Síntese de 1,3,5-triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente a Artemia Salina leach

Synthesis of substituted 1,3,5-triazines and toxicity evaluation against Artemia Salina leach

1,3,5-triazines; brine shrimp bioassay; toxic activity

ARTIGO

Síntese de 1,3,5-triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente a Artemia Salina leach

Márcia Ferreira Cavalcante, Márcia Cristina Campos de Oliveira, Javier Rincón Velandia e Aurea Echevarria

Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - 23851-970 - Seropédica - RJ

Recebido em 22/9/98; aceito em 10/6/99

Synthesis Of Substituted 1,3,5-Triazines And Toxicity Evaluation Against Artemia Salina Leach. The synthesis of ten symmetrically and unsymmetrically substituted 1,3,5-triazines by Phase Transfer Catalysis (PTC) method is described. Their toxicities were determined against Artemia salina Leach. The LD₅₀ values have also been obtained for these compounds.

Keywords: 1,3,5-triazines; brine shrimp bioassay; toxic activity.

INTRODUÇÃO

A avaliação da bioatividade de compostos orgânicos, sejam eles provenientes de plantas ou de síntese, tem sido pouco viável em laboratórios tradicionais de química. Geralmente, a não ser que existam programas de colaboração com biólogos ou farmacólogos, os laboratórios de química não estão adequadamente equipados para a realização de bioensaios de rotina utilizando animais ou tecidos e órgãos isolados. A necessidade de realizar ensaios com procedimentos simples e rápidos, levou à busca de novos testes.

A letalidade de organismos simples tem sido utilizada para um rápido e relativamente simples monitoramento da resposta biológica¹, onde existe apenas um parâmetro envolvido: morte ou vida. Os resultados podem ser facilmente tratados estatisticamente. O ensaio de letalidade permite a avaliação da toxicidade geral e portanto é considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de compostos com potencial atividade biológica². Um dos animais que tem sido utilizado nestes bioensaios é uma espécie de crustáceo marinho, Artemia salina Leach.

O primeiro trabalho relativo ao uso de camarão marinho (nome normalmente utilizado) em bioensaios foi publicado em 1956³ e, a partir daí inúmeros artigos tem sido reportados na literatura em estudos ambientais^4,5, utilizando produtos e toxinas naturais além de extratos de plantas^1,6 e tem sido proposto como teste padrão por VanHaecke e Persoone⁷.

Assim, o bioensaio de letalidade de Artemia salina Leach, foi utilizado no monitoramento da toxicidade de 1,3,5-triazinas substituídas.

As triazinas são compostos heterocíclicos cuja síntese tem despertado interesse em função de suas variadas e úteis aplicações. Koopman e Daams⁸ investigaram as atividades herbicida e fungicida de várias 2-(amino)-4,6-dicloro-1,3,5-triazinas, sendo a partir daí sintetizados diversos outros derivados de importância na área agrícola. A partir da década de 80, intensificaram-se os estudos desses compostos devido a descoberta de Kobayashi⁹ que preparou a 2,4-dicloro-6-(N,N-dimetilamino)-1,3,5-triazina revelando ser inibidora da enzima aromatase, sendo usada como droga anti-câncer. Outras aplicações para esses compostos também tem sido reportadas na literatura recente, como por exemplo, sua utilização como corantes¹⁰ e em colunas com fase estacionária quiral em CLAE para separação enantiomérica de aminoálcoois e aminoácidos¹¹.

Neste trabalho relatamos a preparação de dez compostos, 1-10 e, os resultados da avaliação de toxicidade utilizando o bioensaio de letalidade com Artemia salina Leach.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram sintetizados dez derivados 1,3,5-triazínicos utilizando-se técnica de catálise por transferência de fase (CTF), sendo que 2, 3 e 10 são novos e os demais, 1, e 4 - 9, já descritos na literatura, obtidos porém através de outra metodologia¹². A Figura 1 mostra as estruturas das substâncias sintetizadas.

