Desenvolvimento de um método reflectométrico ambientalmente mais amigável para a determinação de metoclopramida em formulações farmacêuticas

Development of an environmentally more benign reflectometric method for the determination of metoclopramide in pharmaceutical formulations

diffuse reflectance spectroscopy; metoclopramide; spot test

NOTA TÉCNICA

Desenvolvimento de um método reflectométrico ambientalmente mais amigável para a determinação de metoclopramida em formulações farmacêuticas

Development of an environmentally more benign reflectometric method for the determination of metoclopramide in pharmaceutical formulations

Keity Margareth Doretto; Mara Andréia Gotardo; Helena Redigolo Pezza; Leonardo Pezza^*

Instituto de Química do Campus de Araraquara, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP, Brasil

ABSTRACT

A simple and more environmentally friendly method by combined spot test-diffuse reflectance spectroscopy for determining metoclopramide in pharmaceutical formulations is described. The method is based on the reaction between metoclopramide and p-dimethylaminocinnamaldehyde, in the presence of HCl, producing a colored compound (λ_máx = 580 nm) on the filter paper. The linear range was from 5.65 x 10^-4-6.21x10^-3 mol L^-1 (r = 0.999). The limit of detection was 1.27 x 10^-4 mol L^-1. The proposed reflectometric method was applied successfully to the determination of metoclopramide in pharmaceuticals and it was favorably compared with the Brazilian or British Pharmacopoeia methods at 95% confidence level.

Keywords: diffuse reflectance spectroscopy; metoclopramide; spot test.

INTRODUÇÃO

A metoclopramida [4-amino-5-cloro-N-(2-dietil-aminoetil)-2-metoxibenzamida] é uma benzamida substituída que estimula a motilidade do trato gastrintestinal superior (agente procinético) sem afetar a secreção ácida. Este fármaco aumenta o peristaltismo causando um esvaziamento gástrico acelerado. Além disso, a metoclopramida atua como antagonista da dopamina, apresentando efeito antiemético significativo, sendo indicada no tratamento de náuseas e vômitos, particularmente em associação com a quimioterapia do câncer. Outras indicações da metoclopramida incluem refluxo esofágico e estase gástrica.¹

Vários métodos têm sido descritos na literatura para quantificação de metoclopramida em formulações farmacêuticas, incluindo espectrofotometria na região visível,^2-10 fluorimetria,¹¹ HPLC com detecção UV,^12-14 potenciometria,^15-18 espectroscopia de ressonância magnética nuclear¹⁹ e voltametria.²⁰ A Farmacopeia Brasileira²¹ recomenda a espectrofotometria com detecção UV para a determinação de metoclopramida em comprimidos e ampolas. O mesmo método é proposto pela Farmacopeia Britânica,²² porém acrescentando uma etapa prévia de extração com clorofórmio para eliminar a interferência de excipientes comumente presentes nas formulações. A Farmacopeia Americana²³ recomenda a determinação por HPLC.

Atualmente, no desenvolvimento de métodos analíticos a quantidade, toxicidade dos reagentes ou solventes utilizados, bem como os resíduos gerados, são tão importantes quanto qualquer outra característica analítica. A maioria dos métodos analíticos descritos para a determinação de metoclopramida requer procedimentos laboriosos e morosos, seja no preparo da amostra ou no decorrer da análise, além de alguns utilizarem elevadas quantidades de solventes, gerando assim grande quantidade de resíduos, o que os enquadra fora dos padrões propostos pela Química Verde.²⁴ Portanto, o desenvolvimento de métodos para análise de metoclopramida que sejam menos nocivos ao ambiente e que se enquadrem nos princípios preconizados pela Química Verde é uma necessidade atual e imprescindível.

Estudos descritos na literatura revelam que o uso apropriado da espectroscopia de reflectância difusa proporciona a obtenção de resultados confiáveis, evidenciando a potencialidade dessa técnica para propósitos quantitativos.^25-32 Na análise por reflectância, a densidade óptica para medidas de reflectância é A_R = - log T_R, análoga à absorbância, onde T_R = I / I₀, sendo I₀ a intensidade da energia radiante incidente e I a intensidade da energia radiante refletida pelo meio.²⁵ A combinação spot test - espectroscopia de reflectância difusa oferece vantagens sobre outros métodos, tais como simplicidade e baixo consumo de reagentes, enquadrando-a como uma metodologia ambientalmente mais amigável (benigna), pois a quantidade de resíduo gerada é muito pequena. Além disso, as medidas de reflectância podem ser realizadas in loco utilizando um equipamento portátil, o que confere uma maior versatilidade à técnica.

