Desenvolvimento e validação de método por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação simultânea das impurezas timina e timidina na matéria-prima estavudina

Development and validation of a high performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of the impurities thymine and thymidine in stavudine bulk drug

HPLC; stavudine; impurities

ARTIGO

Desenvolvimento e validação de método por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação simultânea das impurezas timina e timidina na matéria-prima estavudina

Development and validation of a high performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of the impurities thymine and thymidine in stavudine bulk drug

Gisele Rodrigues da Silva^*; Felipe Antonacci Condessa; Gérson Antônio Pianetti; Elzíria de Aguiar Nunan; Ligia Maria Moreira de Campos

Departamento de Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Pres. Antônio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte - MG, Brasil

ABSTRACT

A HPLC method was developed to quantify thymine and thymidine impurities in stavudine bulk drug. The separation was carried out in isocratic mode using methanol/water (20:80) as mobile phase, a C₁₈ column and UV detection at 266 nm. The method provided selectivity based on peak purities and resolution among peaks. It was linear over the range of 0.5-5.0 µg/mL. The quantitation limits were 0.021 µg/mL for thymine and 0.134 µg/mL for thymidine. The average accuracies of three concentrations ranged from 97.06 to 102.61% and precision was close to 1%. The method showed robustness, remaining unaffected by deliberate variations in relevant parameters.

Keywords: HPLC; stavudine; impurities.

INTRODUÇÃO

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença infecciosa provocada pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). O HIV é um retrovírus com genoma RNA, que necessita, para multiplicar-se, da enzima transcriptase reversa, responsável pela transcrição do RNA viral para DNA, que pode, então, se integrar ao genoma da célula do hospedeiro.¹

As conseqüências clínicas da infecção pelo vírus HIV devem-se à sua capacidade em desarmar o sistema imune, devido à depleção dos linfócitos CD4-positivos (CD4+), tornando o hospedeiro infectado suscetível às infecções oportunistas fatais.¹

O principal objetivo da terapia anti-retroviral é retardar a progressão da imunodeficiência e/ou restaurar, tanto quanto possível, a imunidade, aumentando o tempo e a qualidade de vida da pessoa infectada.²

Um dos fármacos utilizados na terapia anti-retroviral é a estavudina. Trata-se de um inibidor da transcriptase reversa análogo de timidina, um nucleosídeo de ocorrência natural. Ao ser rapidamente fosforilada por enzimas quinases celulares, gera-se um metabólito ativo, o trifosfato de estavudina que, por sua vez, impede a replicação do HIV. Há inibição da enzima transcriptase reversa do HIV por competição com o substrato natural trifosfato de desoxitimidina, resultando na finalização prematura da síntese do DNA viral.³

A timina e a timidina são descritas como sendo as principais impurezas relacionadas à estavudina (Figura 1). A timina é considerada o principal produto de degradação da estavudina. Em estudos de análise térmica, o aquecimento da estavudina, após a fusão, promoveu a decomposição do fármaco e formação da timina como produto principal.⁴ Relatou-se também que a timina é o principal produto da degradação hidrolítica e oxidativa da estavudina.⁵ A timidina pode ser considerada uma impureza de síntese uma vez que é descrita como sendo um precursor químico utilizado em diferentes rotas de síntese da estavudina.^6,7

Vários métodos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com detecção na região do ultravioleta ou por espectrometria de massas, para a quantificação da estavudina, isolada ou associada a outros anti-retrovirais, encontram-se disponíveis na literatura, principalmente envolvendo sua determinação em fluidos biológicos.^8-15 Também é descrito um método alternativo, por espectrofotometria derivada, para a determinação simultânea de estavudina e lamivudina em dose fixa combinada.¹⁶

Santoro et al.¹⁷ desenvolveram e validaram um método por CLAE, em modo isocrático e detecção no ultravioleta (265 nm), para a quantificação simultânea de estavudina e timina em cápsulas.¹⁸ Recentemente, a Organização Mundial da Saúde (OMS)¹⁸ e a United States Pharmacopeia¹⁹ publicaram a monografia de estavudina matéria-prima, na qual está descrito um método para a determinação das impurezas (timina e timidina) presentes na estavudina. Trata-se de um método por CLAE, com eluição em gradiente, cujo tempo de duração é de 40 min.

