Papel do fator de crescimento vascular endotelial na angiogênese e na retinopatia diabética

The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis and diabetic retinopathy

REVISÃO

Papel do fator de crescimento vascular endotelial na angiogênese e na retinopatia diabética

The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis and diabetic retinopathy

Fabiana Borba Valiatti^I; Daisy Crispim^I,II; Camila Benfica^III; Bruna Borba Valiatti^III; Caroline K. Kramer^I,II; Luís Henrique Canani^I,II

^IPrograma de Pós-Graduação em Ciências Médicas (Endocrinologia), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brasil

^IIServiço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil

^IIIUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), Porto Alegre, RS, Brasil

^{Correspondência para}

SUMÁRIO

A retinopatia diabética (RD) é uma complicação microvascular do diabetes melito, sendo importante causa de cegueira adquirida. Fatores angiogênicos, como o vascular endothelial growth factor (VEGF), estão envolvidos na patogênese da RD. O VEGF-A é uma citocina potente e multifuncional que atua por meio dos receptores VEGFR-1 e VEGFR-2 expressos no endotélio vascular causando aumento da permeabilidade vascular e estímulo à neovascularização em processos fisiológicos e patológicos. O VEGFR-2 é o principal mediador mitogênico, angiogênico e do aumento da permeabilidade vascular. Alguns polimorfismos do VEGF têm sido estudados na suscetibilidade e risco de progressão da RD. Importante associação entre o polimorfismo 634C/G e a presença de RD é relatada principalmente em relação ao alelo C. A homozigose CC estaria relacionada à RD proliferativa (RDP) e a níveis sérico e vítreo aumentados de VEGF, sugerindo que a presença do alelo C seja um fator de risco independente para RD. Os conhecimentos sobre o VEGF levaram ao desenvolvimento de agentes antiVEGF com o objetivo de inibir a neovascularização patológica e são uma realidade na prática médica do tratamento da RD.

Descritores: Diabetes melito; retinopatia diabética; fator de crescimento de endotélio vascular; polimorfismo

SUMMARY

Diabetic retinopathy (DR), a DM microvascular complication, is the leading cause of blindness. Angiogenic factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) are involved in the pathogenesis of DR. VEGF-A is a potent, multifunctional cytokine that acts through the receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 expressed in the vascular endothelium and causing increased vascular permeability and neovascularization stimulation in both physiological and pathological processes. The expression of VEGFR-1 is upregulated by hypoxia and is less responsive to VEGF compared to VEGFR-2 which is the main mediator mitogenic, angiogenic, and increased vascular permeability. VEGF polymorphisms have been studied in DR susceptibility and progression. Significant association between the polymorphism 634C / G and the presence of RD is reported mainly in relation to allele C. The homozygous CC is associated to proliferative RD and to increased vitreous and serum levels of VEGF suggesting that the presence of the C allele is an independent risk factor for RD. The knowledgement of VEGF lead to the development of anti-VEGF drugs (pegaptanib, ranibizumab and bevacizumab) aiming to prevent pathological neovascularization. The anti-VEGF therapy is a reality in practice medical treatment of DR.

Keywords: Diabetes mellitus; diabetic retinopathy; vascular endothelial growth factor; polymorphism

Estima-se que 7,6% da população brasileira seja portadora de diabetes melito (DM) (1,2). As complicações microvasculares são as maiores responsáveis pela morbidade no DM, sendo a retinopatia diabética (RD) a principal causa de cegueira adquirida em adultos (3).

No momento do diagnóstico, cerca de 21% dos pacientes com DM tipo 2 apresentam alguma evidência de RD (3). Os principais fatores de risco para o desenvolvimento da RD são tempo de doença (3), hiperglicemia (4,5) e pressão arterial elevada (5). Entretanto, alguns indivíduos não desenvolvem RD mesmo após exposição prolongada à hiperglicemia e à hipertensão arterial (6,7), sugerindo que os mecanismos dessa doença ainda não estão completamente esclarecidos.

Dentre os fatores potencialmente envolvidos na patogênese da RD, destacam-se fatores angiogênicos como o vascular endothelial growth factor (VEGF). Dessa forma, nosso objetivo é revisar o papel da angiogênese e do VEGF em relação à RD.

