Ausência de associação entre polimorfismo do gene da interleucina-1 beta e o prognóstico de pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave

Resumos

OBJECTIVE: Traumatic brain injury is the major cause of death among individuals between 1-45 years-old. The outcome of traumatic brain injury may be related to brain susceptibility to the injury and genetic factors. Genes that may affect traumatic brain injury outcome are being investigated, however there is still few data concerning the association between genetic polymorphisms and traumatic brain injury outcome. The interleukin-1 beta gene (IL-1B) is one of the most studied genes, because levels of this cytokine are raised after traumatic brain injury and this can affect worsen the prognosis. The aim of this study was to test whether the -31C/T polymorphism, located at the promoter region of the IL-1B gene, is associated with primary short-term outcome (death or intensive care unit discharge) in severe traumatic brain injury patients. METHODS: Were studied 69 patients admitted with severe traumatic brain injury in three hospitals of the metropolitan region of Porto Alegre. The polymorphism was analyzed by polymerase chain reaction, followed by restriction digestion. RESULTS: Severe traumatic brain injury was associated with a 45% mortality rate. No significant differences were observed in the allele and genotype frequencies between patients stratified by traumatic brain injury outcome. CONCLUSION: Our findings suggest that -31C/T IL-1B gene polymorphism have no significant impact on the outcome of patients after acute severe traumatic brain injury.

Interleukin-1beta; Polymorphism, genetic; Craniocerebral trauma

ARTIGO ORIGINAL

Ausência de associação entre polimorfismo do gene da interleucina-1 beta e o prognóstico de pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave

Taís Frederes Krämer Alcalde^I; Andrea Regner^II; Edison Moraes Rodrigues Filho^III; Patrícia Corso Silveira^IV; Gabriela Gonçalves Grossi^IV; Daniel Simon^V

^IAcadêmica do Curso de Biomedicina da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil

^IIDoutora, Professora do Curso de Medicina e do Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil

^IIIPós-graduando (Doutorado) do Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil

^IVAcadêmica do Curso de Medicina da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil

^VDoutor, Professor do Curso de Ciências Biológicas e do Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil

^{Autor para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: O traumatismo crânio-encefálico é a principal causa de óbito em indivíduos com idade entre 1 a 45 anos. O desfecho do traumatismo crânio-encefálico pode estar relacionado, além de fatores pré-morbidade e gravidade do dano, com fatores genéticos. Genes que podem ter relação com o resultado pós-trauma vêm sendo estudados, porém, ainda existem poucas informações sobre a associação entre polimorfismos genéticos e o desfecho do traumatismo crânio-encefálico. O gene da interleucina-1 beta (IL-1B) é um dos genes estudados, pois esta citocina encontra-se em níveis elevados após o traumatismo crânio-encefálico e pode afetar de forma negativa seu desfecho. O objetivo do presente estudo foi analisar o polimorfismo -31C/T, localizado na região promotora do gene IL-1B, em pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave visando correlacioná-lo com o desfecho primário precoce (alta do centro de terapia intensiva ou morte).

MÉTODOS: Foram estudados 69 pacientes internados por traumatismo crânio-encefálico grave em três hospitais de Porto Alegre e região metropolitana. O polimorfismo foi analisado através da reação em cadeia da polimerase, seguida da digestão com enzima de restrição.

RESULTADOS: O traumatismo crânio-encefálico grave foi associado a uma mortalidade de 45%. Não foram observadas diferenças significativas nas frequências alélicas e genotípicas entre os grupos de pacientes divididos pelo desfecho do traumatismo crânio-encefálico.

CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que o polimorfismo -31C/T do gene IL-1B não tem impacto significativo no desfecho fatal dos pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave.

Descritores: Interleucina-1beta; Polimorfismo genético; Traumatismos crâniocerebrais

INTRODUÇÃO

O traumatismo crânio-encefálico (TCE) grave é a principal causa de mortalidade em indivíduos com idade entre 1-45 anos. Geralmente, produz algum tipo de sequela, como alterações no estado de consciência, distúrbios cognitivos e motores, além de neuroinflamação.⁽¹⁾ O desfecho de cada caso está relacionado com diversos fatores, tais como a suscetibilidade do cérebro à lesão, extensão e gravidade da lesão, idade do paciente, outros fatores de co-morbidade prévia, e também fatores genéticos.⁽²⁾

A interleucina 1 é uma citocina que amplia a cascata inflamatória por ativar células T, regulando a manifestação de moléculas de adesão e induzindo a produção de outras citocinas proinflamatórias e proteínas associadas.⁽³⁾ A família da interleucina 1 é constituída por três proteínas relacionadas que são codificadas por genes presentes no braço longo do cromossomo 2: IL-1α (codificada pelo gene IL1A), IL-1β (codificada pelo gene IL1B) e IL-1Ra (codificada pelo gene IL-1RN).⁽⁴⁾ Os agonistas, interleucina-1α e a interleucina-1β, compartilham uma estrutura terciária muito parecida e partilham dos mesmos fatores regulatórios, afinidades e funções.⁽⁵⁾ O antagonista do receptor da IL-1A (IL-1Ra) é um inibidor competitivo de IL-1α e IL-1β.