No entanto, relatos do uso desta técnica para análises de medicamentos ainda são incipientes. Recentemente, a espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot test sobre papel de filtro foi empregada para a determinação de alguns fármacos em formulações farmacêuticas.^26-28,33-35

Até o presente momento, não existe método descrito na literatura científica indexada para a quantificação de metoclopramida em formulações farmacêuticas por espectroscopia de reflectância difusa combinada com spot test. Desta forma, o propósito deste trabalho foi desenvolver um método analítico mais limpo, empregando esta combinação para análise de formulações farmacêuticas (comprimidos e injetáveis) contendo metoclopramida. O método baseia-se em medidas de reflectância difusa do composto violeta produzido pela reação entre metoclopramida e p-dimetilaminocinamaldeído (p-DACA) em meio ácido, usando papel de filtro como suporte sólido. Neste estudo, as condições para a reação de spot test foram otimizadas utilizando planejamento experimental. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso na análise de metoclopramida em formulações farmacêuticas.

PARTE EXPERIMENTAL

Equipamentos

Micropipetas Eppendorf (10 a 100 μL) e Brand (100 a 1000 μL) foram utilizadas para medidas de pequenos volumes.

Acessório de reflectância (ISP-REF, Ocean Optics, Dunedin, USA) acoplado a um espectrofotômetro portátil USB4000 (Ocean Optics, Dunedin, USA) foi utilizado para medidas de reflectância difusa. Para as medidas de absorbância o mesmo espectrofotômetro foi utilizado munido de cubetas de quartzo com 1 cm de caminho óptico.

Reagentes e soluções

Papel de filtro qualitativo Whatman foi usado como suporte sólido. Os excipientes utilizados nos estudos de interferências foram de grau farmacêutico. Foi utilizado metanol grau HPLC (Mallinckrodt, Xalostoc, México). p-dimetilaminocinamaldeído (p-DACA) (p.a., Riedel-de haën, Alemanha) foi usado para preparar a solução de p-DACA 0,8% (m/v) em metanol. Esta solução é estável por uma semana quando mantida sob refrigeração. Soluções de trabalho de ácido clorídrico foram preparadas por diluição adequada do ácido clorídrico concentrado (37%, Mallinckrodt, Xalostoc, México) em metanol. Solução estoque de metoclopramida (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza > 99,79%, foi preparada diariamente na concentração de 2,82 x 10^-2 mol L^-1 em metanol. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de metoclopramida e usadas na construção da curva analítica (5,65 x 10^-4 - 6,21 x 10^-3 mol L^-1).

Procedimento proposto

As condições ótimas para a execução do procedimento foram obtidas utilizando planejamento fatorial de experimentos. Para a realização do spot test, as soluções foram adicionadas sobre o papel de filtro. Inicialmente, 10 μL da solução do fármaco foram adicionados, seguidos da adição de 10 μL da solução de ácido clorídrico 4,0% (v/v) e, por último, 15 μL da solução de p-DACA 0,8% (m/v). As soluções foram adicionadas no centro do papel de filtro utilizando uma micropipeta adaptada na parte superior de um suporte, conforme descrito por Tubino et al..²⁵ Todas as operações acima citadas foram realizadas em capela de boa exaustão. As medidas de reflectância difusa foram efetuadas em 580 nm. Um branco foi preparado de maneira similar, substituindo-se a adição do fármaco por metanol.

Estudo da estabilidade óptica

Com o objetivo de avaliar a estabilidade óptica do produto colorido da reação de spot test no papel de filtro, foi realizado um acompanhamento cinético da medida de reflectância em 580 nm a cada 2 min até completar 1 h.

Estudos de interferentes

O efeito dos excipientes mais comumente utilizados nas formulações farmacêuticas disponíveis no mercado (comprimidos e injetáveis) foi cuidadosamente avaliado. Os excipientes estudados foram estearato de magnésio, amido, lactose, croscarmelose sódica, polivinilpirrolidona, manitol e talco. Para este estudo, soluções contendo metoclopramida (1,0 mg/mL) e cada um dos excipientes, separadamente, em concentração igual e 10 vezes maior que a concentração de metoclopramida, foram submetidas à agitação com metanol em um agitador magnético por 10 min. Estas misturas foram transferidas para balões volumétricos de 10,00 mL e o volume completado com o mesmo solvente. Em seguida, foi realizada uma filtração para separar os interferentes pouco solúveis. As soluções foram analisadas conforme descrito no procedimento proposto. Um branco contendo apenas metanol e demais reagentes foi usado como referência.

