Diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus herpes simples (HSV) em pacientes transplantados e não-transplantados

Laboratorial diagnosis of herpes simplex virus infection (HSV) in transplanted and non-transplanted patients

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus herpes simples (HSV) em pacientes transplantados e não-transplantados

Laboratorial diagnosis of herpes simplex virus infection (HSV) in transplanted and non-transplanted patients

Rafael B. Varella; Ivone L. Pires; Carlos Alberto Saraiva; Antônio Carlos C. Guimarães; Maria Angélica A. M. Guimarães

Laboratório de Virologia, Departamento de Patologia Clínica do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (HUCFF/UFRJ)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: O vírus herpes simples (HSV) é dividido em dois sorotipos (HSV-1 e HSV-2) responsáveis, respectivamente, pelos herpes labial e genital. Embora a infecção pelo HSV tenha um curso rápido, esse agente está freqüentemente relacionado a complicações no tratamento de pacientes imunocomprometidos, como indivíduos transplantados, na condição de agente oportunista.

OBJETIVOS: Comparar e avaliar o uso de três técnicas atuais para diagnóstico de HSV em pacientes transplantados e não-transplantados.

MATERIAL E MÉTODOS: Oitenta e quatro amostras clínicas consecutivas provenientes de 47 indivíduos transplantados e 37 não-transplantados foram coletadas de junho de 2001 a julho de 2002, sendo, simultaneamente, submetidas a nested multiplex reação em cadeia da polimerase (PCR) (nmPCR), multiplex PCR (mPCR) e isolamento viral (IV) em células vero.

RESULTADOS: Das amostras, 33,3% (28/84) foram positivas para o HSV por IV, 34,5%(29/84) por mPCR e 42,8% (36/84) por nmPCR. Pela técnica de imunofluorescência direta (IFD), 85,7% (24/28) das amostras foram caracterizadas como HSV-1, 86,2% (25/29) pelo mPCR e 88,9%(32/36) pelo nmPCR. Foram caracterizadas como HSV-2 pelas três técnicas empregadas 4,8%(4/84) das amostras. Não houve diferença significante de detecção entre as técnicas de diagnóstico do HSV (p = 0,38), embora o nmPCR tenha detectado mais amostras de pacientes transplantados (p = 0,05).

CONCLUSÃO: Apesar do desempenho similar entre as técnicas, o nmPCR se mostrou ferramenta útil para pacientes transplantados ou para aqueles sob tratamento antiviral, onde é esperada baixa carga viral em suas amostras.

Unitermos: Vírus herpes simples, Cultura de célula, PCR, Transplante

ABSTRACT

BACKGROUND: Herpes simplex virus (HSV) is divided in two serotypes (HSV-1 and HSV-2) responsible for labial end genital herpes, respectively. Although the infection caused by HSV has a rapid course, this agent is frequently related to complications in immunocompromised patient’s treatment, like transplanted individuals as an opportunistic agent.

OBJECTIVES: To compare and evaluate three current diagnosis techniques for HSV diagnosis in transplanted and non-transplanted patients. Material and methods: 84 consecutive clinical samples from 47 transplanted and 37 non-transplanted individuals were collected from June 2001 to July 2002, being simultaneously submitted to nested multiplex PCR (nmPCR), multiplex PCR (mPCR) and viral isolation (VI) in Vero cells.

RESULTS: 33.3%(28/84) samples were HSV-positive by VI, 35.4%(29/84) by mPCR and 42.8%(36/84) by nmPCR. 85.7% (24/28) samples were characterized as HSV-1 by the direct immunofluorescence technique (dIF), 86.2%(25/29) by mPCR and 88.9%(32/36) by nmPCR. 4.8%(4/84) samples were characterized as HSV-2 by the three techniques. There was no significant difference regarding HSV diagnosis among the techniques (p = 0.38), although nmPCR detected more samples from transplanted patients (p = 0.05).

CONCLUSION: although the three techniques presented similar performances, the nmPCR revealed to be an useful tool for transplanted patients or those under antiviral treatment, where a low viral load in their samples is expected.

Key words: Herpes simplex virus, PCR, Cell culture, Transplant

Introdução

O vírus herpes simples (HSV) é membro da extensa e heterogênea família Herpesviridae, composta por inúmeros patógenos animais e humanos, como citomegalovírus (CMV), Epstein-Barr (EBV) e varicela-zoster (VVZ). O HSV é dividido em dois sorotipos, HSV-1 e HSV-2, responsáveis pelos herpes labial e genital, respectivamente⁽¹⁾. O vírus tem como característica biológica o rápido crescimento em cultivo celular, uma ampla gama de hospedeiros e a capacidade, comum a todos os herpesvírus, de se manter latente em células de seus hospedeiros por tempo indeterminado⁽²⁾.