Apesar dos vários métodos citados para a quantificação da estavudina, constatou-se a ausência de publicações que descrevam um método de CLAE, em modo isocrático, para o controle de qualidade da matéria-prima estavudina, que permita a determinação simultânea das duas principais impurezas, timina e timidina.

No presente trabalho é descrito um método por CLAE, em fase reversa, modo isocrático e detecção no ultravioleta, desenvolvido e validado para a determinação simultânea das principais impurezas (timina e timidina) na estavudina matéria-prima. Pela sua simplicidade e rapidez, o método pode ser aplicado em análises rotineiras de controle de qualidade da matéria-prima estavudina.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

Padrões de trabalho

Estavudina (Instituto Vital Brasil S.A., Rio de Janeiro, Brasil - teor: 100,23%), timina (Sigma Aldrich, Alemanha - teor: mínimo de 99%), timidina (Sigma Aldrich, Alemanha - teor: mínimo de 99%).

Reagentes

Metanol (Merck, Darmstadt, Alemanha), água ultrapura obtida por sistema Milli-Q-Plus (Millipore, USA).

Matérias-primas

Estavudina matéria-prima 1 (Labogem S/A Química Fina e Tecnologia, São Paulo, Brasil), estavudina matéria-prima 2 (Shin Sei Kye Chemical Corporation, Coréia).

Equipamentos e condições cromatográficas

Cromatógrafo a líquido de alta eficiência Hewlett Packard, HP 1100, equipado com bomba quaternária HP 1100, forno de coluna, auto-injetor HP 1100, detector UV-Vis DAD HP 1100. Os dados cromatográficos foram analisados usando o programa HP Chem Station. Utilizou-se coluna Merck LiChrospher^® capeada C18 (5 µm, 250 x 4,6 mm d.i.), Lote L647933, mantida a 30 ºC. A fase móvel era constituída de mistura de 20 partes de metanol e 80 partes de água ultrapura. O fluxo da fase móvel foi de 1,0 mL/min, o volume de injeção de 20 µL e a detecção em 266 nm.

Método

Solução padrão estoque de timina e timidina

Transferiram-se cerca de 5 mg de timina e 5 mg de timidina para balão volumétrico de 50 mL. Acrescentaram-se 35 mL de água. Deixou-se em banho de ultra-som por 20 min. Completou-se o volume com o mesmo solvente. A solução padrão estoque de timina e timidina apresentou a concentração final de 100 µg/mL, para cada substância.

Solução padrão diluída de timina e timidina

Transferiu-se 1 mL da solução padrão estoque de timina e timidina para balão volumétrico de 50 mL. Completou-se o volume com a fase móvel. A solução resultante foi filtrada em membrana de 0,45 µm. A concentração final de 2 µg/mL, para cada substância, foi considerada a concentração de trabalho, o que corresponde ao limite máximo de 0,5% de cada impureza presente na estavudina.

Solução padrão de estavudina, timina e timidina

Transferiram-se cerca de 20 mg de padrão de estavudina para balão volumétrico de 50 mL. Acrescentaram-se, aproximadamente, 35 mL de fase móvel. Deixou-se em banho de ultra-som por 10 min. Transferiu-se 1 mL da solução padrão estoque de timina e timidina para o mesmo balão volumétrico. Completou-se o volume com a fase móvel. A solução resultante foi filtrada em membrana de 0,45 µm. A solução padrão de estavudina, timina e timidina apresentou as concentrações finais de 400 µg/mL de estavudina e de 2 µg/mL de cada impureza, respectivamente.