A IL-1β é codificada por um gene cuja expressão é controlada a nível transcricional e pós-transcricional e está fortemente envolvida na resposta inflamatória. Esta citocina é produzida pelos macrófagos e astrócitos e se encontra muito elevada após o trauma.⁽⁶⁾ Há indícios de que a IL-1β está envolvida com doenças neurodegenerativas, tanto agudas como crônicas, tais como isquemia, convulsões, esclerose múltipla, além de doença de Parkinson e de Alzheimer.^(7,8)

Polimorfismos nos genes que codificam as proteínas da família da IL-1 têm sido estudados em diversas patologias pela importância que essa família tem em processos inflamatórios.⁽⁹⁾ O polimorfismo -31C/T resulta da mudança de uma citosina (C) por uma timina (T) na posição -31 da região promotora do gene IL-1B. Este polimorfismo está localizado em uma importante região regulatória do gene IL-1B (TATA-box) e afeta significativamente as interações DNA-proteínas em ensaios in vitro.⁽¹⁰⁾ O alelo T, tanto em homozigose quanto em heterozigose, está relacionado com uma maior produção de IL-1β⁽¹¹⁾ podendo causar uma resposta inflamatória exacerbada e piora no estado do paciente.⁽⁹⁾

O presente estudo tem como objetivo analisar o papel do polimorfismo -31C/T do gene da IL-1β em pacientes que sofreram traumatismo crânio-encefálico grave, visando verificar sua influência no desfecho primário precoce (alta do centro de terapia intensiva (CTI) ou morte) e correlacioná-lo com variáveis clínicas.

MÉTODOS

Pacientes

Foi estudada uma coorte de pacientes internados com TCE grave, no período de agosto de 2003 a outubro de 2009, em três hospitais da região metropolitana de Porto Alegre: Hospital Municipal de Pronto Socorro, Hospital Cristo Redentor (ambos na cidade de Porto Alegre) e Hospital de Pronto Socorro Deputado Nelson Marchezan, na cidade de Canoas. Os critérios para inclusão na amostra foram: idade superior a 16 anos e inferior a 70 anos, sexo masculino, pacientes com TCE grave (escala de coma de Glasgow, GCS: 3-8). As lesões cerebrais podiam ser primárias ou secundárias. Politraumatismo não foi critério de exclusão. Na admissão da unidade de emergência, os pacientes foram inicialmente avaliados, ressuscitados e passaram por cirurgia de emergência quando necessário. Somente pacientes transferidos para o CTI até 24 horas após o TCE foram incluídos no estudo. Todos os pacientes foram sedados e ventilados mecanicamente e não foram administrados corticoesteróides. Foram colhidos dados demográficos e assistenciais dos pacientes, através de informações provenientes do boletim de atendimento e prontuário. O acompanhamento da evolução clínica do paciente foi realizado, diariamente, até o desfecho primário: alta do CTI ou morte. Estudos prévios mostram que existem diferenças, de acordo com o gênero, na fisiopatologia do desfecho após injúria neurológica aguda⁽¹²⁾ ou trauma sistêmico.⁽¹³⁾ Foi observada uma menor suscetibilidade de injúrias pós isquêmicas e pós traumáticas em mulheres.^(12,13) Desta forma, para não correr riscos de interferência de possíveis diferenças dependentes do gênero no desfecho pós TCE, somente homens foram incluídos no estudo.

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Luterana do Brasil e teve a anuência dos Hospitais Municipal de Pronto Socorro de Porto Alegre, Cristo Redentor e Pronto Socorro Deputado Nelson Marchezan. Devido ao estado de inconsciência dos pacientes, o consentimento informado foi obtido de familiares do paciente que foram informados sobre os objetivos do estudo. As coletas de sangue foram realizadas após a obtenção do consentimento informado.

