Detecção do gene mecA em estafilococos coagulase negativa resistentes à oxacilina isolados da saliva de profissionais da enfermagem

Detection of mecA gene in oxacillin-resistant coagulase-negative staphylococci isolated from the saliva of nursing professionals

ARTIGO ARTICLE

Detecção do gene mecA em estafilococos coagulase negativa resistentes à oxacilina isolados da saliva de profissionais da enfermagem

Detection of mecA gene in oxacillin-resistant coagulase-negative staphylococci isolated from the saliva of nursing professionals

Juliana de Oliveira Rosa^I; Josely Pinto de Moura^II; Marinésia Aparecida Prado Palos^III; Elucir Gir^IV; Cleômenes Reis^I; André Kipnis^I; Sílvia Rita Marin da Silva Canini^IV; Fernando Belissimo-Rodrigues^V; Fabiana Cristina Pimenta^I

^IInstituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO

^IIPrograma Interunidades de Doutoramento em Enfermagem da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

^IIIFaculdade de Enfermagem Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO

^IVEscola de Enfermagem de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP

^VMédico Infectologista. Vice-presidente da Comissão de Controle de Infecção hospitalar do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Estafilococos coagulase negativa estão frequentemente associados às infecções nosocomiais e os profissionais da saúde podem ser reservatório e dissemina-los no hospital e comunidade. O objetivo desse estudo foi identificar espécies de estafilococos coagulase negativa isolados da saliva de profissionais da enfermagem, determinar o perfil de resistência e detectar o gene mecA. Foram selecionados 100 estafilococos coagulase negativa, sendo 41 identificados como Staphylococcus epidermidis, 25 Staphylococcus saprophyticus, 18 Staphylococcus haemolyticus, 8 Staphylococcus cohnii, 4 Staphylococcus lugdunenses, 3 Staphylococcus capitis, e 1 Staphylococcus Simulans. Desses, 32% apresentaram resistência à oxacilina, 84,4% à mupirocina, 32% à cefoxitina, e todos sensíveis a vancomicina. Dos estafilococos coagulase negativa resistentes à oxacilina, 93,7% desenvolveram-se no agar oxacilina (6µg/ml) e o gene mecA foi detectado em 75%. Os resultados sinalizam que maiores investimentos devem ser direcionados a identificação das espécies de estafilococos coagulase negativa nas instituições de saúde e na comunidade.

Palavras-chaves: Estafilococos coagulase negativa. Equipe de Enfermagem. Saliva. Resistência. Gene mecA.

ABSTRACT

Coagulase-negative staphylococci are frequently associated with nosocomial infections, and healthcare professionals can be reservoirs and spread them in hospitals and in the community. The aim of this study was to identify species of coagulase-negative staphylococci isolated from the saliva of nursing professionals, determine the resistance profile and detect the mecA gene. One hundred coagulase-negative staphylococci were selected: 41 were identified as Staphylococcus epidermidis, 25 as Staphylococcus saprophyticus, 18 as Staphylococcus haemolyticus, eight as Staphylococcus cohnii, four as Staphylococcus lugdunenses, three as Staphylococcus capitis and one as Staphylococcus simulans. Of these, 32% presented oxacillin resistance, 84.4% mupirocin resistance and 32% cefoxitin resistance, and all were vancomycin sensitive. Among the oxacillin-resistant coagulase-negative staphylococci, 93.7% developed in oxacillin agar (6µg/ml) and the mecA gene was detected in 75%. The results indicate that higher investments should be directed towards identifying coagulase-negative staphylococcus species in healthcare institutions and in the community.

Key-words: Coagulase-negative staphylococci. Nursing team. Saliva. Resistance. mecA gene.

Os indivíduos são colonizados desde o nascimento, em diversos sítios anatômicos, por estafilococos coagulase negativa (ECN). Estes microrganismos podem se apresentar como bactérias oportunistas emergentes, especialmente em pacientes hospitalizados, imunocomprometidos, prematuros e com dispositivos implantados^{16 26}. Podem causar infecção no sítio primário de colonização ou disseminarem causando infecções hospitalares graves como bacteremias, spticemias e sepsis neonatal^{18 25 38}.

A similaridade dos ECN isolados do sangue e de cateter de clientes hospitalizados, com os recuperados do mesmo paciente em mucosas de orofaringe, orelha, nariz, axila, braço e perna tem sido relatada^{17 25}. Estudo que avaliou pacientes submetidos ao transplante de células tronco hematopoéticas, com quadro clínico de bacteremias, constatou similaridade dos ECN isolados do sangue com os recuperados da orofaringe⁴. Os ECN apresentam uma importante habilidade de formar biofilmes e podem estar associados a dispositivos no ambiente hospitalar^{36 37 41}.

