Similaridade genética de acessos de mangueira de diferentes origens geográficas avaliadas por marcadores AFLP

Genetic similarity of mango accessions of different geographic origins evaluated with AFLP markers

ARTIGOS

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Similaridade genética de acessos de mangueira de diferentes origens geográficas avaliadas por marcadores AFLP¹

Genetic similarity of mango accessions of different geographic origins evaluated with AFLP markers

Carlos Antonio Fernandes Santos^I; Francisco Pinheiro Lima Neto^II; Marciene Amorim Rodrigues^III; João Gomes da Costa^IV

^IEmbrapa Semi-Árido. Caixa Postal 23. 56302-970. Petrolina, PE. Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIEmbrapa Semi-Árido. Caixa Postal 23. 56302-970. Petrolina, PE. Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIIEmbrapa Semi-Árido. Caixa Postal 23. 56302-970. Petrolina, PE. Brasil. E-mail: [e-mail]

^IVEmbrapa Tabuleiros Costeiros. Av. Beira Mar, 3250 CEP 49025-040. Aracaju, SE. E-mail: [e-mail]

RESUMO

As relações genéticas de 105 acessos de diferentes origens geográficas do banco de germoplasma de mangueira da Embrapa foram determinadas com base no marcador AFLP, de forma a orientar trabalhos de melhoramento e manejo de recursos genéticos da espécie para a região Semi-Árida brasileira. Foram ainda incluídos dois acessos de duas espécies do gênero Mangifera, como "outgroup". O DNA dos acessos foi extraído pelo método do CTAB, as reações de AFLP foram realizadas para os iniciadores EcoRI/MseI e as bandas polimórficas foram analisadas para construção de fenograma, baseando-se no coeficiente de similaridade de Jaccard. Foram obtidas 157 e 54 bandas de AFLP polimórficas e monomórficas, respectivamente, em 13 combinações de iniciadores. O valor co-fenético do fenograma foi estimado em 0,81. Foram observados cinco grupos: 1) cultivares como Amrapali, Malika, híbridos Embrapa-Cpac e algumas variedades americanas formando um grupo; 2) grupo formado, predominantemente, por cultivares americanas, com algumas inclusões de híbridos sul-africanos e brasileiros; 3) grande grupo formado por cultivares brasileiras, com algumas inclusões de cultivares australianas, indianas e americanas; 4) grupo formado por algumas variedades tipo Espada, Rosa e acessos de diferentes origens; e 5) grupo formado por M. foetida e M. similis. Os acessos Carabao e Manilla apresentaram a maior similaridade, 97%. Os acessos estudados apresentaram similaridade superior a 51%, evidenciando a alta variabilidade genética da coleção de germoplasma de mangueira estudada.

Termos para indexação:Mangifera indica, divergência, germoplasma de manga.

ABSTRACT

The genetic relationship among 105 mango accessions of different geographic origins of the Embrapa germplasm collection was estimated based on AFLP marker in order to orient breeding and management of genetic resource activities of this species to the Brazilian Semi-Arid region. Two additional accessions of other species of the Mangifera genus were also included as outgroup. The DNA of the accessions was extracted according to the CTAB protocol, the AFLP reactions were performed to EcoRI/MseI primers and the polymorphic bands analyzed to built a phenogram based on the Jaccard similarity coefficient. A hundred and fifty-seven and fifty-four polymorphic and monomorphic bands, respectively, were obtained from 13 AFLP primer combinations. The phenogram cophenetic value was estimated in 0.81. Five groups were observed: 1) Amrapali, Malika, Embrapa-CPAC hybrids and some American varieties forming a group, 2) other built, predominantly, by American varieties, with some inclusions of South African and Brazilian hybrids, 3) a large group composed by Brazilian accessions, with some inclusion of Australian, Indian and American accessions, 4) a group with some accessions of Espada, Rosa and others of different origins, and 5) a group formed by M. foetida and M. similis. Carabao and Manilla presented the largest similarity, 97%. The studied accessions presented similarity greater than 51%, suggesting a high genetic variability of the studied mango germplasm collection.

Index terms:Mangifera indica, diversity, mango germplasm.

INTRODUÇÃO

A mangueira (Mangifera indica, 2n=2x=40) é uma espécie originária da parte oriental da Índia (Duval et al., 2005), sendo que Índia, China, México, Tailândia e Filipinas respondem por 70% da produção mundial, enquanto México, Brasil, Paquistão, Filipinas, Índia e Holanda são responsáveis por quase 70% das exportações de mangas (Wyzykowsky et al., 2002).