RETINOPATIA DIABÉTICA

A RD é uma desordem da vascularização retiniana caracterizada por anormalidades microvasculares (microaneurismas e hemorragias intrarretinianas), progredindo para alteração da permeabilidade vascular, má perfusão tecidual, edema e isquemia retiniana e anormalidades microvasculares intrarretinianas (IRMAs) (8). A fase avançada, associada ao aumento do risco de cegueira, é chamada RD proliferativa (RDP) e determinada pela presença de neovascularização da retina ou do disco óptico (8) (Tabela 1).

Os neovasos presentes na RDP são frágeis e podem sangrar para cavidade vítrea, o que altera a estrutura vitreorretiniana acarretando fibrose e tração sobre a retina. As complicações, a partir desse momento, incluem descolamento tracional e rupturas na retina. A evolução dessa doença pode resultar em perda importante e irreversível da visão (10,11).

Em 1948, Michaelson (12) propôs a existência de um fator difusível desconhecido produzido pela retina isquêmica e responsável pela angiogênese que causaria neovascularização da retina e da íris, como ocorre na RDP e outras doenças vasculares da retina (12). Assim, o entendimento da angiogênese e fatores envolvidos ganham importância no conhecimento da patogênese da RD.

ANGIOGÊNESE

A angiogênese é um processo fundamental e complexo no qual ocorre formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes (13-18), sendo essencial em condições fisiológicas como ovulação, desenvolvimento do corpo lúteo, embriogênese, crescimento tecidual, desenvolvimento mamário na lactação, resposta imune, inflamação e cicatrização. No adulto saudável, o turnover vascular é extremamente baixo e a angiogênese raramente ocorre (13,14,19).

A etiologia e a patogênese de algumas doenças são determinadas pela resposta angiogênica persistente devido a um aumento dos mediadores angiogênicos ou deficiência dos inibidores da angiogênese, como, por exemplo, neoplasias, metástases, psoríase e artrite reumatoide, entre outras (13,14,16). Nessas situações, a angiogênese é altamente regulada com períodos de ativação e inibição (13,16). Doenças oculares como a RD, o glaucoma neovascular, as oclusões vasculares, a retinopatia da prematuridade e a degeneração macular relacionada à idade também apresentam alteração da angiogênese (13,14,16,18,20).

Os vasos alvos dos fatores angiogênicos são os capilares venosos e as vênulas terminais, os quais apresentam pequeno calibre com células endoteliais sobre uma lâmina basal cobertas por uma camada descontínua de pericitos e células musculares lisas (21). Um dos processos iniciais da resposta angiogênica é a quebra das ligações entre as células dessas camadas (16). As células endoteliais ativadas geram enzimas proteolíticas que permitem a degradação da matriz extracelular e migração dessas células através da membrana basal, a partir do vaso da qual se originam, expressando moléculas de adesão na superfície celular (22).

FATORES ENVOLVIDOS NA ANGIOGÊNESE

Vários peptídeos com papel de fator de crescimento relacionados à angiogênese já foram purificados, entre eles o fator ácido de crescimento de fibroblastos (aFGF), o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), a angiogenina, o fator endotelial II derivado das plaquetas (PD-ECGF), o fator induzido por hipóxia (HIF-1), o fator de transformação do crescimento α e β (TGF-α e TGF-β), o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), o fator de necrose tumoral α (TNF-α), o fator de crescimento epidérmico (EGF), a interleucina 1 (IL-1), a interleucina 2 (IL-2), o fator de cicatrização/fator de crescimento do hepatócito (SF/HGF) e o fator de permeabilidade vascular (VPF), atualmente chamado de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (13,16,23-25).

Dentre esses fatores, o VEGF é um dos mais investigados atualmente. O VEGF pertence a um grupo de glicoproteínas diméricas que inclui o fator de crescimento placentário (PlGF), VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e VEGF-F (18,26). O VEGF-A é uma citocina potente e multifuncional que exerce seu efeito no endotélio (17,27), sendo o mais bem estudado e compreendido. Nesta revisão, sempre que for mencionado o VEGF, nos referiremos ao VEGF-A (26).