A utilização da metodologia de CTF mostrou-se eficiente, rendimentos entre 75-99%, facilitando o isolamento e purificação dos produtos. O catalisador éter de coroa, 18-coroa-6, com dimensões específicas para a captura ideal do íon potássio¹², permite o aumento exacerbado da basicidade do carbonato de potássio utilizado para remover o próton do intermediário formado na reação de substituição nucleofílica. O emprego da CTF favoreceu a seletividade em função da estequiometria utilizada para o reagente nucleofílico, o que não foi observado com a metodologia tradicional com a qual se obteve mistura praticamente equimolar dos produtos mono e di-substituídos, além de apresentar menor facilidade na execução, sendo necessário o uso de atmosfera inerte. Os compostos 2, 5 e 8 também foram obtidos pela metodologia tradicional¹³,ou seja à partir da reação do cloreto cianúrico e as respectivas aminas em benzeno seco a refluxo sob atmostera de nitrogênio, obtendo-se rendimentos em torno de 15% (85, 80 e 90%, respectivamente por CTF), após a purificação por cromatografia em coluna de sílica gel.

Os compostos sintetizados foram testados quanto à toxicidade geral utilizando o bioensaio de letalidade frente a Artemia salina Leach².A toxicidade à Artemia salina, foi determinada através da dose letal de 50% (DL₅₀) para os microcrustáceos.

Os derivados 1,3,5-triazínicos foram ensaiados em 4 concentrações diferentes em tubos de ensaio contendo água do mar artificial e 10 naupilis. As larvas vivas e mortas foram contadas após 24 h e os valores de DL₅₀ determinados à partir das equações obtidas por regressão linear. Os ensaios foram realizados em quintuplicata, assim como o ensaio controle. A Tabela 1 indica os valores de DL₅₀ obtidos.

Comparando-se os valores de DL₅₀ (Gráfico 1), podemos observar a maior toxicidade para o derivado 10 seguido dos derivados mono-subsitutídos (1, 4 e 7). Os compostos 6 e 9, apresentaram-se parcialmente solúveis no meio utilizado para os ensaios, não permitindo a determinação dos valores de DL₅₀. A utilização de "tween 80" em DMSO à 2% (v/v), facilitou a solubilização dos compostos heterocíclicos para posterior adição de água de mar artificial e, o bioensaio controle, indicou que as larvas não foram afetadas pela composição da mistura empregada como solvente.

A literatura relata que existe uma correlação entre a toxicidade geral frente a Artemia salina e a citotoxicidade diante de linhagens celulares humanas de tumores sólidos¹⁴.Estudos experimentais mostram que para uma determinada droga, sua DL₅₀ referente a toxicidade frente à Artemia salina é 10 vezes maior do que sua dose efetiva (DE₅₀) obtida para a citotoxicidade frente às linhagens celulares de tumores sólidos¹⁴. Os resultados obtidos mostraram-se interessantes, particularmente com os derivados 4 e 10, que em função de seus valores de DL₅₀, permitem a previsão de apresentarem potencial atividade citotóxica.

CONCLUSÕES

A metodologia empregando a catálise por transferência de fase foi adequada e mais eficiente que a tradicionalmente utilizada na literatura para a preparação dessa classe de compostos. O bioensaio utilizando a letalidade da Artemia salina Leach, como parâmetro para avaliação da toxicidade geral, apresentou-se simples e eficiente, indicando resultados interessantes para os compostos ensaiados, remetendo-nos a posteriores estudos da citotoxicidade, principalmente para os derivados com menor DL₅₀.

PARTE EXPERIMENTAL

Os pontos de fusão foram determinados em aparelho tipo Kofler e não foram corrigidos. Os espectros de infra-vermelho foram obtidos em espectrofotômetro Perkin-Elmer modelo 1410, utilizando-se pastilha de KBr ou filme líquido. Os espectros de RMN foram obtidos em espectrofotômetro da Bruker modelo AC-200 operando a frequência de 200 MHz para hidrogênio e 50,3 MHz para o carbono, utilizando-se como solvente CDCl₃. Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro da Hewlett-Packard, modelo 5989, acoplado à cromatógrafo gasoso (CG-EM), com coluna capilar SE-54. A análise elementar foi determinada em analisador da Perkin-Elmer, modelo 2400 CHN.