O herpes é uma das infecções humanas mais comuns^{(2, 3)}, embora manifestações mais severas possam ocorrer entre neonatos e indivíduos imunocomprometidos, incluindo HIV-positivos e transplantados⁽⁴⁾. De fato, nesses pacientes, as manifestações causadas pelo herpes podem variar de formações vesiculares limitadas às regiões orofacial e genital até doença disseminada em pele e mucosas, com freqüente acometimento do sistema nervoso central (SNC), deixando seqüelas em 80% de suas vítimas⁽⁵⁾. Além da gravidade e da cronicidade da doença, é comum o relato de isolamento de amostras resistentes ao aciclovir (ACV), a primeira droga de escolha para o tratamento contra o vírus nesse tipo de paciente⁽⁶⁾. Este fator complicador dificulta e redireciona o tratamento para drogas alternativas como valaciclovir, penciclovir e foscarnet, embora problemas de toxicidade e resistência viral já tenham sido detectados para estas drogas^(7-10). Em relação ao diagnóstico laboratorial, o isolamento viral (IV), apesar de lento e trabalhoso, ainda é considerado o método padrão para diagnóstico do HSV, e se baseia na observação de uma cultura de células sob microscópio ótico à procura do efeito citopático (ECP) do vírus sobre a célula⁽¹¹⁾. Entretanto novas técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a captura híbrida, estão em desenvolvimento e vêm sendo capazes de detectar pequenas quantidades de genoma viral numa amostra de forma mais rápida (algumas horas, em contraste com os sete dias, em média, do isolamento)^(11-13). Apesar de serem evidentes as vantagens das técnicas moleculares em relação ao isolamento do vírus em cultivo celular, sua aplicação de acordo com a população sob investigação (transplantados e não-transplantados) ainda não tinha sido avaliada.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi comparar e avaliar o emprego de técnicas moleculares e isolamento viral para diagnóstico do HSV em amostras de pacientes transplantados e não-transplantados.

Material e métodos

Coleta de amostras

Oitenta e quatro amostras consecutivas com suspeita clínica de herpes (uma por indivíduo) foram coletadas de 47 transplantados (tx) e de 37 não-transplantados (não-tx) atendidos no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (HUCFF/UFRJ), de junho de 2001 a julho de 2002. Apenas os indivíduos tx estavam recebendo ACV intravenoso como profilaxia. As amostras foram coletadas de vesículas da pele e de mucosas oral, vaginal e perianal, com auxílio de swab umedecido. O material coletado foi levado ao nosso laboratório em meio de transporte (1ml de MEM [Eagle] com 100UI de penicilina, 20µg/ml de gentamicina e 2,5µg/ml de fungizona) e mantido a 4ºC antes do manuseio.

Método de isolamento viral em cultura de células

O isolamento viral foi realizado através da inoculação de 100µl do material vesicular coletado dos pacientes em cultura de células vero (em duplicatas), crescidas nos tubos 13x100 em 1ml de meio de cultura MEM (Eagle) com 2% de soro fetal bovino (Gibco) e acrescida de antibióticos. A cultura de células foi observada diariamente à procura de ECP característico promovido pelo HSV (arredondamento e morte celular) por duas semanas. Na ausência de ECP, passagens cegas eram feitas no 15º dia e o procedimento se repetia mais uma vez.

Identificação do sorotipo do HSV por imunofluorescência direta

A técnica de imunofluorescência direta (IFD) é utilizada para confirmação e sorotipagem do HSV proveniente de isolamento do vírus em cultura de células. Basicamente, células vero apresentando 80% de ECP foram vigorosamente agitadas para separação e centrifugadas (3 mil RPM/5min). Da suspensão celular, 200µl (10⁶ células/1ml de solução tampão salina de fosfato [PBS]) foram centrifugados em lâmina com auxílio de uma citocentrífuga. Após isso, as células aderidas à lâmina foram fixadas com acetona fria por 10min em temperatura ambiente. Anticorpos monoclonais específicos (Pasteur) foram adicionados às células fixadas e incubados à temperatura ambiente por 45 min em câmara escura. Controles positivos e negativos foram utilizados em cada ensaio. Depois da incubação, as lâminas foram lavadas com PBS (pH 7,4) e observadas em microscópio de fluorescência (Zeiss) à procura de corpúsculos de inclusão, característicos do HSV.