Outro fator relevante em relação aos ECN é a sua capacidade de apresentar resistência a vários antimicrobianos, principalmente aos utilizados no ambiente hospitalar, aumentando assim o risco de falha terapêutica^{10 14 17 29 33}.

A resistência dos ECN à vancomicina apesar de pouco freqüente, já é realidade no Brasil, conforme constatado em estudo³⁹ que detectou 4 ECN (2 Staphylococcus capitis, um Staphylococcus haemolyticus e um Staphylococcus epidermidis) resistentes a esse antibiótico em isolados de profissionais da saúde. Casos de infecções causadas por Staphylococcus sp resistentes à vancomicina também têm sido descritos³³.

A prevalência de ECN oxacilina resistente é elevada na maior parte dos hospitais no Brasil e no mundo e a identificação das espécies desse grupo é de extrema importância, pois a interpretação dos halos de inibição da oxacilina para Staphylococcus epidermidis é diferente das outras espécies. Um fator a ser considerado é que resultados discrepantes entre oxacilina e cefoxitina podem ser encontrados quando os ECN são avaliados pelo teste de disco difusão¹⁴.

Com relação às medidas de controle dos microrganismos resistentes, entre eles os ECN, a literatura faz referência à vigilância microbiológica prospectiva para identificar pacientes colonizados. Medidas como o isolamento dos clientes colonizados ou infectados, afastamento temporário do profissional colonizado de suas atividades, a adesão às precauções-padrão, higienização das mãos, limpeza cuidadosa do ambiente, controle da prescrição dos antimicrobianos de amplo espectro e tratamento dos pacientes colonizados e dos profissionais de saúde envolvidos nesses episódios devem ser implementadas^{10 27 36}. A colonização e transmissão de ECN resistentes relacionadas ao profissional de saúde deve ser investigada^{17 39}.

ECN estão associados a diversas infecções, o que requer o estabelecimento de estratégias de controle e prevenção¹¹. Desta forma, este estudo teve como objetivo identificar as espécies de ECN isolados da saliva de profissionais da enfermagem, determinar o perfil de resistência à oxacilina e detectar o gene mecA nos isolados resistentes.

MATERIAL E MÉTODOS

Estafilococos coagulase negativa. Foram selecionados 100 ECN isolados da saliva de profissionais da enfermagem, que participaram de um estudo maior, participantes de um programa interinstitucional de vigilância de estafilococos resistentes à oxacilina, de um estudo transversal realizado nas unidades de terapia intensiva, clínica médica, clínica cirúrgica e gineco-obstétrica de um hospital escolas de nível terciário do interior do estado de São Paulo. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Foram incluídos todos os profissionais que aquiesceram participar do estudo mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e que estavam em exercício profissional ativo, no hospital, durante o período do estudo e que não estavam em uso de antimicrobiano ou não os tinham utilizado nos últimos 30 dias. As coletas de saliva ocorreram no período de maio de 2007 a maio de 2008, de cada profissional foram coletadas 3 amostras com intervalo médio de três meses.

Isolamento e identificação. A saliva foi homogenizada por um minuto, submetida à diluição decimal em solução salina (0,8%) e semeada, em meio de cultura seletivo, agar manitol salgado⁴². O período de incubação foi de 24 a 48 horas a 37ºC. A identificação dos estafilococos coagulase negativa foi baseada em provas bioquímicas (catalase, coagulase em tubo e lâmina, DNAse, lecitinase, urease, acetoína, fermentação de carboidratos - frutose, manose, maltose, trealose, manitol, xilose, lactose e sacarose, suscetibilidade à bacitracina, novobiocina e polimixina e descarboxilação da ornitina)^{23 24}. O controle de qualidade foi realizado com cepas ATCC de Staphylococcus aureus 25923 e 29213 Staphylococcus epidermidis 12228, Staphylococcus haemolyticus 29970 e Staphylococcus saprophyticus 15305. A produção de lecitinase pelos ECN foi verificada pela inoculação em agar contendo gema de ovo – agar Naito^{20 26}.

Teste de suscetibilidade. Os estafilococos coagulase negativa identificados foram submetidos ao teste de disco-difusão, segundo protocolo CLSI/M2-A9 (2005)⁹. Foram utilizados discos de vancomicina, cefoxitina, oxacilina e mupirocina (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra).

