Biocontrole de doenças de parte aérea do tomateiro por Nocardioides thermolilacinus

Biocontrol of foliar disease of tomato plants by Nocardioides thermolilacinus

COMUNICAÇÃO SHORT COMMUNICATION

Biocontrole de doenças de parte aérea do tomateiro por Nocardioides thermolilacinus

Biocontrol of foliar disease of tomato plants by Nocardioides thermolilacinus

Renato Carrer Filho; Reginaldo S. Romeiro; Flávio Augusto O. Garcia

Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, 36.571-000, Viçosa, MG, Brasil

RESUMO

A cultura do tomate demanda de um elevado número de aplicação de agrotóxicos, os quais podem ser perigosos tanto para o ambiente como para o homem. Assim, esse trabalho visa avaliar a eficácia da actinobactéria Nocardioides thermolilacinus, estirpe SON-17, como agente de biocontrole de doenças do tomateiro quando dispensado no filoplano de plantas. Inicialmente, a potencialidade foi checada in vitro contra Alternaria solani, Corynespora cassiicola, Phytophthora infestans, Pseudomonas. syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. A estirpe SON-17 não inibiu o crescimento das bactérias, mas inibiu a germinação de esporos fúngicos. No ensaio em casa de vegetação, quando plantas de tomate foram atomizadas com suspensão de propágulos de SON-17 e quatro dias após inoculadas com patógenos desafiantes, o antagonista foi hábil em reduzir a severidade de A. solani, S. solani, C. cassiicola, X. campestris pv. vesicatoria e P. syringae pv. tomato. Em condições de campo, quando o actinomiceto foi dispensado semanalmente por atomização, a severidade da pinta preta foi reduzida em comparação com o controle. A estirpe SON-17 deve ser melhor investigada como agente de biocontrole de doenças do tomateiro.

Palavras-chave: Controle biológico, antagonismo microbiano, actinobactéria.

ABSTRACT

Tomato needs a large number of applications of pesticides, which can be dangerous both for the environment and for humans. This paper aimed to evaluate the efficiency of actinobacteria Nocardioides thermolilacinus, strain SON-17, as a biocontrol agent for tomato diseases when delivered to the phylloplane of tomato plants. In a first approach, its in vitro antagonistic potential was checked against the pathogens Alternaria solani, Corynespora cassiicola, Phytophthora infestans, Pseudomonas. syringae pv. tomato, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Strain SON-17 did not inhibit growth of bacterial pathogens but inhibited spore germination of the fungal ones. In greenhouse assays, when tomato plants were sprayed with a propagule suspension of SON-17 and four days later inoculated with challenging pathogens, the agent was able to reduce disease severity in the case of the pathogens A. solani, S. solani, C. cassiicola, X. campestris pv. vesicatoria and P. syringae pv. tomato. In field trials, when actinomycete was weekly applied by spraying, the severity of early blight was reduced in comparison with the controls. Strain SON-17 deserves further investigation as a biocontrol agent for tomato diseases.

Keywords: Biological control, microbial antagonism, actinobacteria.

A cultura do tomate é atacada por inúmeros fitopatógenos, mais de 200 já foram descritos, sendo que alguns como Alternaria solani e Phytophthora infestans podem inviabilizar o cultivo da planta em determinadas condições (Jones et al., 1991). Isso leva ao uso de grandes quantidades de agrotóxicos na cultura, sendo a maioria prejudicial aos ecossistemas, bem como seus resíduos em frutos são sérias ameaças à saúde humana (Barreto & Scaloppi, 2000). Na busca por métodos de menor impacto, o controle biológico é uma das alternativas mais promissoras.

Dentre os vários organismos utilizados no biocontrole, as actinobactérias veem sendo testadas e em alguns casos com promissores resultados (Romeiro, 2007). Actinobactérias são organismos pertencentes ao domínio Bacteria, gram-positivas, de crescimento filamentoso, podendo formar pseudomicélio, sendo algumas espécies formadoras de endósporos (Madigan et al., 2003). As espécies do gênero Nocardioides são actinobactérias posicionadas no grupo VI actinobactérias filamentosas geralmente encontradas em solos, com parede celular densa e formadoras de endósporos (Madigan et al., 2003). A formação dessa estrutura permite a sobrevivência do agente de biocontrole a situações desfavoráveis ao seu desenvolvimento, como temperaturas elevadas, estresse hídrico. Sendo sobrevivência uma característica desejável a um agente de biocontrole.

A estirpe SON-17 de Nocardioides thermolilacinus Lu et Yan, foi originalmente isolada de rizosfera de plantas de tomateiro, e posteriormente demonstrou ser um bom agente de biocontrole de doenças da cultura, quando dispensado nesse habitat, por meio de microbiolização de sementes (Carrer Filho, 2002), não havendo relato anterior do uso desse organismo como agente de biocontrole de doença de plantas. O presente trabalho tem como objetivo, avaliar a eficácia da estirpe SON 17 de N. thermolilacinus como agente de biocontrole de doenças da parte aérea do tomateiro.