Preparação e análise das amostras

Cinco formulações farmacêuticas de diferentes marcas comerciais (três marcas de comprimidos e duas de injetáveis) foram analisadas. Os produtos foram obtidos em farmácias locais e analisados dentro de seus prazos de validade. Os comprimidos continham 10 mg de metoclopramida por comprimido e os injetáveis 10 mg de metoclopramida em 2 mL de solução, conforme declarado no rótulo pelo fabricante do produto.

Comprimidos: 20 comprimidos, do mesmo lote, de cada amostra comercial analisada foram pesados em balança analítica e triturados em gral de ágata até a obtenção de um pó fino. O valor médio da massa de um comprimido foi referente à medição de 20 comprimidos, apresentando desvio padrão relativo menor que 5%, conforme proposto pela Farmacopeia Brasileira.²¹ Uma porção do pó equivalente à quantidade de metoclopramida presente em um comprimido (10 mg) foi pesada e submetida à agitação com cerca de 5 mL de metanol em um agitador magnético por 5 min. Em seguida, a solução foi transferida para um balão volumétrico de 10,00 mL e o volume completado com o mesmo solvente. Esta solução foi filtrada para eliminar os excipientes insolúveis e, deste filtrado, uma alíquota de 10 μL foi retirada para a reação com p-DACA, conforme descrito em Procedimento proposto.

Injetáveis: os conteúdos de 12 ampolas, do mesmo lote, de cada marca comercial analisada foram reunidos em um frasco e homogeneizados. Alíquota de 1,00 mL foi transferida para um balão volumétrico de 5,00 mL e o volume foi completado com metanol. Após homogeneização, uma alíquota de 10 μL foi retirada para a reação com p-DACA, conforme descrito em Procedimento proposto.

Adição de padrão

A adição de padrão foi realizada com o objetivo de avaliar possíveis interferências provenientes da matriz nas análises. Para cada tipo de amostra (comprimido ou solução injetável) foi realizado um procedimento, conforme descrito a seguir.

Comprimidos: às amostras contendo massa equivalente a 6 mg (1,69 x 10^-3 mol L^-1) de metoclopramida foram adicionados 3; 6; 9 e 12 mg de metoclopramida p.a., correspondendo a 50, 100, 150 e 200%, respectivamente, da massa de metoclopramida presente na amostra. As quantidades de metoclopramida padrão adicionadas foram estabelecidas de forma a se obter soluções com concentrações finais que abrangessem a faixa de linearidade da curva analítica.³⁶ Ao béquer contendo amostra e metoclopramida p.a. foi adicionado metanol, seguindo o procedimento descrito em Preparação da amostra.

Injetáveis: às amostras contendo volume equivalente a 0,6 mL (1,69 x 10^-3 mol L^-1) de metoclopramida foram adicionados 250; 500; 750 e 1000 μL de metoclopramida padrão, correspondendo a 50, 100, 150 e 200%, respectivamente, da massa de metoclopramida presente na amostra. Ao béquer contendo amostra e metoclopramida p.a. foi adicionado metanol, seguindo o procedimento descrito em Preparação da amostra.

Método oficial

Os resultados obtidos pelo método proposto foram comparados estatisticamente com aqueles obtidos por um método farmacopeico oficial, aplicando-se o teste t e o teste F em um nível de confiança de 95%. As amostras sólidas (comprimidos) foram analisadas por espectrofotometria de absorção no ultravioleta de acordo com a Farmacopeia Brasileira.²¹ As amostras líquidas (injetáveis) foram analisadas de acordo com a Farmacopeia Britânica,²² que também preconiza a espectrofotometria de absorção no ultravioleta para a determinação quantitativa da metoclopramida, porém incluindo uma etapa de extração com clorofórmio.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O p-DACA tem apresentado um amplo uso como reagente cromogênico em análises espectrofotométricas de aminas aromáticas primárias e secundárias.³⁷ Uma provável reação entre aminas secundárias aromáticas e p-DACA envolve a condensação do grupo amino secundário protonado com o grupo carbonila do reagente, formando um sal imínio ou base de Schiff.^9,38,39 A maioria das reações envolvidas nos métodos descritos na literatura ocorre em meio ácido e necessita de aquecimento para a produção de compostos coloridos (variando de laranja a vermelho ou rosa).

No presente trabalho, observou-se que a metoclopramida reage com p-DACA, em meio ácido, produzindo a formação imediata de um produto de cor violeta intensa sobre a superfície do papel de filtro, sem a necessidade de aquecimento. A Figura 1 apresenta o espectro de reflectância com valor máximo de A_R situado em 580 nm.