Parte Química

As 1,3,5-triazinas substituídas foram preparadas a partir do cloreto cianúrico (20 mmol), K₂CO₃ (20 mmol) e éter de coroa 18-coroa-6 (0,6 mmol) em benzeno, à temperatura ambiente com gotejamento do nucleófilo, 20 mmol para os produtos mono-substituídos (1, 4, 7) com 2 h de agitação; em benzeno à refluxo com 40 mmol do nucleófilo para os produtos di-substituídos (2, 5, 8) com 4 h de reação e em decalina à refluxo com 60 mmol do nucleófilo para os tri-substituídos (3, 6, 9) com 4 h de reação. A 1,3,5-triazina substituída não-simetricamente (10) foi obtida em etapas pelo mesmo procedimento das mono- e di-substituídas utilizando 20 mmol de propanol-1 em 10 h de reação, sendo após o isolamento tratada com 20 mmol de propanotiol-1 em 2 h de reação em benzeno a refluxo. O produto 10 foi obtido pelo tratamento da triazina di-substituída não-simetricamente, com 20 mmol de pirrolidina e demais reagentes e condições similares aos simetricamente substituídos. Os produtos foram isolados através de decantação e, após a adição de clorofórmio e carvão ativo, purificados por filtração em coluna com sílica gel, utilizando-se clorofórmio como eluente, posteriormente evaporado permitindo a cristalização dos derivados triazínicos.

1 [2,4-dicloro-6-(1-pirrolidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 95%; p.f. 98^oC (lit.¹³ p.f. 98-9^oC); IV (cm^-1) 2972-2874, 1564, 1238, 795; RMN ¹H, d 1,96 (4H, dq, CH₂CH₂N); 3,59 (4H, dt, CH₂-N); RMN ¹³C, d 169,37 (C-2, 4), 162,17 (C-6), 47,13 (C-1'), 24,87 (C-2'); CG-EM, m/z (M^+.) 219.

2 [2-cloro-4,6-bis(1-pirrolidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 85%; p.f. 102^oC. Análise elementar: calculado para C₁₁H₁₆N₅Cl, C 52,05; H 6,37; N 27,60%. Encontrado: C 52,08; H 6,11 e N 27,95%. IV (cm^-1) 2986-2885, 1593, 1226, 838; RMN ¹H, d 1,89 (8H, dq, CH₂CH₂N); 3,50 (8H, dt, CH₂-N); RMN ¹³C, d 168,18 (C-2), 162,52 (C-4, 6), 46,25 (C-1'), 25,14 (C-2'); CG-EM, m/z (M^+.) 253.

3 [2,4,6-tris(1-pirrolidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 82%; p.f. 180^oC. Análise elementar: calculado para C₁₅H₂₄N₆, C 62,45; H 8,40; N 29,14. Encontrado: C 62,78; H 8,15 e N 29,43%. IV (cm^-1) 2954-2859, 1528, 1220; RMN ¹H, d 1,86 (12H, dq, CH₂CH₂N); 3,50 (12H, dt, CH₂-N); RMN ¹³C, d 163,52 (C-2, 4, 6), 45,46 (C-1'), 25,15 (C-2'); CG-EM, m/z (M^+.) 288.

4 [2,4-dicloro-6-(1-piperidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 93%; p.f. 88^oC (lit.¹⁵ p.f. 90-1^oC); IV (cm^-1) 2943-2861, 1593, 1230, 844; RMN ¹H, d 1,68 (6H, m, 3 CH₂); 3,82 (4H, m ap., CH₂-N); RMN ¹³C, d 169,96 (C-2, 4), 163,35 (C-6), 45,22 (C-1'), 25,54 (C-2'); 24,08 (C-3'); CG-EM, m/z (M^+.) 233.

5 [2-cloro-4,6-bis(1-piperidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 80%; p.f. 114^oC (lit.¹⁶ p.f. 117-9^oC); IV (cm^-1) 2937-2856, 1569, 1232, 796; RMN ¹H, d 1,57 (12H, s, 6 CH₂); 3,69 (8H, dt, CH₂-N); RMN ¹³C, d 169,31 (C-2), 163,95 (C-4, 6), 44,27 (C-1'), 25,59 (C-2'); 24,51 (C-3'); CG-EM, m/z (M^+.) 281.

6 [2,4,6-tris(1-piperidinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 75%; p.f. 216^oC (lit.¹⁷ p.f. 216-7^oC); IV (cm^-1) 2932-2848, 1520, 1231; RMN ¹H, d 1,55 (18H, sl, CH₂CH₂); 3,67 (12H, sl, CH₂-N); RMN ¹³C, d 165,32 (C-2, 4, 6), 43,95 (C-1'), 25,75 (C-2'); 25,00 (C-3'); CG-EM, m/z (M^+.) 330.