Os microrganismos utilizados foram: N. thermolilacinus, Stemphylium solani G.F. Weber, Alternaria solani Sorauer, Corynespora cassiicola (Berk. & M.A. Curtis) C.T. Wei, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young, Dye & Wilkie, Xanthomonas vesicatoria (Doidge) Vauterin et al., oriundos da coleção de culturas do Departamento de Fitopatologia da UFV. Os patógenos fúngicos foram cultivados em BDA, à exceção de S. solani em que utilizou o meio V8-Agar (Tuite, 1969) e as bactérias em meio 523 (Kado & Heskett, 1970). Após multiplicação, as culturas foram preservadas sob óleo mineral (Smith & Onions, 1994) a 4ºC. A estirpe SON-17 de N. thermolilacinus foi cultivada e mantida em meio de extrato de solo-ágar (Pramer & Schmidt, 1964).

No ensaio de inibição da germinação de conídios uma suspensão aquosa de propágulos do antagonista N. thermolilacinus (OD₅₄₀ = 0,6) foi depositada na superfície de uma lâmina comum de microscopia e misturada com igual volume de suspensão de conídios de A. solani (5 x 10³ conídios. mL^-1) ou S. solani (10⁴ conídios.mL^-1) ou C. cassiicola (10⁴ conídios.mL^-1). Como controles utilizaram-se água e suspensão do fungicida clorotalonil (2 g.L^-1). Para cada tratamento, foram utilizadas três repetições. As lâminas foram mantidas em câmara úmida, a 28ºC, por 24 horas e a germinação quantificada pela contagem de 100 conídios por lâmina.

O efeito de N. thermolilacinus sobre a inibição da liberação de zoósporos de P. infestans também foi avaliado, utilizando o procedimento descrito por Halfeld-Vieira (2002), em que a solução salina (NaCl 0,14M) e a solução do fungicida clorotalonil (2 g.L^-1), foram usadas como controle. Uma suspensão aquosa de esporângios de P. infestans (10⁴ esporângios.mL^-1), foi preparada a partir de frutos verdes de tomateiro, previamente inoculados e mantidos em câmara úmida. Cinqüenta (50) µL desta suspensão foram depositados na superfície de lâmina comum de microscopia e misturados com igual volume de suspensão de propágulos da estirpe SON-17 (OD₅₄₀= 0,6). As lâminas foram mantidas a 4ºC por 3 horas e, após, a 17ºC por 24 horas. O ensaio foi conduzido com três repetições, contando-se 100 esporângios por repetição.

A técnica de dupla camada (Romeiro, 2001) foi utilizada para observar a capacidade de N. thermolilacinus em inibir o crescimento das bactérias P. syringae pv. tomato e X. vesicatoria. Para tanto, o antagonista foi cultivado em meio 523 (Kado & Heskett, 1970) líquido por 18 horas, sendo após vertido 10 µL em um ponto central de placa de Petri contendo o meio 523 (Kado & Heskett, 1970) sólido, incubando-se por 48 horas, a 28ºC. Em câmara de fluxo laminar, as placas foram destampadas e expostas à radiação UV (254nm) por 15 minutos. Sobre esse meio verteu-se a respectiva cultura da fitobactéria em teste, após homogenização de 0,1 mL da fitobactéria na fase exponencial de crescimento em meio semi-sólido fundente, formando uma sobrecamada de 1mm de espessura. As placas foram mantidas a 28ºC e inspecionadas diariamente, observando-se os halos de inibição. O ensaio foi conduzido com três repetições, uma placa de Petri para cada repetição.

Estudos de biocontrole em casa de vegetação foram conduzidos a fim de averiguar o controle de patógenos fúngicos e bacterianos, in vivo. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, com 10 repetições, sendo que cada repetição consistiu em um vaso de 500 mL contendo como substrato solo não esterilizado, areia e matéria orgânica (6:2:1) com duas plantas. Uma suspensão aquosa de propágulos da estirpe SON-17 (OD₅₄₀ = 0,3), preparada a partir da cultura na fase exponencial de crescimento (aproximadamente 20 horas), foi dispensada por atomização na parte aérea de plantas de tomateiro cultivar Santa Cruz Kada, 5 mL por planta, aos 35 dias após a semeadura. Após quatro dias as plantas foram mantidas em câmara úmida por 24 h e, a seguir, inoculadas com os respectivos patógenos, em separado, nas seguintes concentrações de inoculo: P. syringae pv. tomato (OD₅₄₀ = 0,2); C. cassiicola (2 x 10⁴ conídios mL^-1); S. solani (2,5 x 10³ conídios mL^-1), A. solani (2 x 10⁴ conídios mL^-1) e X. vesicatoria (OD₅₄₀ = 0,1). Avaliando-se a severidade de doença, por meio da escala de Horsfall & Barrat (1945), adaptado de Campbell & Madden (1990).