De acordo com Wendlant e Hecht,⁴⁰ a cor do spot test deve ser uniforme sobre a superfície a fim de assegurar medidas de reflectância repetitíveis. Neste sentido, foram levados em consideração detalhes importantes previamente descritos²⁷ para a reação de spot test, tais como ordem e velocidade de adição do reagente, qualidade do papel de filtro e volume das soluções adicionadas. Estes detalhes foram importantes para a uniformidade da cor do spot test, levando a uma boa precisão das medidas de reflectância.

Planejamento fatorial de experimentos

Estudos foram realizados para estabelecer as condições mais favoráveis para a reação entre metoclopramida e p-DACA, na presença de ácido clorídrico, sobre papel de filtro, tendo em vista alcançar a intensidade máxima da cor do produto em 580 nm. Inicialmente, foi realizado um planejamento fatorial completo, o qual permitiu estudar simultaneamente os efeitos das principais variáveis: concentração de ácido clorídrico, concentração de p-DACA e a ordem de adição (O.A.) do ácido e do reagente no spot test, os quais poderiam influenciar na medida de reflectância (A_R). O planejamento fatorial completo foi realizado em dois níveis: baixo, codificado como (-1) e alto, como (+1).⁴¹ As concentrações de HCl (%, v/v) estudadas foram 4,0 (-1) e 8,0 (+1), as concentrações de p-DACA (%, m/v) foram 0,4 (-1) e 0,8 (+1) e as ordens de adição estudadas foram fármaco, ácido e reagente (-1) e fármaco, reagente e ácido (+1). A Tabela 1 apresenta a matriz do planejamento fatorial completo e os valores de A_R obtidos. Os experimentos foram realizados em duplicata e seus resultados analisados pelo programa Statistica versão 6.0. Todos os experimentos foram realizados com solução de metoclopramida na concentração de 6,21 x 10^-3 mol L^-1. O volume de cada uma das soluções foi mantido fixo, sendo 10 μL de cada uma das soluções a ser adicionada (metoclopramida, ácido clorídrico e p-DACA). Foram realizados brancos correspondentes a cada um dos experimentos.

A partir dos resultados do planejamento fatorial completo, o gráfico de Pareto (Figura 2) foi obtido para visualização dos efeitos estimados dos fatores principais. O gráfico de Pareto fornece uma representação gráfica para estes fatores e permite observar a magnitude e a importância de um determinado efeito. Neste gráfico, as barras (fatores) que graficamente ultrapassam a linha de significância exercem uma influência estatisticamente significativa sobre o resultado. Assim, pode ser claramente observado na Figura 2, que todos os fatores exerceram efeito significativo sobre a resposta. A ordem de adição foi o fator que teve maior influência, seguida pela concentração de ácido e concentração de p-DACA. Observa-se na Figura 2 que a ordem de adição apresentou um valor negativo, indicando que as maiores respostas foram alcançadas quando esta variável estava no nível baixo (-1), ou seja, quando a solução de fármaco foi adicionada inicialmente, seguida pelo HCl e, por último, p-DACA. Considerando estes resultados e lembrando que se trata de um fator qualitativo, esta ordem de adição foi estabelecida. Nota-se na Figura 2 que a concentração de ácido também apresentou um valor negativo, indicando que as maiores respostas foram alcançadas com a solução de HCl em concentrações mais baixas (-1), enquanto que a concentração do p-DACA apresentou valor positivo, sugerindo que as maiores respostas foram obtidas quando esta solução estava em concentrações mais altas (+1).

Com base nos resultados obtidos no planejamento fatorial completo, um planejamento composto central foi delineado visando obter as melhores condições para a reação.⁴¹ Os pontos (níveis) de um planejamento composto central estão a uma distância de √2 unidade (codificada) do ponto central (normalmente codificado como ponto zero); desta forma, todos os pontos estão sobre uma circunferência com raio √2. A Tabela 2 apresenta a matriz do planejamento composto central e os valores de resposta (A_R) obtidos nos experimentos. O experimento correspondente ao ponto central foi realizado em triplicata. Uma vez que a ordem de adição havia sido estabelecida na primeira etapa, os fatores estudados no planejamento composto central foram a concentração de HCl, variando de 1,0 a 6,0% (v/v), e o volume da solução de p-DACA com concentração fixa (0,8%, m/v), variando de 10 a 20 μL.

Os resultados obtidos a partir deste planejamento foram ajustados a um modelo matemático quadrático descrito pela Equação 1, utilizando o programa Statistica, versão 6.0.