7 [2,4-dicloro-6-(4-morfolinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 72%; p.f. 156^oC (lit.⁸ p.f. 157-8^oC); IV (cm^-1) 2969-2860, 1587, 1276, 1233, 841; RMN ¹H, d 3,73 (2H, t, CH₂-N), 3,75 (2H, t, CH₂-N), 3,85 (2H, t, CH₂-O), 3,86 (2H, t, CH₂-O); RMN ¹³C, d 170,17 (C-2,4), 163,83 (C-6), 66,17 (C-2'), 44,26 (C-1'); CG-EM, m/z (M^+.) 235.

8 [2-cloro-4,6-bis(4-morfolinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 90%; p.f. 176^oC (lit.¹⁶ p.f.172-4^oC); IV (cm^-1) 2990-2854, 1574, 1269, 1237, 798; RMN ¹H, d 3,67 (8H, t, CH₂-N), 3,74 (8H, sl, CH₂-O); RMN ¹³C, d 169,38 (C-2), 164,17 (C-4, 6), 66,37 (C-2'), 43,55 (C-1'); CG-EM, m/z (M^+.) 285.

9 [2,4,6-tris(4-morfolinil)-1,3,5-triazina]. Cristais incolores em rendimento de 78%; p.f. 265^oC (lit.¹⁸ p.f. 272-3^oC); IV (cm^-1) 2962-2856, 1364, 1252, 1214; RMN ¹H, d 3,70 (24H, sl); RMN ¹³C, d 165,29 (C-2, 4, 6), 66,79 (C-2'), 43,60 (C-1'); CG-EM, m/z (M^+.) 336.

10 [2-pirrolidinil-4-propanoxi-6-tiopropanoxi-1,3,5-triazina). Líquido incolor em rendimento de 90%; p.e. 135-7^oC. Análise elementar: calculado para C₁₃H₂₂N₄OS, C 55,29; H 7,87; N 19,85. Encontrado: C 55,45; 7,62 e N 20,05%. IV (cm^-1) 2980-2850, 1560, 1280, 1220, 850, 600; RMN ¹H, d 0,97 (6H, m, CH₃); 1,74 (4H, m, CH₂-CH₃), 1,92 (4H, sl, CH₂CH₂N), 3,04 (2H, t, CH₂S), 3,56 (4H, sl, CH₂N), 4,24 (2H, t, CH₂O); RMN ¹³C, d 181,09 (C-2), 168,60 (C-4), 162,53 (C-6), 68,41 (C-1'), 46,17 (C-4'); 31,73 (C-6'), 24,88 (C-2´), 22,66 (C-5´), 21,85 (C-7´), 13,21 (C-3´), 10,18 (C-8´); CG-EM, m/z (M^+.) 282.

Parte Biológica

Os derivados triazínicos em quantidades na faixa de 8 a 50 mg foram dissolvidos em 5 mL de DMSO e posteriormente adicionados em alíquotas para sucessivas diluições, perfazendo 4 concentrações diferentes, a tubos contendo 5 mL de solução de água do mar artificial:tween 80 (2% v/v). Para cada concentração da substância testada e controle, foram preparadas cinco réplicas.

Eclosão dos cistos de Artemia salina: O meio para o cultivo das larvas de Artemia salina foi água do mar artificial. Para eclosão dos cistos foi utilizada uma caixa contendo divisória, de maneira que apenas um dos lados ficasse iluminado para permitir, por fototropismo, a migração das larvas.

Bioensaio de Letalidade da Artemia salina: Utilizou-se a metodologia de Meyer¹ adaptada. Dez naupilus de Artemia salina foram transferidos para cada um dos 5 tubos contendo água do mar artificial e a substância a ser testada em quatro concentrações diferentes. Os tubos foram mantidos sob iluminação e a contagem dos animais mortos e vivos foi realizada após 24 h.

Determinação da Dose Letal de 50% (DL₅₀): A partir do gráfico do percentual de animais vivos contra o logaritmo da dose ensaiada, a DL₅₀ foi determinada sendo realizado o ajuste dos pontos através de regressão linear.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq e CAPES pela concessão de bolsas de Pós-graduação e produtividade em pesquisa, e também pelo apoio financeiro recebido.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Out 2000
• Data do Fascículo
  Fev 2000

Histórico

• Recebido
  22 Set 1998
• Aceito
  10 Jun 1999