É provável que o cultivo da mangueira tenha-se iniciado na Índia, onde mais de 1.000 variedades já foram encontradas, resultantes de seleções dentro de populações de polinização cruzada, que estão catalogadas no Instituto de Pesquisa Hortícola daquele país (Pinto et al., 2005). Comerciantes espalharam o cultivo do centro de origem e domesticação para outras regiões tropicais e subtropicais. Portugueses introduziram a cultura no oeste e no leste da África e no Brasil. Do Brasil, provavelmente, foi levada para as ilhas do Caribe, de onde os espanhóis a introduziram no México e nas Filipinas. No século XIX, a mangueira foi introduzida na Flórida-EUA, primeiro do Caribe e depois da Índia (Viruel et al., 2005).

Significativo avanço no desenvolvimento de cultivares de mangueira ocorreu com as introduções e seleções dentro de progênies resultantes de polinização aberta no sul da Flórida-EUA, de tal forma que a região passou a ser considerada como um centro secundário de diversidade genética da espécie (Litz & Gómez-Lim, 2005; Schnnel et al., 2006). As cultivares da Flórida são únicas, porque elas são resultantes de cruzamentos entre tipos indianos e tipos do sudeste da Ásia (Schnnel et al., 2006). O comércio internacional de manga é dominado pelas cultivares da Flórida, como Haden, Tommy Atkins, Keitt e Kent, entre outras (Litz & Gómez-Lim, 2005).

Além da classificação segundo o local de origem, variedades de mangueira são também classificadas de acordo com o modo de reprodução, em monoembriônicas e poliembriônicas. As sementes das primeiras têm apenas um embrião zigótico, enquanto as do segundo tipo apresentam, além do embrião zigótico, outros de origem nucelar (Viruel et al., 2005).

As primeiras introduções de mangueira no Brasil, no século XVI, foram de tipos poliembriônicos, de frutos fibrosos, também conhecidos como raça filipínica, e só na segunda metade do século XX foram introduzidas as cultivares melhoradas na Flórida-EUA, consideradas da raça indiana, geralmente monoembriônicas (Pinto et al., 2002-a).

Relações genéticas entre cultivares de mangueira têm sido estabelecidas com marcadores isoenzimáticos (Degani et al., 1990), com marcadores moleculares dominantes, como RAPD (Schnell et al., 1995; Lopez-Valenzuela et al.,1997) e AFLP (Eiadthong et al., 2000; Kashkush et al., 2001), e, mais recentemente, com marcadores moleculares codominantes, a exemplo dos microssatélites (Viruel et al., 2005; Schnnel et al., 2006). Apesar da dominância e da identificação de apenas alelo em cada loco, o marcador AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) é considerado uma poderosa ferramenta para análises de diversidade, devido à reprodutibilidade, à robustez, à geração de poucos artefatos e à ampla cobertura do genoma, apresentando resultados congruentes em várias situações com marcadores microssatélites (Meudt & Clarke, 2007).

O objetivo do presente trabalho foi determinar as relações genéticas, com base no marcador AFLP, dos acessos do banco de germoplasma de mangueira da Embrapa Semi-Árido, de forma a orientar trabalhos de melhoramento genético e de manejo de recursos genéticos da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Material das plantas: Foram coletadas folhas sadias de 112 acessos do banco ativo de germoplasma de mangueira da Embrapa Semi-Árido, instalado na Estação Experimental de Mandacaru, Juazeiro-BA. Duas outras espécies do gênero Mangifera, M. foetida e M. similis foram incluídas para análise, como "outgroup" (Tabela 1). As folhas foram armazenadas em freezer de -80°C até o momento da extração de DNA.

Extração de DNA, reações de AFLP e análise dos dados - O DNA foi extraído das folhas usando o protocolo CTAB 2x de Doyle & Doyle (1990), modificado para: 6.000 e 10.000 rpm na primeira e na segunda centrifugação, respectivamente; beta-mercaptoetanol a 2% e incubação a 60°C, durante 30 min, para todas as amostras. Após a adição do tampão Tris-EDTA, a solução de DNA foi tratada com RNAse para remover RNAs co-isolados. A quantificação e a análise de integridade do DNA foram realizadas em gel de agarose a 0,8%, seguido de armazenamento das amostras de DNA a -20°C.

O DNA genômico foi diluído para 30 ng/mL e duplamente digerido com as combinações de enzimas de restrições EcoRI e MseI. A programação do Termociclador para amplificações pré-seletivas consistiu de 20 ciclos a 94°C, durante 30 s, 56°C durante 1 min e 72°C durante 1 min. Cada reação foi então diluída 20 vezes em água ultrapura e armazenada em geladeira. Foram realizadas reações seletivas de amplificação para um volume final de 10 µL, de acordo com as concentrações: 0,2 µM do primer da EcoRI, 0,3 µM do primer da MseI, 0,2 mM de dNTPs, 1x tampão de PCR, 2,5 mM de MgCl2, 0,05 unidades de Taq DNA Polimerase (Biosystem, Paraná) e 2,0 µL do DNA pré-amplificado. A programação do termociclador para as amplificações seletivas consistiram de: a) um ciclo de 94°C, durante 30 s, seguido de 65°C, durante 30 s, e de 72°C, durante 60 s, repetidos 13 vezes e com a temperatura de anelamento de 65°C, diminuindo 0,7°C no ciclo subseqüente; b) 23 ciclos a 94°C, por 30 s, 56°C, durante 30 s, e 72°C, durante um min.