A Equação 1 inclui os termos lineares (x₁ e x₂) e quadráticos (x₁² e x₂²) bem como o produto dos pares dos efeitos lineares (x₁x₂). Nesta equação, Y representa a absorbância em 580 nm, e as variáveis x₁e x₂ são volumes de p-DACA e concentração de HCl, respectivamente.

A Figura 3 apresenta o gráfico tridimensional obtido a partir dos dados experimentais e ajustados a uma superfície de resposta juntamente com sua curva de nível desenvolvidas através do planejamento composto central cuja matriz está representada na Tabela 2. Nota-se pelo formato da superfície que a região ótima foi encontrada e também que as respostas máximas foram alcançadas com solução de HCl de cerca de 4,0 % (v/v) e 15 μL de p-DACA.

Curva analítica, limite de detecção e limite de quantificação

A curva analítica foi construída utilizando soluções de metoclopramida numa faixa de concentração entre 5,65 x 10^-4 e 6,21 x 10^-3 mol L^-1. Uma relação linear (r = 0,999) foi obtida construindo-se uma curva de A_R versus log C, onde A_R é a reflectância medida em 580 nm e C = [metoclopramida] x 10⁴ mol L^-1 (o fator 10⁴ foi usado para ajustar a curva analítica com valores de log maiores do que zero). A equação linear obtida para a curva analítica foi: A_R = -0,15048 + 0,4354 x C. O limite de detecção (3xDP_b/a) e o limite de quantificação (10xDP_b/a) obtidos foram 1,27 x 10^-4 e 4,19 x 10^-4 mol L^-1, respectivamente, sendo a = coeficiente angular da curva analítica e DP_b = desvio padrão do branco para 10 medições.⁴²

Estudo da estabilidade óptica

Os resultados obtidos no estudo de estabilidade do produto da reação entre metoclopramida e p-DACA em meio ácido demonstraram que não houve diferença significativa entre os valores de A_R obtidos no período de tempo estudado (60 min).

Estudo dos interferentes

O efeito de cada excipiente (estearato de magnésio, amido, lactose, croscarmelose sódica, polivinilpirrolidona, manitol, metabissulfito de sódio e talco) foi considerado como interferência quando o sinal de A_R apresentou um erro maior ou igual a 5% na determinação do fármaco. Nenhuma interferência foi constatada a partir destes excipientes, sob as c ondições estudadas.

Adição de padrão

Com o objetivo de avaliar as possíveis interferências provenientes da matriz foi realizada a adição de padrão utilizando 3 amostras de diferentes marcas comerciais, sendo duas delas comprimidos e uma injetável. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 3. Para todas as amostras os valores de recuperação variaram de 95,1 a 104,5%, indicando boa exatidão do método e ausência de efeito significativo de matriz.

Aplicação analítica

O método proposto foi aplicado na determinação de metoclopramida em formulações farmacêuticas disponíveis comercialmente e os resultados comparados com os obtidos por métodos para a determinação de metoclopramida em comprimidos e em injetáveis descritos, respectivamente, na Farmacopeia Brasileira²¹ e na Farmacopeia Britânica.²² As análises foram realizadas em triplicata e os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Para todas as formulações farmacêuticas analisadas os resultados obtidos pelo método proposto e pelos métodos oficiais das Farmacopeias Brasileira e Britânica foram comparados estatisticamente aplicando-se o teste t e o teste F, em um nível de confiança de 95%. Em todos os casos, os valores de t e de F calculados não excederam os valores tabelados indicando que não existe diferença significante com respeito à exatidão e precisão entre o método proposto e os métodos oficiais, em um nível de confiança de 95% (Tabela 4).

CONCLUSÕES

Este estudo demonstrou a viabilidade de se empregar a espectroscopia de reflectância difusa combinada com spot test na determinação de metoclopramida em formulações farmacêuticas. O método proposto apresenta grande vantagem sobre os métodos oficiais por espectrofotometria no UV descritos nas Farmacopeias Brasileira e Britânica, pois não tem interferência de excipientes e, portanto, não necessita de extrações prévias com clorofórmio, solvente nocivo ao operador e ao ambiente. Adicionalmente, também apresenta vantagens sobre outros métodos descritos na literatura como simplicidade, rapidez, portabilidade e, principalmente, o baixo consumo de solventes e reagentes. Trata-se, portanto, de um método mais atrativo e ambientalmente mais amigável.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq e à FAPESP pelo suporte financeiro deste trabalho.

Recebido em 4/3/09; aceito em 29/7/09; publicado na web em 21/1/10

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Mar 2010
• Data do Fascículo
  2010

Histórico

• Aceito
  29 Jul 2009
• Recebido
  04 Mar 2009