Solução padrão de estavudina

Transferiram-se cerca de 20 mg de padrão de estavudina para balão volumétrico de 50 mL. Acrescentaram-se, aproximadamente, 35 mL de fase móvel. Deixou-se em banho de ultra-som por 10 min. Completou-se o volume com a fase móvel. A solução resultante foi filtrada em membrana de 0,45 µm. A concentração final de 400 µg/mL de estavudina foi considerada a concentração de trabalho.

Solução amostra (matéria-prima)

Transferiram-se cerca de 20 mg de estavudina matéria-prima para balão volumétrico de 50 mL. Acrescentaram-se, aproximadamente, 35 mL de fase móvel. Deixou-se em banho de ultra-som por 10 min. Completou-se o volume com a fase móvel. A solução resultante foi filtrada em membrana de 0,45 µm. A solução amostra apresentou concentração final de 400 µg/mL.

Validação

Os parâmetros de validação avaliados foram os designados no Guia International Conference on Harmonisation (ICH),²⁰ para métodos de quantificação de impurezas, a saber, seletividade, linearidade, precisão intra-dia e inter-dias, exatidão, limites de quantificação e de detecção e robustez.

Seletividade

Demonstrou-se a seletividade por meio da completa separação entre os picos do padrão de estavudina, de timina e timidina, análise dos parâmetros cromatográficos: resolução, fator de cauda e fator de retenção e análise da pureza dos picos traçando-se espectros no ultravioleta em cinco pontos diferentes de cada pico.

Linearidade

Transferiram-se alíquotas adequadas da solução padrão estoque de timina e timidina para balões volumétricos de 50 mL de modo a obter, após diluição com a fase móvel, concentrações de 25, 50, 100, 150, 200 e 250% da concentração de trabalho, estipulada como sendo de 2 µg /mL. As soluções foram injetadas em triplicata. Traçou-se a curva analítica para cada substância. Calcularam-se a equação de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, o coeficiente de correlação (r) e o intercepto da curva com o eixo Y, e avaliou-se a distribuição normal dos resíduos (teste Shapiro-Wilk).

Precisão

Precisão intra-dia

Prepararam-se 6 soluções padrão diluída de timina e timidina. As soluções foram injetadas em duplicata. A precisão intra-dia foi expressa como o desvio padrão relativo (DPR) das determinações realizadas para cada substância, no 1º dia.

Precisão inter-dias

Prepararam-se 6 soluções padrão diluída de timina e timidina. As soluções foram injetadas em duplicata. A precisão inter-dias foi expressa como o DPR das 12 determinações realizadas para cada substância (reunião dos dados obtidos no 1º e no 2º dia).

Exatidão

Prepararam-se 3 soluções dos padrões de impureza contendo quantidade exatamente pesada de timina e timidina equivalente a 50, 100 e 150% da concentração de trabalho, correspondendo a 1, 2 e 3 µg/mL. Prepararam-se, também, soluções padrão de estavudina, na concentração final de 400 µg/mL, adicionadas de quantidade exatamente pesada de timina e timidina equivalente a 50, 100 e 150% da concentração de trabalho de cada impureza. Prepararam-se três soluções para cada concentração. As soluções foram injetadas em duplicata. A exatidão foi expressa como a porcentagem de recuperação (%RE) dos analitos adicionados à estavudina.