Análises genéticas

O DNA foi extraído de amostras de sangue total de pacientes com TCE grave, utilizando um método não enzimático.⁽¹⁴⁾ A amplificação do gene de interesse (IL-1β) foi feita através da reação em cadeia de polimerase (PCR) conforme descrito por Yang et al.⁽¹¹⁾ Os produtos da amplificação foram clivados com a enzima AluI, a 37ºC por 12 horas. Os fragmentos foram checados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%, durante 90 minutos a 100 V. O gel foi corado com nitrato de prata.

Análises estatísticas

Frequências alélicas foram determinadas pela contagem direta de alelos. Os desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg e as diferenças de frequências entre grupos foram avaliados pelo teste de qui-quadrado. Os valores das médias dos grupos foram comparados usando o teste U de Mann-Withney. Todos os valores de p são bi-caudais, e um valor p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Os pacientes desse estudo consistiram em 69 homens, vítimas de traumatismo crânio-encefálico grave. A tabela 1 mostra as características clínicas e demográficas na população estudada, estratificadas de acordo com o desfecho dos casos (alta da CTI ou morte). O TCE grave foi associado a uma mortalidade de 45%. A média da idade dos pacientes foi de 34,8 anos, sendo similar entre pacientes que sobreviveram ou não. Os pacientes sobreviventes foram admitidos no CTI com GCS de 5,9 ± 1,7, enquanto os que tiveram desfecho fatal tinham GCS de 4,6 ± 1,6 (p<0,01).

Do total de pacientes, 31 (45%) foram submetidos à craniotomia, sendo observada frequência significativamente maior de craniotomia entre pacientes que morreram (p<0,05). O tempo de permanência no CTI variou de menos de 1 dia até 54 dias, sendo observada diferença significativa quando comparados pacientes que receberam alta (16,8 ± 13,8 dias) ou que morreram (3,7 ± 3,6 dias; p<0,001). A escala de resultados de Glasgow (GOS) também apresentou diferença significativa entre os pacientes quando estes foram estratificados pelo desfecho (sobreviventes: 3,4 ± 1,1; mortos 1,0 ± 0,0; p<0,001). A principal causa de lesão foi relacionada a acidentes de trânsito (45% por acidente por veículo automotor e 20% por atropelamentos). Foi observado que 42 pacientes (61%) apresentaram politraumatismo associado ao TCE, envolvendo principalmente lesões no tórax e membros.

As frequências alélicas e genotípicas da população estudada são apresentadas na tabela 2. Na amostra total dos pacientes as frequências dos alelos C e T foram de 67% e 33%, respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas nas frequências alélicas ou genotípicas entre os pacientes que sobreviveram ou não. A comparação das características clínicas estudadas entre indivíduos homozigotos CC e portadores do alelo T (genótipos CT e TT) não apresentou diferenças significativas (dados não mostrados), a não ser pela frequência de craniotomia que foi significativamente maior em pacientes que tinham o alelo T (genótipos CT e TT: 60,0%; genótipo CC: 29,4%; p<0,05).

DISCUSSÃO

Existe uma variabilidade considerável no desfecho do traumatismo crânio-encefálico, sendo que fatores genéticos podem influenciar tanto na suscetibilidade do cérebro à lesão, quanto na capacidade de renovação e reorganização neural. Por esse motivo, pesquisas sobre polimorfismos genéticos podem auxiliar na compreensão de fatores determinantes para o prognóstico dos pacientes. A investigação de polimorfismos em genes relacionados com neuroinflamação é interessante dado o papel importante que esta desempenha no TCE. A integração dos dados dos genótipos dos pacientes com os dados clínicos pode auxiliar no estabelecimento de fatores prognósticos no TCE grave.

Alguns estudos procuram relacionar características genéticas com o desfecho após TCE grave. A apolipoproteína E, uma das proteínas responsáveis pelo transporte de lipídios, é um dos fatores genéticos mais estudados com relação ao TCE. Estudos mostram uma correlação significativa entre o desfecho desfavorável pós-TCE e um polimorfismo no gene da apolipoproteína E.^(15,16)

Dentre as moléculas envolvidas com a mediação da resposta inflamatória depois de qualquer dano ao crânio ou cérebro, são as citocinas, especialmente a interleucina-1, que desempenham o papel mais importante. Sabe-se que no acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, Alzheimer ou qualquer doença associada com neurodegeneração há aumento os níveis de IL-1, principalmente IL-1β. A IL-1β é expressa em baixas quantidades em cérebros sadios, porém, se apresenta de forma aumentada após o TCE.⁽¹⁷⁾ A quantidade de citocina produzida pode estar relacionada com polimorfismos no gene IL-1B. Assim a resposta inflamatória ao trauma pode depender do genótipo do paciente. A expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória é controlada nos níveis transcricional e pós-transcricional. No nível transcricional, polimorfismos na região promotora dos genes podem resultar em diferenças na resposta a determinados processos patológicos.