Agar Mueller Hinton suplementado com 4% de cloreto de sódio e oxacilina (6µg/ml) foi utilizado como triagem para confirmar a resistência à oxacilina. O desenvolvimento de até mesmo uma colônia foi considerada prova positiva.

Detecção do gene mecA. Os ECN que apresentaram resistência à oxacilina e se desenvolveram no agar triagem oxacilina, foram cultivados em 3mL de caldo tríplice soja por 24 horas a 37ºC para a extração do DNA segundo Murakami cols (1991).

O gene mecA foi detectado pela técnida da polymerase chain reation (PCR), utilizando os primers mecA F5'-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3' e mecA R5'-CTGGAACTTGTTGAGCAGAG-3' de acordo com Murakami cols³¹. Os ciclos da reação foram: 1 ciclo de 94ºC por 3 minutos; 35 ciclos de 92ºC por 45 segundos; 50ºC por 1 minuto; 72ºC por 1 minuto; e 1 ciclo a 72ºC por 4 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforose em gel de agarose 1,5% contendo brometo de etídio; foi utilizado marcador de massa molecular de 1Kb. A presença de fragmentos de 533pb resultantes dos produtos de amplificação foram visualizados em transiluminador e fotografados.

RESULTADOS

Os ECN isolados da saliva de profissionais de enfermagem foram identificados nas seguintes espécies: 41 (41%) Staphylococcus epidermidis, 25 (25%) Staphylococcus saprophyticus, 18 (18%) Staphylococcus haemolyticus, 8 (8%) Staphylococcus cohnii, 4 (4%) Staphylococcus lugdunenses, 3 (3%) Staphylococcus capitis e 1 (1%) Staphylococcus simulans (Tabelas 1, 2 e 3).

Os resultados dos testes de suscetibilidade evidenciaram que 32 (32%) dos ECN isolados exibiram resistência à oxacilina, 84% à mupirocina, 43,7% à cefoxitina, e todos os isolados exibiram suscetibilidade à vancomicina (Tabelas 2 e 3). Dos 100 isolados de ECN, 16% eram produtores de lecitinase, dentre eles 15,6% eram oxacilina resistentes.

Dos 32 ECN detectados pelo teste de disco difusão como resistentes à oxacilina, foram cultivados em agar triagem oxacilina (6µg) suplementado com cloreto de sódio a 4% e também submetidos à detecção do gene mecA. Desses, 93,7% desenvolveram-se no agar triagem oxacilina e o gene mecA foi detectado em 24 (75%). Ressalta-se que dentre os 20 Staphylococcus epidermidis, 15 (62,5%) apresentaram o gene mecA (Tabela 2).

DISCUSSÃO

No presente estudo, os ECN foram identificados como Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus lugdunenses, Staphylococcus capitis e Staphylococcus simulans. A maioria das instituições de saúde não identifica as espécies de ECN de rotina, dada a necessidade de execução de inúmeros testes bioquímicos, o que se constitui num trabalho relativamente laborioso e de custo elevado.

Rotineiramente, a identificação dos estafilococos é baseada apenas nos aspectos morfológicos das colônias, coloração de Gram, catalase e produção de coagulase, o que permite apenas classificar esses estafilococos em coagulase negativa ou em Staphylococcus aureus¹². No presente estudo, foi utilizado um esquema de 18 provas bioquímicas para determinar as espécies dos 100 ECN selecionados, o que permitiu a caracterização das espécies. Ressalta-se que a identificação das espécies é determinante para a escolha da terapêutica adequada, uma vez que existem variações na interpretação de halos no antibiograma de acordo com a espécie de ECN²³.

A identificação dos ECN é de grande importância para a associação dessas espécies com casos de infecções específicas, tendo em vista que além dos Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus, outras espécies de estafilococos têm apresentado virulência e resistência intrínseca a diferentes antimicrobianos, como o Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis e o Staphylococcus schleiferi².

Vale destacar que o Staphylococcus epidermidis foi a espécie mais prevalente (41%) na saliva dos profissionais investigados, o que está de acordo com a literatura, pois esta é a espécie de ECN detectada com maior freqüência em espécimes coletadas dos casos de infecções em humanos, em particular naquelas associadas com cateteres intravasculares. Além de ser o principal agente causador de bacteremia, endocardite de válvula protética, infecção relacionada à diálise peritoneal e ferida cirúrgica, no ambiente hospitalar^{16 19 34}.