O biocontrole em condições de campo foi testado em um experimento realizado no delineado em quatro blocos com cinco plantas por parcela, foi instalado em uma área experimental do campus da Universidade Federal de Viçosa onde tomate é cultivado continuamente. Mudas obtidas em estufa com 20 dias de idade, foram atomizadas com suspensão de propágulos do agente de biocontrole (OD₅₄₀ = 0,3) e transplantadas no espaçamento 0,60 m entre linhas e 0,30 m nas linhas. Semanalmente, até cerca de cinco semanas após o transplante das mudas, repetia-se a aplicação do antagonista (OD₅₄₀ = 0,3), por atomização do filoplano com aproximadamente 35 mL por planta. Monitorou-se a ocorrência de doenças da parte aérea, sendo avaliada a severidade de A. solani, semanalmente, pelo uso da escala diagramática desenvolvida por Boff et al. (1991) e um painel de três avaliadores. Água e o fungicida clorotalonil (2 g L^-1) foram usados como controles.

Os resultados mostram que ouve inibição no percentual de germinação de esporos de A. solani (Água = 65,66% A, Fungicida = 3% B, SON-17 6,66% B), S. solani (Água = 38% A, Fungicida = 3,66% B, SON-17 8,33% B) e C. cassiicola (Água = 60% A, Fungicida = 1% B, SON-17 16,66% B) e de liberação de zoósporos de P. infestans (Água = 28% A, SON-17 10,33% B, Fungicida = 0,66% C). Para bactérias não foi detectada inibição in vitro. Antagonismo in vitro, como observado pela estirpe SON-17, entre microrganismos é fenômeno comum (Madigan et al., 2003). Porém, sua aplicação a campo nem sempre é reproduzível.

A estirpe SON-17, quando dispensada no filoplano de plantas de tomateiro, cultivado em casa de vegetação, reduziu a severidade de lesões por folíolos tanto de patógenos fúngicos (C. cassiicola, A. solani, S. solani) como bacterianos (P. syrinage pv. tomato e X. campestris pv. vesicatoria) em relação à testemunha (Figura 1). A ausência de atividade antagonística in vitro contra as fitobactérias , deve-se possivelmente às limitações do teste de antibiose por dupla camada. O teste avalia apenas o mecanismo de antibiose, porém existem outros mecanismos possíveis como a produção de sideróforos, a competição por nutrientes e por nichos ecológicos e a interferência com o fenômeno de "quorum sensing" (Romeiro, 2007). De fato, a estirpe SON-17 foi capaz de promover o controle biológico em casa de vegetação e contra múltiplos patógenos. Assim, há necessidade de estudar os outros mecanismos, bem como averiguar se o controle é reproduzido em condições de campo, uma vez que organismos que se mostram promissores em condições de casa de vegetação fracassam quando levados a campo (Chiou & Wu, 2003; Steddom et al., 2002).

No ensaio a campo, a avaliação da área abaixo da curva de progresso de pinta preta causado por A. solani, demonstrou que o fungicida (8,50% ) foi o tratamento mais eficiente no controle da doença. Porém, em relação ao controle (106,66%) o antagonista (55,63%) reduziu significativamente o progresso da pinta preta, confirmando sua eficácia como agente de biocontrole. Isto sugere que a estirpe SON-17 possa ser utilizado como parte das medidas de manejo integrado que poderia tornar possível a redução da quantidade de fungicidas aplicados e/ou aumentar o espaço entre pulverizações.

Não foi possível verificar a eficácia da estirpe SON-17 sobre demais doenças do tomateiro devido a ocorrência de uma forte epidêmia de requeima (P. infestans), sobre o qual a actinobactéria não teve efeito. A ausência de controle da requeima, indica que possivelmente, o biocontrole possa não ser a principal estratégia de controle, para doenças as quais o agente etiológico seja patógenos de alta agressividade como P. infestans, mas demonstra potencial para o seu uso como medidas de manejo de outras doenças do tomateiro, como foi o caso da pinta preta.

AGRADECIMENTOS

Os autores expressam seus agradecimentos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pelo financiamento parcial deste trabalho.

Recebido 17 Março 2008

Aceito 28 Dezembro 2008

Autor para correspondência: Reginaldo S. Romeiro, e-mail: [e-mail]

TPP 7032

Editor Associado: Wagner Bettiol

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Fev 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  28 Dez 2008
• Recebido
  17 Maio 2008