O gene humano do VEGF-A está organizado em oito éxons, separados por sete íntrons e localizado no cromossomo 6p21.3 (28). O splicing alternativo resulta em quatro isoformas principais, contendo 121, 165, 189 e 206 aminoácidos, respectivamente, VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206 (17,23,24,29). Embora com menor frequência, outras variantes também têm sido relatadas, incluindo VEGF145, VEGF183, VEGF162 e VEGF165b. Paradoxalmente, esta última variante teria um efeito inibitório na mitogênese induzida pelo VEGF (30).

O VEGF165, a principal isoforma VEGF-A (17,18), é uma glicoproteína homodimérica de 45 kDa que se liga à heparina. Após ser secretada, uma fração significativa permanece vinculada à superfície celular e matriz extracelular (18).

O VEGF atua direta e seletivamente através dos receptores VEGFR-1 e VEGFR-2, expressados predominantemente, e talvez exclusivamente, no endotélio vascular (17). A ligação do VEGF a esses receptores causa influxo de cálcio citoplasmático, aumentando sua concentração em até quatro vezes, mudança da forma, divisão e migração celular (17,18,31-33). Esse aumento da permeabilidade das vênulas às macromoléculas permite que proteínas plasmáticas extravasem para o espaço extravascular, levando a coagulação do fibrinogênio e deposição de gel de fibrina que serve como matriz provisória para o crescimento de novos vasos sanguíneos (15,17,18,23). O aumento da permeabilidade microvascular parece, invariavelmente, preceder e/ou acompanhar a angiogênese numa variedade de processos fisiológicos e patológicos (17,24). Isso faz com que o VEGF seja considerado um importante mediador de angiogênese.

In vitro o VEGF é capaz para promover o crescimento de células endoteliais vasculares a partir de artérias, veias e vasos linfáticos e impede a apoptose endotelial induzida por privação de nutrientes. Além disso, tanto in vitro quanto in vivo o VEGF também é um fator de sobrevivência para o endotélio (27). Em modelo experimental, a inibição do VEGF resulta em grandes alterações de apoptose na vasculatura neonatal, mas não em adultos (34). Parece haver maior dependência do VEGF nas células endoteliais recém-formadas, mas não nos vasos já estabelecidos dentro dos tumores (34). A cobertura dos vasos por pericitos foi proposta como um dos principais eventos para a perda da suscetibilidade ao VEGF (21).

RECEPTORES DO VEGF

Três receptores do VEGF são descritos: VEFGR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. As proteínas transmembrana VEGFR-1 (Flt-1) e VEGFR-2 (Flk-1/KDR) são receptores VEGF de alta afinidade com domínio de tirosina quinase (17,18,31). O VEGFR-3 (Flt-4) é membro da mesma família de receptores tirosina quinase, mas tem afinidade pelo VEGF-C e pelo VEGF-D, não sendo um receptor de VEGF-A (18).

A expressão do VEGFR-1 (Flt-1: fms-like da tirosina quinase) é acentuada por hipóxia por meio de mecanismo dependente do fator induzido pela hipóxia (HIF-1). O VEGFR-1 tem afinidade pelo VEGF-A, mas também PlGF e VEGF-B, no entanto, o VEGFR-1 apresenta fraca resposta ao VEGF (18). Park e cols. (35) inicialmente propuseram que o VEGFR-1 não seria essencialmente um receptor de transmissão de um sinal mitogênico, mas um receptor modulador capaz de regular de forma negativa a atividade do VEGF no endotélio vascular, sequestrando-o e tornando esse fator menos disponível para o VEGFR-2. Assim, a potencialização da ação do VEGF por PlGF poderia ser explica-da, pelo menos em parte, pelo deslocamento do VEGF do VEGFR-1 ligado (35). Ativação do VEGFR-1 por PlGF resultaria em transfosforilação de VEGFR-2, assim amplificaria angiogênese causada pelo VEGF através VEGFR-2 (18).

Podemos considerar que o VEGFR-1 tenha dupla função na angiogênese, uma positiva e outra negativa, em circunstâncias diferentes (36).

O VEGF se liga ao VEGFR-2 (KDR, humanos; Flk-1, camundongo), embora com menor afinidade do que ao VEGFR-1, tendo papel no desenvolvimento da angiogênese e hematopoiese (36). Existe consenso de que o VEGFR-2 é o principal mediador mitogênico, angiogênico e do aumento da permeabilidade vascular devido ao VEGF (18,23,33,36).

