média foi maior no grupo diabete do que no controle; nenhuma outra diferença entre os grupos foi detectada (p<0,05). Para a glicemia final, a média foi maior no grupo diabete do que nos grupos controle e sham, não havendo diferença entre as médias dos grupos controle e sham (p<0,05).

A tabela 2 apresenta os coeficientes de correlações de Pearson entre as variáveis em estudo para o grupo diabete. Não se observaram correlações entre as variáveis: He plasmática, fvW e glicemia ao término do experimento.

Discussão

O DM, doença responsável por inúmeras complicações cardíacas e vasculares, apresenta como elemento importante na sua fisiopatologia a disfunção endotelial, e várias alterações bioquímicas plasmáticas são tidas como responsáveis.

A He, relacionada pela primeira vez em 1969 como causa de aterosclerose⁸, vem alcançando importância como fator de risco para doença arterial coronária^9-15,sendo intrigante sua possível participação na patogênese da disfunção endotelial. Aminoácido formado exclusivamente a partir da desmetilação da metionina da dieta ou do catabolismo, contém um grupamento tiol (SH-) e não participa da formação de proteínas¹⁶. Apenas 2% a 5% da He plasmática livre são encontradas em sua forma reduzida, e 70% a 80% circulam ligadas a proteínas plasmáticas, principalmente albumina.

A prevalência da hiper-homocisteinemia (HHe) é de 5% a 7% na população geral e níveis intermediários são encontrados em 13% a 47% dos indivíduos com doença vascular aterosclerótica sintomática^17-19. Várias publicações correlacionam HHe com doença arterial coronária, cerebral e periférica, assim como trombose venosa, e tem se mostrado importante fator de risco cardiovascular independente dos demais²⁰.

Metanálise com mais de 4.000 pacientes envolvendo 27 estudos mostrou que a partir de valores de He acima de 10 µmol/l, o acréscimo de 5 µmol/l de He circulante associa-se a maior risco para doença cardiovascular. Aumento de 5 µmol/l de He corresponde a aumento de 20 mg/dl de colesterol total plasmático com maior probabilidade de infarto agudo do miocárdio²¹.Graham e cols.²² concluíram que HHe em jejum ou pós-sobrecarga de metionina corresponde a risco cardiovascular semelhante ao da hiperlipemia e do tabagismo, embora inferior ao da hipertensão arterial sistêmica.

Em 1998, Folsom e cols.²³, em importante pesquisa, colocam em dúvida a participação da HHe na fisiopatologia da doença arterial coronária. Contudo, seus resultados não encontram sustentação frente às pesquisas mais recentes²⁴.

A patogenia da lesão vascular determinada pela HHe inclui lesão da célula endotelial, crescimento da musculatura lisa vascular, maior adesividade plaquetária, aumento da oxidação do LDL-colesterol com deposição na parede vascular e ativação direta da cascata da coagulação²⁰. No entanto, ainda não está bem claro por qual mecanismo fisiopatológico a He pode promover aterotrombose²⁵.

O endotélio, principal órgão endócrino do organismo, é de grande importância em inúmeras doenças degenerativas e inflamatórias. Dentre os vários métodos para aquilatar sua disfunção, o fvW tem se mostrado muito eficiente e com ótima sensibilidade. Células endoteliais e megacariócitos sintetizam, armazenam e secretam o fvW. Essa secreção aumenta quando as células endoteliais são estimuladas ou lesadas e seus valores podem aumentar de duas a 10 vezes em indivíduos doentes. O fvW liga-se ao colágeno e a outros componentes da parede vascular e, portanto, serve de mediador da adesão das plaquetas ao subendotélio dos vasos lesados²⁶.

A lesão vascular expõe a matriz de colágeno subendotelial, à qual se liga ao fvW circulante no plasma, que por sua vez se liga à porção extracelular de glicoproteínas da membrana da plaqueta (GPIb), cuja porção intracelular está ligada à filamina do citoesqueleto plaquetário. Tal interação, conhecida por adesão plaquetária, é suficiente para deflagrar dois fenômenos nas plaquetas: a contração celular e a alteração conformacional^27-29.

No DM, em decorrência de fatores genéticos e bioquímicos plasmáticos, a disfunção endotelial é precoce e determina o início e progressão da doença vascular, levando à micro e macroangiopatia diabética. Em estudo recente, Becker e cols.²⁵ objetivaram determinar o quanto a He estava associada com a disfunção endotelial em ratos diabéticos e não-diabéticos e se essa disfunção poderia ser estimada pelos níveis plasmáticos de fvW, e concluíram que a relação entre He e a aterotrombose não pode ser explicada pela associação da homocisteína com fvW. Na busca de um elemento que possa ser um marcador desse comprometimento, o fvW passa a ter importante interesse clínico, podendo ser considerado um marcador sérico de disfunção endotelial no DM.

Para indução do DM, nesse experimento foi utilizada a STZ por ser o modelo que representa melhor reprodutibilidade dos resultados obtidos em relação aos da literatura^30-35. Os resultados deste trabalho demonstram que no DM, em decorrência das alterações metabólicas, dentre as quais a hiperglicemia é a mais importante, há modificações nos níveis plasmáticos de He e do fvW.

À semelhança dos resultados do presente estudo (tab. 1), os trabalhos de Jacobs e cols.³⁶, Wollesen e cols.³⁷ e Veldman e cols.³⁸ demonstram, no diabete experimental em ratos, níveis mais baixos de He.

A He, por lesar diretamente o endotélio, estimula a proliferação celular e a produção de colágeno, perpetua o processo inflamatório crônico vascular, altera o relaxamento arterial endotélio-dependente por meio do óxido nítrico, aumenta o estresse oxidativo, ativa fatores de coagulação e inibe a atividade da proteína C. Logo, seria de esperar no diabete, pela extensa lesão endotelial, valores elevados de He. Contudo, na presença de hiperglicemia, há aumento da filtração glomerular^37-38, e as alterações metabólicas na via de formação da He³⁶ resultam em valores mais baixos dessa, o que corrobora para a assertiva de que a He seja fator de risco para disfunção endotelial e não marcador específico de lesão do endotélio no DM. Pode-se inferir que valores normais ou elevados de He no DM estejam relacionados com lesão endotelial.

O fvW vem sendo otimizado como marcador de disfunção endotelial. No presente trabalho, os seus valores (tab. 2) foram significativamente mais elevados nos ratos diabéticos, o que nos leva a admitir ser ele, fator importante na disfunção endotelial presente no DM.

Não foi observada correlação entre He e fvW (tab. 2), o que permite concluir que nesse experimento a relação entre He e possível aterotrombose em ratos diabéticos não pode ser explicada pela associação entre He e fvW.

Conclusão

Os valores de He foram mais baixos nos ratos diabéticos, podendo iniciar e perpetuar a lesão endotelial, não sendo, portanto, marcador de sua disfunção. Os níveis elevados de fvW, por esse ser marcador de disfunção endotelial, permitem inferir a presença de lesão vascular no DM. Não houve correlação entre glicemia final, He e fvW nos ratos diabéticos.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes.

Artigo recebido em 02/05/06, revisado recebido em 12/06/06; aceito em 12/06/06.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Abr 2007

Histórico

• Aceito
  12 Jun 2006
• Revisado
  12 Jun 2006
• Recebido
  02 Maio 2006