As reações de PCR foram aquecidas durante 3 min a 94°C, na presença de formamida, e imediatamente colocadas sob gelo antes da aplicação nos géis de poliacrilamida. A corrida de eletroforese foi realizada por um período de 2 h, a 60 W. Os géis foram corados com nitrato de prata conforme descrito por Creste et al. (2001). Todas as atividades foram realizadas no Laboratório de Genética da Embrapa Semi-Árido, Petrolina-PE.

Para anotação das bandas, foi adotado o seguinte procedimento: um para presença, zero para ausência e nove para falha na reação. Foram realizadas duas anotações das bandas: a primeira diretamente na placa de vidro de AFLP e outra, rechecagem, no gel escaneado, com apoio do software PhotoShop, mantendo-se a segunda anotação, em casos de não-concordância. Acessos que apresentaram mais de 10% de falhas foram excluídos das análises. O índice de similaridade de Jaccard foi adotado para estimar a distância para cada par individual dos acessos estudados. A matriz de similaridade foi usada para a construção do fenograma, de acordo com o Método de Agrupamento não-Ponderado, com base na Média Aritmética UPGMA (Sneath & Sokal, 1973), disponível no software NTSYS- (Rohlf, 1989). A correlação co-fenética entre a matriz de valores co-fenéticos e a matriz de similaridade foi estimada para inferir-se sobre a adequação do fenograma gerado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram obtidas 157 e 54 bandas polimórficas e monomórficas, respectivamente, de AFLP, em 13 combinações de iniciadores (CI) EcoR1/Mse1, com média de 12,1 marcas polimórficas/CI. As CIs produziram os seguintes números de bandas polimórficas: AGC/CTT (07), AGG/CTT (9), ACA/CCC (9), AGG/CTC (15), ACC/CTC (11), ACC/CAC (15), ACT/CTT (8), ACA/CTC (15), AAC/CCC (14), ACG/CAC (10), AAA/CTC (13), AAA/CCC (15) e AGC/CTA (16).

A correlação co-fenética entre a matriz dos valores co-fenéticos e a matriz de similaridade foi de 0, 81, indicando que o fenograma produzido (Fig. 1) foi uma boa representação dos dados de AFLP. Outra boa indicação do ajuste do fenograma foi a formação de um grupo a parte com os dois acessos do gênero Mangifera, M. foetida e M. similis.

Os acessos Irwin, Heidi, Umbu, Maya, Dama de Ouro, Pingo de Ouro DPV, 65 e Winter (Tabela 1) foram excluídos da análise porque apresentaram mais do que 10% de falhas do número total de bandas polimórficas anotadas. Warburton & Crossa (2000) sugeriram a remoção de indivíduos ou de marcadores quando o número de falhas for superior a 15%.

O fenograma apresentou cinco grupos (Fig. 1): 1) grupo formado por cultivares indianas, como Amrapali, Malika, oito híbridos Cpac e seguindo até Van Dike; 2) grupo formado, predominantemente, por cultivares americanas (de 'Scuper Many' até 'Chene'); 3) grande grupo formado por cultivares brasileiras (de Hilda até Papo-de-Peru), com algumas inclusões de cultivares australianas, indianas e americanas; 4) outro nível seqüencial de 'Pêssego' até 'Black Java'; 5) um grupo formado pelos dois acessos: M. foetida e M. simillis, incluídos neste estudo como 'outgroup' prévios, para inferências sobre a validade do fenograma construído.

O agrupamento formado por Malika, Amrapali, oito genótipos tipo Cpac (incluindo Lita e Ômega) e cultivares como Tommy Atkins e Van Dyke (Fig. 1) reflete o uso das cultivares indianas e americanas como parentais do programa de melhoramento da Embrapa Cpac (Tabela 1) (Pinto et al., 2002-b).

O agrupamento 2 apresenta, além das variedades americanas, inclusões de dois híbridos sul-africanos (Chene e Neldica) e um brasileiro (Beta), bem como uma variedade indiana Dasherari, o que deve refletir, além da origem geográfica, a influência do "pool' gênico indiano na formação das cultivares americanas e nos três híbridos mencionadas (Fig. 1). Os grupos 1 e 2 apresentaram o maior número de cultivares monoembriônicas, pois foram formados por cultivares americanas, indianas e híbridos derivados (Schnnel et al., 2006; Pinto et al., 2002-b). Estudos com marcadores que resultaram nestes grupos poderiam auxiliar na identificação de marcas associadas exclusivamente à monoembrionia, como sugerido por Schnell e Knight (1992) para marcadores isoenzimáticos.