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DO VEGF

A expressão do RNA mensageiro (RNAm) VEGF é induzida pela exposição à baixa tensão de oxigênio em uma variedade de circunstâncias patológicas (17,18). O VEGF tem sua expressão aumentada quando medido por meio do RNAm ou da proteína em vários tumores malignos em animais e humanos (17). A hipóxia tecidual tem sido associada com à angiogênese e há evidências de que a concentração de oxigênio local regula a expressão do VEGF (17), podendo ela ser o principal indutor da transcrição do gene do VEGF (18).

VEGF E DOENÇA OCULAR NO DIABETIS MELITO

Todos os conceitos expostos anteriormente se aplicam amplamente à RD e têm sido motivo de inúmeros estudos que objetivam encontrar marcadores que possam predizer a evolução dessa doença e assim ser alvo de tratamento.

Em 1948, Michaelson (12) postulou a existência de um fator angiogênico difusível, liberado pela retina isquêmica. Por ser induzido por hipóxia, VEGF tornou-se um candidato atraente como mediador de neovascularização intraocular patológica.

O VEGF tem sido investigado como um fator de crescimento com níveis aumentados no humor aquoso e vítreo de pacientes com RD, principalmente naqueles com RDP (37-39). Pacientes com DM e RDP apresentam níveis de VEGF no humor aquoso e vítreo maiores que no plasma, o que possivelmente está relacionado à atividade da RD. O mesmo se observa quanto ao edema macular em pacientes diabéticos (37-39).

Vários estudos acerca da presença de edema macular e sua relação com os níveis de VEGF também têm sido realizados. Patel e cols. (40) observaram correlação positiva entre o maior nível de VEGF e a ocorrência de edema macular quando a mácula foi analisada com tomografia de coerência óptica (Optical Coherence Tomography - OCT). Funatsu e cols. (41), em estudo prospectivo de pacientes com RD não proliferativa submetidos à facoemulsificação do cristalino, verificaram que níveis elevados de VEGF no humor aquoso medidos mediante coleta de amostra no início do procedimento estavam associados com piora do edema macular no pós-operatório. Assim, o nível do VEGF poderia ser tomado como fator de risco para exacerbação do edema macular em pacientes com DM submetidos à cirurgia de catarata.

As concentrações intraoculares de VEGF diminuem em pacientes com RDP submetidos à fotocoagulação com laser da retina, provavelmente pela diminuição do estímulo isquêmico e, consequentemente, diminuição do estímulo à angiogênese (42).

POLIMORFISMO DO VEGF RETINOPATIA DIABÉTICA

Alguns polimorfismos do VEGF têm sido estudados para avaliar sua relação com a suscetibilidade e risco de progressão da RD (Tabela 2). Errera e cols. (43) não observaram associação entre do polimorfismo -634G/C (rs2010963) do VEGF e a presença de RD ou de DM tipo 2. Entretanto, a homozigose CC no polimorfismo -634G/C foi mais frequente nos pacientes com RDP quando comparado ao grupo controle (pacientes diabéticos tipo 2 sem RDP), sugerindo que a presença de homozigose do alelo -634C do VEGF seja um fator de risco independente para RDP em pacientes com DM tipo 2 (43).

Diante das evidências de que o VEGF tenha importante papel na patogênese da RD, um estudo avaliou quatro polimorfismos do VEGF já previamente descritos -7C/T (rs25648) e -634C/G na região 5' untranslated region (UTR) e -1498T/C e -1190G/A na região promotora do VEGF e sua possível relação com RD em população indiana com DM tipo 2. A frequência dos polimorfismos -7C/T, -1498T/C e -634C/G teve diferenças significativas entre os pacientes com RDP e sem sinais de RD ou RD leve. Isso sugere que esses polimorfismos podem estar associados ao maior risco de RD (8).

