Anéis aromáticos condensados e relação E4/E6: estudo de ácidos húmicos de gleissolos por RMN de 13C no estado sólido utilizando a técnica CP/MAS desacoplamento defasado

Condensed aromatic rings and E4/E6 ratio: humic acids in gleysoils studied by NMR CP/MAS13C, and dipolar dephasing

CP/MAS NMR 13C; humic acid; dipolar dephasing

ARTIGO

Anéis aromáticos condensados e relação E₄/E₆: estudo de ácidos húmicos de gleissolos por RMN de ¹³C no estado sólido utilizando a técnica CP/MAS desacoplamento defasado

Condensed aromatic rings and E₄/E₆ ratio: humic acids in gleysoils studied by NMR CP/MAS¹³C, and dipolar dephasing

Sérgio da Costa SaabI, ^*; Ladislau Martin-Neto^II

^IDepartamento de Física, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Av. Carlos Cavalcanti, 4748, 84030-000 Ponta Grossa - PR, Brasil

^IIEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, CP 741, 13569-970 São Carlos - SP, Brasil

ABSTRACT

In this work, seven samples of humic acids extracted from gleysoils were investigated. These studies, using NMR CP/MAS ¹³C techniques, did not show significant correlation between the E₄/E₆ ratio and the degree of aromaticity. However, dipolar dephasing (DD) measurements of condensed aromatic or substituted carbons showed a negative correlation of 0.94. Also, there was a good correlation between the amount of semiquinone free radicals measured by the EPR technique and condensed aromatic rings measured by NMR CP/MAS ¹³C with the DD technique. The content of semiquinone free radicals was quantified by EPR spectroscopy and was correlated with the humification (degree of aromaticity) of the humic substances. The results indicated that the E₄/E₆ ratio identifies the degree of aromatic rings condensation. It was also found that the degree of aromaticity, measured by NMR, as frequently presented in the literature (by conventional CP/MAS), underestimates aromatic rings in condensed structures.

Keywords: CP/MAS NMR ¹³C ; humic acid; dipolar dephasing.

INTRODUÇÃO

A razão E₄/E₆ (razão entre as absorbâncias em 465 e 665 nm), medida por espectroscopia eletrônica, e a aromaticidade, determinada por ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹³C em estado sólido, são usadas para avaliar o grau de humificação da matéria orgânica do solo. O decréscimo da razão E₄/E₆ está diretamente relacionado com o aumento do peso molecular e a condensação dos carbonos aromáticos, e a aromaticidade é inversamente relacionada à quantidade de grupos alifáticos¹. Apesar destas relações serem amplamente usadas na caracterização de substâncias húmicas (grau de humificação), têm sido motivo de controvérsia na literatura. Chen et al.² afirmaram que a relação E₄/E₆ é principalmente controlada pelo tamanho das substâncias húmicas, porém, os estudos de Baes e Bloom³ demonstraram que as substâncias húmicas não apresentam propriedades de espalhamento da luz e, por isto, a relação E₄/E₆ não seria controlada pelo tamanho molecular. Outros autores^1,4 afirmaram que ela se correlaciona negativamente com o grau de condensação ou conjugação dos anéis aromáticos das substâncias húmicas.

A técnica de RMN CP/MAS de ¹³C (polarização cruzada com rotação em torno do ângulo mágico) de estado sólido apresenta problemas na análise quantitativa dos espectros, devido às variações na eficiência da polarização entre os diferentes tipos de carbono (C)⁵ e quanto maior o número de hidrogênios (H) diretamente ligados ao C mais eficiente será a polarização. Deste modo, espectros obtidos por esta técnica podem subestimar a concentração de C quaternários ou aqueles de estruturas aromáticas condensados. Opella e Frey⁶ propuseram uma seqüência de pulsos onde o desacoplador era desligado por um certo período de tempo, com a finalidade de suprimir os sinais de C que possuem forte interação dipolar com os prótons. A interação dipolar é mais fraca para C não protonados por causa da sua grande distância do núcleo de H e é, também, fraca para C semelhantes a metil, metoxílico que possuem movimento molecular no estado sólido, assim como para cadeias longas de -CH₂-⁵. Portanto, um espectro usando a técnica desacoplamento defasado (DD), com um tempo de defasagem, mostrará C não protonados e C que possuem mobilidade. Wilson⁷ mostrou que a medida direta de quantificação de C aromáticos nos espectros de RMN CP/MAS ¹³C não corresponde ao teor real, devido à polarização cruzada usada para obter o experimento.

A espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) é usada nas substâncias húmicas (SH) para identificar radicais livres semiquinonas e metais de transição^8-11. A concentração de radicais livres semiquinonas é quantificada e relacionada com o grau de humificação das substâncias húmicas^10-16. Seu valor pode mudar quando se varia o pH da amostra em solução, quando a SH é submetida ao processo de hidrólise ácida, quando se altera a temperatura, quando há processo redox ou quando a SH é irradiada por luz UV^12,13. O grau de humificação de substâncias húmicas e de agregados organo-minerais em áreas sob diferentes manejos de solo, incluindo plantio direto e manejo convencional^14-16, tem sido avaliado por EPR.

Este trabalho teve como objetivo correlacionar os resultados de aromaticidade obtidos por RMN CP/MAS ¹³C de ácidos húmicos AH(s) extraídos de gleissolos com e sem a técnica DD com resultados obtidos com EPR (concentração de radicais livres) e a razão E₄/E₆.

PARTE EXPERIMENTAL

Foram coletadas sete amostras de solos, gleissolos, da região dos Grandes Lagos do estado do Rio de Janeiro, na profundidade de 0-0,20 m, como mostra a Tabela 1.

A extração e o fracionamento químico das SH por diferença de solubilidade foram realizados, utilizando a metodologia da Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS)¹⁷, que faz uso do NaOH (0,1 mol L^-1) como extrator. As frações (AH(s)) obtidas foram liofilizadas em pH em torno de 4,0.

A análise química elementar foi feita utilizando-se o aparelho CHNS-O da marca CE-Instruments Eauger 200. Em todas as análises foram utilizadas três replicatas e foi apresentado o valor médio das análises.

As medidas de radicais livres semiquinonas foram realizadas utilizando o espectrômetro de EPR da Bruker-EMX cavidade retangular, banda X (»9,0 GHz) em temperatura ambiente. A concentração de radicais livres semiquinonas foi obtida pela área dos sinais do radical livre através de dupla integração do espectro de EPR¹⁸, utilizando rubi sintético como padrão secundário¹¹. Aproximadamente 20 mg de amostra foram colocadas em tubos de quartzo. A concentração de radical livre foi quantificada normalizando-a pela massa das amostras de AH. As medidas foram feitas em duplicata para cada amostra. A potência de microondas utilizada para obter o sinal do radical livre semiquinona foi de 2 mW e a amplitude de modulação de 1 G_pp (Gauss pico a pico).

Os espectros de RMN de estado sólido foram obtidos no espectrômetro Varian Unity INOVA 400 MHz, utilizando-se uma seqüência CP/MAS com tempo de contato de 1 ms, tempo de repetição de 1 s e com desacoplamento defasado (DD) com tempo de defasagem de 70 µs¹⁹ e rotores de zircônio com rotação do ângulo mágico de 7 kHz. A percentagem de grupos aromáticos foi obtida dividindo-se a área do espectro (RMN CP/MAS de ¹³C) na região dos aromáticos (110 – 160 ppm) pela área total do espectro (0 – 220 ppm)²⁰. Na técnica DD foi empregada a área do espectro correspondente à região dos aromáticos.

As medidas de absorbância (espectrofotômetro Hitachi U2000) foram realizadas na região de 200 a 800 nm. As soluções foram preparadas com 3 mg de AH dissolvidos^2,3 em 10 mL de NaHCO₃ (0,05 mol L^-1), com pH final da solução de 8,3.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 apresenta a percentagem de C, H e N, os valores da razão C/N e os teores de cinzas das amostras de AH(s). Os teores de C nos ácidos húmicos variam de 45 a 51% e os de N, de 3,5 a 4,7%. Esses valores estão de acordo com os valores usualmente observados para AH's de solos¹.