As cultivares Haden, Haden 2H e Haden Rosa, agrupadas com similaridades maiores do que 80% no grupo 2, são, provavelmente, resultantes de recombinações sexuadas, porque os 20% de dissimilaridade verificados dificilmente poderiam ser explicados por mutações somáticas. Viruel et al. (2005) reportaram resultados semelhantes para 'Davis Haden', que tem sido erroneamente considerada como sendo uma mutação somática de 'Haden', mas que, segundo os autores, a hipótese mais provável é que a variedade Davis Haden seja uma progênie da Haden.

Das 53 cultivares brasileiras, oriundas de recombinações genéticas espontâneas, 43 foram agrupadas quase que seqüencialmente no terceiro grupo, sendo que 'Salitre' e 'CPR' foram as que apresentaram a maior similaridade dentro deste grupo (Fig. 1). Segundo Pinto et al. (2002-b), as cultivares brasileiras são resultantes das introduções de genótipos filipínicos, geralmente fibrosos e poliembriônicos, efetuadas pelos portugueses no século XVI. Dentro do terceiro agrupamento, observaram-se algumas cultivares de origem semelhante formando subgrupos, como: 1) Celebration, Kensigton e R2E2, de origem australiana; 2) Carabao e Manilla, da raça filipínica, apresentaram a maior similaridade (97%), sugerindo que são quase geneticamente idênticas, corroborando os estudos de RAPD de López-Valenzuela et al. (1997). Ataulfo, outra cultivar mexicana de origem filipínica, posicionou-se próxima de Manilla e Carabao, com 68% de similaridade.

No quarto agrupamento, próximo da base do fenograma, foram incluídas algumas 'Espadas' e a 'Rosa', que, segundo Pinto et al. (2002-a), estão entre as cultivares mais antigas e comuns brasileiras (Fig. 1). Essas duas cultivares apresentam, ainda, como característica comum, a reprodução poliembriônica (Pinto et al., 2002-b). Neste agrupamento, foi incluído também a 'Palmer', que é uma cultivar americana monoembriônica, que tem como um dos progenitores a 'Haden' (Schnell et al. 2006). A inclusão desta cultivar neste agrupamento permanece sem uma explicação genética lógica, sendo provável que o acesso estudado não seja um clone da 'Palmer' americana ou que tenha sido erroneamente identificada.

Todos os 105 acessos estudados, de diferentes origens geográficas e diferentes tipos de reprodução, apresentaram similaridade superior a 51% (Fig. 1), o que evidencia a alta variabilidade genética da coleção de germoplasma de mangueira estudada (Tabela 1). Schnell et al. (1995), analisando 25 acessos de cultivares majoritariamente Floridiana (EUA), encontraram similaridade superior a 64%, enquanto Viruel et al. (2005) observaram similaridade superior a 33% em 28 acessos de mangueira de diversas origens, o que também evidencia a alta variabilidade genética da mangueira.

Este é o primeiro estudo sobre a análise da similaridade genética entre um grande número de acessos de mangueira, envolvendo genótipos derivados de introduções no Brasil, no século XVI, provavelmente por sementes, bem como outros introduzidos mais recentemente, no século XX, provavelmente por multiplicação assexuada, e servirão de referências para trabalhos de manejo de germoplasma, hibridações controladas, e até mesmo para escolha de cultivares polinizadoras para outras que apresentam problema de abortamento floral, como é o caso da 'Haden'.

CONCLUSÕES

1-Foram observados quatro grupos entre os 105 acessos de mangueira estudados, sendo que dois acessos do gênero Mangifera formaram grupo adicional externo no fenograma. Das 53 cultivares brasileiras estudadas, oriundas de recombinações genéticas espontâneas, 43 cultivares constituíram um grupo.

2-Os acessos Carabao e Manilla, da raça filipínica, apresentaram a maior similaridade, 97%.

3-Os acessos estudados, de diferentes origens e tipo de reprodução, apresentaram similaridade superior a 51%, evidenciando a alta variabilidade genética da coleção de germoplasma de mangueira estudada.

AGRADECIMENTOS

À FACEPE, pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.

Recebido em: 08-11-2007. Aceito para publicação em: 29-04-2008.

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1

(Trabalho 262-07).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Nov 2008
• Data do Fascículo
  Set 2008

Histórico

• Aceito
  29 Abr 2008
• Recebido
  08 Nov 2007