Diagnóstico e tipagem das amostras por PCR

Para a realização das técnicas de PCR (multiplex PCR e nested multiplex PCR), uma extração prévia do DNA viral foi feita com proteinase K (Gibco BRL), de acordo com instruções do fabricante. Para o mPCR, foram empregados primers (Gibco BRL) específicos para ambos os sorotipos de HSV e para cada um deles, separadamente (Tabela 1). No caso do nmPCR, primers (Gibco BRL) para os genes US-4 e UL-42, específicos para HSV-2 e HSV-1, respectivamente, foram empregados (Tabela 1). O mPCR foi feito em um volume de 50µl contendo 2,5µl da amostra clínica, 1,5mM de MgCl, 50mM de KCl, 10mM de Tris/HCl, 200µM de dNTPmix, 0,2µM de cada primer e 2,5U de taq-polymerase (Gibco-BRL). A amplificação foi realizada em 35 ciclos tal como segue: desnaturação a 94ºC por 48s, anelamento a 55ºC por 18s e alongamento a 72ºC por 48s. A primeira fase do nmPCR foi feita em 25µl de solução contendo 5µl da amostra clínica, 1,5mM de MgCl, 50mM de KCl, 10mM de Tris/HCl, 440µM de dNTPmix, 0,44µM de cada primer externo e 2,5U de taq-polymerase. A amplificação foi realizada como já descrito. Na segunda fase, 5µl do material amplificado obtido no primeiro ciclo foram reamplificados sob as mesmas condições da primeira fase, utilizando-se 0,2µM de cada primer interno (Tabela 1). A amplificação foi feita em 15 ciclos: desnaturação a 94ºC por 48s, anelamento a 65ºC por 18s e alongamento a 72ºC por 48s. Os amplicons foram adicionados ao gel de agarose (2%) previamente corado com brometo de etídio para eletroforese por duas horas. Após esse período o gel foi visualizado em leitor de ultravioleta.

Avaliação da capacidade de detecção das técnicas de diagnóstico empregadas

Com o objetivo de comparar os dois métodos de PCR utilizados neste estudo com o isolamento viral, desenvolvemos um teste semelhante ao empregado por Diaz-Mitoma et al.⁽¹⁴⁾. Amostras-padrão de HSV-1 e HSV-2 foram diluídas (1:10) e 50µl de cada diluição (amostra bruta até a diluição de 10^-8) foram inoculados em tubos contendo células vero. Após 48h, a cultura celular foi observada na procura de efeito citopático induzido pelo HSV. O sobrenadante de cada tubo foi coletado e submetido aos PCRs como descrito anteriormente.

Resultados

Isolamento do HSV em cultura celular e sorotipagem por imunofluorescência direta

Das 84 amostras inoculadas em cultura de células vero, 24 (33,3%) apresentaram efeito citopático sugestivo de HSV (Tabela 2). O isolamento viral detectou 25/37 (67,6%) e 3/47 (6,4%) amostras de pacientes tx e não-tx, respectivamente (Tabela 2). A técnica de IFD revelou que 24/28 (85,7%) e 4/28 (14,3%) das amostras pertenciam aos subtipos HSV-1 e HSV-2, respectivamente (Tabela 3, Figura 1). Das 4/28 (14,3%) amostras caracterizadas como sorotipo 2, 2/4 (50%) foram coletadas da área genital, enquanto as outras duas da região orolabial. Das 24/28 (85,7%) amostras caracterizadas como sorotipo 1, 20/24 (83,3%) foram coletadas da região orolabial, 3/24 (12,5%) da região perianal e 1/24 (4,2%) do dedo (Tabela 3).

Detecção e tipagem das amostras por multiplex PCR e nested multiplex PCR

Das 84 amostras, 29 (34,5%) foram positivas por mPCR, enquanto 36 (42,8%), por nmPCR (Tabela 2, Figuras 2 e 3). O mPCR detectou 25/37 (67,6%) e 4/47 (8.,5%) amostras de pacientes não-tx e tx, respectivamente, enquanto o nmPCR, 26/37 (70,3%) e 10/47 (21,3%) amostras de pacientes não-tx e tx, respectivamente (Tabela 2). O nmPCR caracterizou 32/36 (88,8%) amostras de HSV-1 e 4/36 (11,1%) como HSV-2, enquanto o mPCR detectou as mesmas 4/29 (13,8%) amostras de HSV-2 e 25/29 (86,2%) de HSV-1 (Tabela 3). Nenhuma discrepância em relação à tipagem das amostras ocorreu entre as técnicas moleculares e o isolamento viral (Tabela 3).