Awata e cols. (54) identificaram seis polimorfismos do VEGF em japoneses com DM tipo 2, sendo que os -1877G/A, -1498T/C, -1190G/A e -1154G/A (rs1570360) estão localizados na região promotora e -634C/G e -7C/T na 5' UTR. O polimorfismo -1877G/A demonstrou-se raro e sua avaliação não foi continuada. A distribuição do polimorfismo -634C/G foi relacionada à RD, sugerindo a presença do alelo C que seja um fator de risco independente pra RD. O genótipo CC teve odds ratio de 3,2 quando comparado ao genótipo GG. Inicialmente, Awata e cols. (54) acreditaram que alguns polimorfismos do VEGF poderiam estar associados aos estágios mais avançados de RD como a forma proliferativa, já que o VEGF é um forte fator angiogênico. No entanto, o polimorfismo 634 C/G não esteve especificamente associado com RDP, pelo contrário, a associação foi mais evidente na RD não proliferativa.

Petrovic e cols. (49) não observaram associação entre RDP e o polimorfismo -634C/G do VEGF em pacientes com DM tipo 2. No entanto, a média dos níveis séricos e vítreos de VEGF foi significativamente maior nos pacientes com RDP quando comparados ao grupo controle (diabéticos sem RD). Esses níveis foram significativamente maiores em diabéticos com o genótipo CC, quando comparados aos outros genótipos (CG e GG).

Estudos populacionais mostram que não há diferença importante entre as etnias na distribuição dos alelos C e G do polimorfismo -634C/G, sendo o alelo G mais frequente em todas as populações estudadas (55). Ao avaliar três polimorfismos na região promotora do gene VEGF, -2578C/A (rs699947), -1154 G/A e -634C/ G, pesquisadores de Campinas/SP observaram que, embora as variantes -2578A e -1154A sejam mais comuns em brancos que em negros, não houve diferenças significativas interétnicas em relação ao polimorfismo -634C/G (56).

INTERVENÇÃO NO VEGF COMO TRATAMENTO DA RETINOPATIA DIABÉTICA

Os primeiros estudos sobre VEGF e RD são da década de 1980 e ainda é de grande interesse médico devido à mudança do caráter meramente investigativo para propósitos terapêuticos focados nesse fator.

O conhecimento dos conceitos acima abriu um importante campo de investigação, tendo como alvo o VEGF na busca de uma terapia que anulasse seus efeitos patológicos. Recentemente, agentes antiVEGF foram desenvolvidos com objetivo de inibir a neovascularização patológica. Esse interesse, obviamente, envolveu a DM e suas complicações como a RD.

O pegaptanibe (Macugen^®), o ranibizumabe (Lucentis^®) e o bevacizumabe (Avastin^®) são as medicações antiVEGF disponíveis atualmente. O ranibizumabe e o bevacizumabe bloqueiam todas as isoformas circulantes de VEGF, inibindo a neovascularização em condições fisiológicas e patológicas. O pegaptanibe age seletivamente no VEGF165. No tratamento da RD, essas medicações são aplicadas dentro da cavidade vítrea. Em decorrência da curta duração do seu efeito, os antiVE-GFs necessitariam de injeções intravítreas repetidas, o que aumentaria o risco de endoftalmite, aumento da pressão intraocular, rasgo de epitélio pigmentar, rasgo e descolamento de retina. Apesar de ainda não ser bem investigado, em estudo recente foi observado aumento da pressão arterial nos pacientes normotensos e persistência da hipertensão em pacientes com HAS submetidos à injeção intravítrea de bevacizumabe (57).

A terapia antiVEGF, apesar de ainda necessitar de estudos clínicos e ter uso off-label na RD, é uma realidade na prática médica do tratamento dessa doença (58,59).

Em conclusão, é fundamental pensarmos na angiogênese ocular, tendo como maior exemplo a RD como um processo multifatorial. A identificação de fatores, como o VEGF, que tenham papel importante no processo de angiogênese fisiológica e patológica estimula o desenvolvimento de estudos que investiguem ainda mais a fisiopatogenia das doenças vasculares da retina bem como apontem para novas possibilidades terapêuticas.

Agradecimentos: Ao Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (FIPE-HCPA) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Declaração: os autores declaram não haver conflitos de interesse científico neste estudo.

Recebido em 30/Abr/2010

Aceito em 11/Fev/2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Mar 2011

Histórico

• Aceito
  11 Fev 2011
• Recebido
  30 Abr 2010