Os dados de composição química dos AH's determinada por RMN CP/MAS de ¹³C mostram os grupos alifáticos: O alquil C e alquil C, em comparação ao conteúdo de aromáticos, como apresentado na Tabela 2. Normalmente em AH(s) de solo¹ os valores de aromaticidade variam de 25 a 42%. Observando os resultados da Tabela 2 (mínimo de 15,6% e máximo 19,3%), os AH(s) dos gleissolos possuem aromaticidade menor quando comparados a outros solos. Esta menor aromaticidade é consistente com a razão E₄/E₆, que varia de 4,0 a 7,6, sendo que para AH(s) de solos os valores encontrados na literatura^1,21 de E₄/E_6, variam de 3,0 a 5,0. E ainda, quanto maior a razão E₄/E₆, menor é a quantidade de aromáticos condensados que podem ser associados à humificação da matéria orgânica do solo^1-3, em acordo com os dados de Ponnamperuma²² que mostrou que em solos hidromórficos (gleissolo estudado) há pouco resíduo humificado quando comparados a solos bem drenados.

Os espectros de RMN CP/MAS de ¹³C das amostras de AH(s) dos gleissolos estão apresentados nas Figuras 1a e em ^1b estão os espectros usando CP/MAS de ¹³C mais DD.

Nas Figuras 2 e 3 são apresentados os gráficos entre a proporção de aromaticidade determinada por RMN CP/MAS de ¹³C, com relação à concentração de radical livre semiquinona e à razão E₄/E₆, respectivamente. Os coeficientes de determinação foram 0,36 para o conteúdo de radical livre e 0,45 para E₄/E₆. Nas Figuras 4 e 5 estão mostradas as mesmas relações, porém a técnica de desacoplamento defasada (DD) foi usada para determinar a proporção de C aromáticos. Os valores dos coeficientes de determinação obtidos foram 0,62 e 0,94, respectivamente.

O teor de hidrogênio nas amostras de AH é de 4,5 a 6,9% (Tabela 1), resultando na transferência de polarização do próton (¹H) para o ¹³C (na polarização cruzada) mais eficiente, subestimando o conteúdo de aromáticos condensados ou substituídos. A polarização cruzada além de diminuir o tempo de relaxação do carbono e permitir, assim, um número muito maior de dados acumulados em um dado intervalo de tempo⁷ induz um aumento na intensidade do sinal de RMN do ¹³C. Então, quanto mais hidrogênio contiver a amostra, maior será a transferência de polarização, fato evidenciado na Figura 3 com a amostra 4, possui maior conteúdo de hidrogênio (Tabela 1).

A técnica de desacoplamento defasado detecta os carbonos quaternários, isto é, os carbonos que não estão protonados, como também grupos CH₂ e CH₃ com muita mobilidade⁶. Por este motivo, a correlação é baixa entre a percentagem de carbonos aromáticos medida diretamente por RMN CP/MAS de ¹³C e a concentração de radicais livres (Figura 2) e E₄/E₆ (Figura 3). Quando é utilizada a técnica DD (Figuras 4 e 5), onde anéis aromáticos condensados ou substituídos são detectados, a correlação melhora significativamente. Confirma-se assim que o conteúdo de radicais livres e a razão E₄/E₆ se correlacionam diretamente com anéis aromáticos medidos por RMN CP/MAS de ¹³C, quando é utilizada a técnica DD.

CONCLUSÃO

A partir dos dados de RMN de ¹³C obtidos pela técnica de polarização cruzada e ângulo mágico (CP/MAS) mostrou-se que os ácidos húmicos possuem baixo grau de aromaticidade, coerente com a expectativa para áreas de várzea com baixa aeração do solo e baixa atividade microbiana. Os valores da relação E₄/E₆, obtidos de amostras em solução de ácidos húmicos, foram elevados e coerentes com baixos resíduos aromáticos. A razão E₄/E₆ correlacionou melhor com a quantidade de anéis aromáticos condensados, determinados por CP/MAS ¹³C juntamente com a técnica de defasagem dipolar, que com o grau de aromaticidade obtido através do CP/MAS "convencional". A explicação para a diferença está no fato que a razão E₄/E₆ está associada aos grupos aromáticos condensados e não com a aromaticidade total das amostras. Coerentemente a concentração de radicais livres semiquinonas, obtida por EPR, também se correlacionou melhor com o grau de anéis aromáticos obtido pela técnica de RMN usando DD.

AGRADECIMENTOS

Aos pesquisadores L. A. Colnago, N. C. Mello e E. H. Novotny pelas discussões do experimento e ao pesquisador M. Conceição pela amostra fornecida.

Recebido em 6/6/05; aceito em 31/5/06; publicado na web em 26/9/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Mar 2007
• Data do Fascículo
  Abr 2007

Histórico

• Aceito
  31 Maio 2006
• Recebido
  06 Jun 2005