Avaliação da capacidade de detecção das técnicas empregadas

A comparação entre o isolamento viral e as técnicas de PCR (mPCR e nmPCR) revelou que o efeito citopático em cultura de células foi observado até a diluição de 10^-1, enquanto o genoma viral foi detectado visualmente até as diluições de 10^-3 e 10^-5 para o mPCR e o nmPCR, respectivamente. O resultado, portanto, revelou que o nmPCR foi capaz de detectar o HSV em uma quantidade 10² e 10⁴ menores do que as técnicas de mPCR e isolamento viral, respectivamente.

Discussão

As manifestações clínicas causadas pelo vírus herpes simples variam do herpes labial comum até encefalites fatais e necrose de órgãos. Essa enorme variabilidade de sintomas clínicos depende da virulência e da resistência da cepa viral à medicação, além do status imunológico do paciente⁽¹⁵⁾.

O diagnóstico laboratorial para o HSV tem aplicação complementar para as manifestações comuns causadas pelo vírus (vesículas orolabiais e genitais), embora seja importante para indivíduos imunocomprometidos, transplantados, gestantes, recém-natos e em suspeita de encefalite. Em todos os casos e, principalmente, para os de maior gravidade, é necessário o desenvolvimento de técnicas diagnósticas mais rápidas e sensíveis que possam detectar o vírus em tecidos diferentes e em pequenas quantidades^{(16, 17)}.

O isolamento viral, padrão-ouro para o diagnóstico de herpes, apesar de sua boa sensibilidade^{(18, 19)}, tem sido substituído por técnicas moleculares como a PCR^(20-22). Tais técnicas são de rápida execução e mais sensíveis do que as convencionais.

A técnica de nmPCR empregada neste estudo foi capaz de detectar um número significativamente maior de amostras provenientes de pacientes tx (p = 0,05), embora não tenham sido observadas diferenças significantes quando comparamos essa técnica com o mPCR e o isolamento viral para amostras de pacientes não-tx (p = 0,95) (Tabela 2). Esse aparente desacordo pode ser explicado pelo fato de os pacientes tx sob contínuo tratamento profilático com o ACV apresentarem amostras com baixa carga viral, permitindo que uma técnica mais sensível, como o nmPCR, possa detectar o vírus. O desempenho superior do nmPCR já era esperado, pois se trata de uma técnica que se diferencia das demais pela característica metodológica de realizar PCR sobre um amplicom (nested), aumentando ainda mais as chances de detecção. Já os pacientes não-tx (sem tratamento antiviral profilático) apresentariam amostras com carga viral mais elevada, permitindo que técnicas com menor sensibilidade, como o mPCR e o isolamento viral, detectassem o HSV mesmo quando um desempenho superior do mPCR fosse esperado (34,5% vs. 33,3% do isolamento viral). Esse fato também explica o baixo índice de positivos entre os transplantados de uma forma geral.

Além dos pacientes tx, algumas amostras exclusivamente diagnosticadas por nmPCR eram provenientes de mucosites e úlceras, que possuem carga viral notadamente mais reduzida. Tal capacidade de detecção foi confirmada quando observamos uma superioridade de 2 e 4log do nmPCR em relação ao mPCR e o isolamento viral, respectivamente.

Em relação à presença de sintomas, observamos que 62,5% dos indivíduos tx apresentavam manifestações semelhantes às do herpes, notadamente mucosite, sem a presença do HSV, em contraste com apenas 16,6% dos pacientes não-tx (p < 0,002) (dado não-apresentado). A medicação antiviral, somada a drogas imunossupressoras e agentes oportunistas, pode ter causado essa alta prevalência de manifestações herpes-like⁽¹⁴⁾, que devem ser consideradas previamente à medicação.

Conclusão

Os resultados aqui obtidos indicam que a técnica de nmPCR, apesar de apresentar taxas de detecção semelhantes ao PCR e ao isolamento viral para pacientes não-tx, mostrou-se uma ferramenta extremamente útil para o diagnóstico de herpes, especialmente para situações em que os métodos convencionais são falhos, como para pacientes transplantados e em suspeita de encefalite herpética, em que um resultado rápido e sensível é vital⁽²³⁾.

Rafael B. Varella

Rua Andrade Neves, 269/203 – Tijuca

CEP 20510-230 – Rio de Janeiro-RJ

Tel.: [phone]

E-mail: [e-mail]

Primeira submissão em 10/08/04

Última submissão em 19/07/05

Aceito para publicação em 04/08/05

Publicado em 20/08/05

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Endereço para correspondência

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Out 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Revisado
  19 Jul 2005
• Recebido
  10 Ago 2004
• Aceito
  04 Ago 2005