Polimorfismos nos genes IL-1A, IL-1B e IL-RN foram analisados em estudos visando verificar sua influência em pacientes que sofreram TCE. Estudo feito por Uzan et al.⁽⁹⁾ evidenciou que existe associação genética entre o desfecho pós-TCE e polimorfismos no gene IL-1B. Foram estudados 69 pacientes e analisados dois polimorfismos do tipo SNP (polimorfismos de nucleotídeo único): um na posição -511 e outro na +3953. Notou-se que os pacientes que possuíam o alelo T em ambas as posições mostraram pior prognóstico (morte, estado vegetativo ou sequelas graves), devido, talvez, a um efeito aditivo desses polimorfismos. Tanriverdi et al.⁽¹⁸⁾ realizaram um estudo em 71 pacientes com TCE e não observaram associação entre o desfecho dos casos e um polimorfismo de troca de citosina por timina na posição -889 do gene IL-1A. Entretanto este trabalho foi contestado por Wang et al.⁽¹⁹⁾ devido a possíveis problemas metodológicos na genotipagem. Hadjigeorgiou et al.⁽²⁰⁾ analisaram o polimorfismo -511 C/T do gene da IL-1B e o polimorfismo de número variável de repetições em tandem (VNTR) do gene da IL-1RN e a sua associação com eventos hemorrágicos em 151 pacientes que sofreram TCE. Os autores verificaram que quando o gene IL-1RN tinha o alelo T era mais provável que os pacientes tivessem eventos hemorrágicos após o TCE. Este alelo foi associado com a produção aumentada de IL-1Ra. Johnson et al.⁽²¹⁾ estudaram a influência de alelos dos genes IL-1A e IL-1B na apoptose, analisando amostras de hipocampo de 38 pacientes que morreram após TCE. Os autores não observaram correlação entre os alelos e a quantidade de apoptose mensurada.

Como pode se observar os estudos com os genes pertencentes ao grupo da IL-1 realizados em pacientes com TCE apresentaram delineamentos experimentais diversos, enfocando diferentes genes, polimorfismos e aspectos da fisiopatologia do TCE e, desta forma, os resultados apesar de conflitantes não são estritamente comparáveis.

Estudos prévios mostram que os polimorfismos -511T/C e -31C/T do gene IL-1B estão em completo desequilíbrio de ligação de uma forma reversa, ou seja, o alelo -511T sempre é encontrado associado ao alelo -31C e o alelo -511C sempre é observado na presença do alelo -31T.^(10,22) No presente estudo foi analisado o polimorfismo -31C/T e, até onde sabemos, não há estudos na literatura que tenham analisado este polimorfismo visando sua associação com o TCE. Contudo, devido ao desequilíbrio de ligação, os resultados do presente estudo podem ser comparados aos resultados dos estudos que analisaram o polimorfismo da posição -511. Nossos resultados não evidenciaram associação significativa entre o polimorfismo -31C/T e o desfecho dos pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave. É importante ressaltar que o número de pacientes que estudamos não difere muito da amostra dos outros estudos com pacientes vítimas de TCE.

É importante entender o papel que as citocinas e seus polimorfismos desempenham na progressão da lesão traumática neural, possibilitando o desenvolvimento de recursos diagnósticos e terapêuticos mais eficazes no TCE grave. O entendimento dos mecanismos celulares envolvidos no dano neural possibilitará a evolução das estratégias terapêuticas e de reabilitação nas vítimas de TCE grave, reduzindo, assim, o impacto do TCE na saúde pública.

CONCLUSÃO

A compreensão da influência de polimorfismos genéticos no desfecho do TCE ainda está em uma fase inicial, com poucos estudos realizados. Nossos resultados sugerem que o polimorfismo -31C/T do gene IL-1B não tem impacto significativo no desfecho fatal dos pacientes com traumatismo crânio-encefálico grave.

AGRADECIMENTOS

O presente estudo foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; processos 484391/2007-0 e 568691/2008-3).

REFERÊNCIAS

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Submetido em 16 de Setembro de 2009

Aceito em 28 de Dezembro de 2009

Recebido da Universidade Luterana do Brasil - ULBRA - Canoas (RS), Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Fev 2010
• Data do Fascículo
  Dez 2009

Histórico

• Aceito
  28 Dez 2009
• Recebido
  16 Set 2009