Entretanto, as espécies de Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemolyticus também foram identificadas com frequência na saliva desses profissionais, sendo 25% e 18%, respectivamente. O Staphylococcus haemolyticus representa a segunda espécie mais frequente em infecções relacionadas a cateter, septicemia e endocardites, enquanto que o Staphylococcus saprophyticus apresenta-se como importante agente causador de infecção do trato urinário em mulheres jovens¹⁶. As infecções causadas por Staphylococcus lugdunensis são pouco freqüentes em humanos, não obstante, quando ocorrem são graves e de progressão fulminante. Esse microrganismo tem sido associado a casos de endocardite de válvula nativa, a qual é caracterizada por uma fraca resposta aos tratamentos antimicrobianos convencionais, com importante destruição valvular, formação de abscesso miocardial, altas taxas de embolia periférica e aumento na mortalidade, incluindo os casos com tratamento cirúrgico^{3 28}.

Dos 100 ECN identificados, 32% apresentaram resistência à oxacilina nos testes de difusão em disco, 84,4% à mupirocina e 43,7% à cefoxitina, porém, todos os isolados apresentaram suscetibilidade à vancomicina. A resistência elevada dos ECN à mupirocina tem sido evidenciada, provavelmente devido ao uso dessa substância para a descolonização de indivíduos portadores de Staphylococcus aureus oxacilina resistentes^{9 10 19}. Esse resultado sinaliza para, a importância de se repensar as políticas de controle de microrganismos multirresistentes nos serviços de saúde.

Salienta-se ainda que, dos 32% ECN com resistência a oxacilina, detectada pelo teste de difusão de disco, 93,7% desenvolveram no agar com oxacilina, confirmando o perfil de resistência desses isolados. Estudo¹² realizado com recém-nascidos, evidenciou que 50% dos ECN isolados eram resistentes à oxacilina. Investigação que avaliou Staphylococcus aureus e ECN isolados da mucosa nasal de estudantes de medicina revelou que 23,5% dos ECN foram resistentes à oxacilina, enquanto todos os Staphylococcus aureus foram sensíveis a esse antibiótico, ressaltando que os ECN podem funcionar como um reservatório de resistência em seus portadores¹⁷.

Outro ponto relevante diz respeito à capacidade desses microrganismos em sintetizar a enzima lecitinase, capaz de degradar a bainha de mielina, sendo esse mecanismo, um fator de virulência de grande importância para os estafilococos, tanto para os Staphylococcus aureus, como para os ECN²⁰. Nesse estudo, foram identificados 16% de ECN produtores de lecitinase, dentre eles 15,6% eram oxacilina resistentes, sinalizando o potencial de virulência desses ECN nos indivíduos colonizados.

O gene mecA codifica a proteína alterada denominada PBP 2a da parede bacteriana, presente nos isolados de estafilococos oxacilina resistentes. Com relação à detecção desse gene em estafilococos, a maioria dos estudos enfoca os Staphylococcus aureus, cuja freqüência de detecção tem variado de 14% a 35,5%^{1 7 13 22}. Apesar das investigações sobre a presença do gene mecA em isolados de ECN resistentes à oxacilina serem escassas, destaca-se que o percentual de resistência à oxacilina tem variado de 68,2% a 71%^{15 34}. No presente estudo, em 75% do ECN oxacilina resistentes detectou-se o gene mecA dos isolados da saliva de profissionais de enfermagem.

Os ECN estão entre os principais microrganismos emergentes, nosocomiais e com resistência a vários antimicrobianos, sendo que os ECN multirresistentes são comuns em pacientes hospitalizados. A emergência deste microrganismo tem limitado o arsenal terapêutico o que contribui para um risco aumentado de fracasso no tratamento^{17 29 32}.

Vale ressaltar que este estudo é pioneiro no que se refere à presença do gene mecA em ECN isolados da saliva de profissionais da saúde saudáveis. Estes achados sinalizam que maiores investimentos devem ser direcionados a identificação das espécies de ECN tanto nas instituições de saúde quanto na comunidade, bem como o perfil de resistência desse grupo de microrganismos, uma vez que os profissionais de saúde podem se constituir num importante reservatório desses estafilococos resistentes.

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Recebido para publicação em 28/01/2009

Aceito em 20/07/2009

Apoio Financeiro: FAPESP (Processo 05/58463-0)

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Set 2009
• Data do Fascículo
  Ago 2009

Histórico

• Aceito
  20 Jul 2009
• Recebido
  28 Jan 2009