Limites de quantificação e de detecção

Os limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) para timina e timidina foram estimados utilizando-se os valores de desvio padrão (σ) do intercepto da linha de regressão, a inclinação (s) das curvas analíticas de cada substância e as expressões:

Robustez

Foram feitas alterações deliberadas nos seguintes parâmetros: fluxo da fase móvel (0,8 e 1,2 mL/min), temperatura (27 e 35 ºC) e colunas. Utilizaram-se três colunas, do mesmo lote da indicada em Materiais, denominadas A, B e C e classificadas pelo tempo de uso: A (coluna nova, ainda não utilizada), B (coluna utilizada unicamente no desenvolvimento do método) e C (coluna utilizada por longo tempo em análises diversificadas e de rotina no laboratório). Prepararam-se duas soluções padrão de estavudina, timina e timidina para cada modificação. As soluções foram injetadas em duplicata. Calculou-se a resolução entre os picos de timina e timidina e entre os de timidina e estavudina, após a modificação de cada parâmetro. Realizou-se também a análise de variância (ANOVA de uma classificação p < 0,05) entre as áreas de timina e timidina obtidas a partir do método validado e das condições cromatográficas alteradas.

Determinação do teor de timina e timidina na estavudina matéria-prima

Prepararam-se soluções amostra das duas matérias-primas (1 e 2) e padrão de estavudina, timina e timidina. As soluções foram injetadas em triplicata. Calculou-se o teor de timina e timidina nas soluções amostra a partir das áreas obtidas com a solução padrão de estavudina, timina e timidina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para iniciar o desenvolvimento do método de separação e quantificação de timina, timidina e estavudina, por CLAE, em fase reversa, foi consultada a monografia da zidovudina descrita na United States Pharmacopeia,¹⁹ onde estão relatadas as seguintes condições cromatográficas para a quantificação de zidovudina e timina: coluna C₁₈, fase móvel constituída de metanol e água (20:80), detecção em 265 nm e fluxo de 1 mL/min. Este método foi considerado referencial já que a zidovudina apresenta propriedades físico-químicas semelhantes às da estavudina. A zidovudina é um fármaco anti-retroviral análogo do nucleosídeo timidina. É ligeiramente solúvel em água, o valor de pka é de 9,7 e apresenta máximo de absorção em 266,5 nm em água. A estavudina, por sua vez, é solúvel em água, o valor de pka é de 10 e apresenta máximo de absorção em 266 nm em água.²¹

Considerando estes fatos, decidiu-se aplicar e, em seguida, otimizar, o método anteriormente descrito. A proporção de 20 partes de metanol e 80 partes de água na fase móvel promoveu força de eluição adequada, resultando em baixos tempos de retenção dos analitos, sem provocar prejuízos na resolução. Estabeleceu-se que o comprimento de onda de detecção seria 266 nm, devido à maior absortividade, nesse comprimento de onda, da estavudina e de suas substâncias relacionadas. Na Figura 2 está representado o cromatograma da separação de timina, timidina e estavudina nas condições adaptadas.

Validação

Seletividade

Os picos cromatográficos (Figura 2) correspondentes à timina, timidina e estavudina apresentaram completa separação em linha de base. Na Tabela 1 estão indicados os valores de resolução entre os picos e os respectivos fatores de cauda e de retenção. A resolução superior a 1,5 atesta a qualidade da separação cromatográfica. Os fatores de cauda próximos da unidade demonstram a simetria dos picos, o que é preferencial para a quantificação inequívoca dos analitos. Os fatores de retenção encontram-se dentro da faixa de 0,5 a 20, demonstrando a força eluente adequada da fase móvel.¹⁵

Foram traçados os espectros no ultravioleta dos picos cromatográficos em 5 pontos diferentes. Todos os espectros de cada substância se sobrepuseram, demonstrando a pureza dos picos e confirmando a seletividade do método.

Linearidade

Na Tabela 2 são apresentadas as equações das curvas analíticas de timina e timidina, calculadas pelo método dos mínimos quadrados. Também constam da tabela os coeficientes de correlação, que foram superiores a 0,999, indicando forte correlação linear entre as concentrações das substâncias e as áreas dos picos. De acordo com as análises estatísticas realizadas, os interceptos não foram diferentes de zero, para o nível de significância de 5% (p> 0,05). A avaliação dos resíduos (teste Shapiro-Wilk) demonstrou a distribuição normal dos dados, indicando a adequação do modelo linear (p> 0,05). Todos os dados apresentados são demonstrativos da linearidade do método.

Precisão

Os resultados das precisões intra-dia e inter-dias estão indicados na Tabela 3. Os valores de DPR intra-dia e inter-dias da timina e timidina, próximos a 1%, atestam a precisão do método. Segundo Snyder et al.,²² para análise de impurezas presentes em baixas concentrações aceita-se que o valor de DPR não ultrapasse 5 ou 10% dependendo da complexidade da amostra.

Exatidão

A exatidão foi avaliada por meio da porcentagem de recuperação da timina e da timidina, nas concentrações 50, 100 e 150% da concentração de trabalho. As recuperações variaram entre 97,06 e 102,61%, nas três concentrações, o que possibilitou demonstrar a exatidão do método (Tabela 4).

Limites de quantificação e de detecção

Os limites de quantificação, para timina e timidina, foram de 0,021 e 0,134 µg/mL, respectivamente, e os de detecção, para timina e timidina, foram de 0,007 e 0,044 µg/mL, respectivamente.

Robustez

As áreas dos picos de timina e timidina obtidas a partir do método validado e em cada parâmetro modificado estão indicadas na Tabela 5. Os valores de resolução entre timina e timidina e entre timidina e estavudina foram sempre superiores ou iguais a 3, indicando que pequenas variações dos parâmetros não alteraram a separação entre os picos.

De acordo com a análise estatística realizada (ANOVA de uma classificação p < 0,05), não foi verificada diferença estatisticamente significativa entre as áreas de timina obtidas a partir do método validado e os parâmetros cromatográficos deliberadamente modificados (p > 0,05). Porém, ao se comparar as áreas obtidas utilizando todos os fatores entre si, utilizando como pós-teste, o teste de Tukey, observou-se diferença estatisticamente significativa entre os resultados obtidos com fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 ºC (p = 0,0458). Portanto, a modificação conjunta destes parâmetros cromatográficos (fluxo 0,8 mL/min e temperatura de 35 ºC) inviabiliza a obtenção de valores de áreas confiáveis de timina. Em relação à timidina, não se verificou diferença estatisticamente significativa entre as áreas obtidas a partir do método validado e os parâmetros modificados para avaliação da robustez.

Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que o método é robusto, em relação a pequenas e deliberadas alterações de fluxo da fase móvel, temperatura da coluna, colunas e equipamentos.

Determinação do teor de timina e timidina na estavudina matéria-prima

Realizou-se a determinação do teor de impurezas presentes na estavudina, matérias-primas 1 e 2, nas condições do método validado. Os critérios de aceitação utilizados foram os estabelecidos no certificado de análise do fabricante da estavudina matéria-prima 2: máximo de 0,5% para as impurezas individuais e de 1,5% para impurezas totais. Os valores de porcentagem de impurezas determinados pelo método proposto estão indicados na Tabela 6. Observou-se que a matéria-prima 1 apresentou porcentagens de timina e timidina inferiores a 0,5%, e porcentagem de impurezas totais inferior a 1,5%, incluindo timina e timidina. Já a matéria-prima 2 apresentou porcentagem de timina de 0,57%, superior ao máximo permitido de 0,5%.

CONCLUSÃO

Desenvolveu-se e validou-se um método por cromatografia líquida de alta eficiência para a determinação simultânea de timina e timidina, principais impurezas da estavudina. O método em fase reversa e modo isocrático demonstrou confiabilidade por ser rápido, seletivo, linear, preciso, exato e robusto, podendo ser aplicado em análises rotineiras do controle de qualidade da matéria-prima farmacêutica, estavudina.

Recebido em 10/10/07; aceito em 24/4/08; publicado na web em 22/9/08

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Dez 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Recebido
  10 Out 2007
• Aceito
  24 Abr 2008