Método fluorescente (diacetato de fluoresceína e brometo de etídeo) para o estudo da viabilidade de Cryptococcus neoformans em líquor

Corrêa, Benedito; Purchio, Adhemar; Paula, Claudete R.; Gambale, Walderez; Shikanai-Yasuda, Maria Aparecida

doi:10.1590/S0036-46651990000100008

Resumos

Padronizou-se método de fluorescência (solução de diacetato de fluoresceína DF e brometo de etídio BE) para análise de viabilidade de células fúngicas, em 40 amostras de liquor, provenientes de casos comprovados de neurocriptococose. A utilização de solução aquosa de saponina a 0,3% eliminou fluorescências interferentes emitidas por hemácias e leucócitos. Após o processamento dos materiais biológicos, foram retiradas alíquotas de 0,1 ml das supensões obtidas e misturadas a volumes iguais da solução DF-BE preparada pouco antes do uso. O tempo de coloração ideal foi de 30 minutos, resultando perfeita diferenciação entre microrganismos viáveis (fluorescência verde) e não viáveis (fluorescência vermelha).

Cryptococcus neoformans; Viabilidade; Fluorescência

The utilization of the fluorescent method (fluorescein diacetate DF and ethidium bromide BE), to verify the viability of fungal cells, was studied in 40 samples of liquor, from patients with neurocryptococcosis. For removing leukocytes and red blood cells, which produce interfering fluorescence, good results were obtained with 0.3% saponin solution. After processing of liquor, 0.1 ml aliquots of resulting suspension were mixed to equal volumes of fresh DF-BE solution. The best incubation period for staining was 30 minutes, resulting in good differentiation between viable (green fluorescence) and non viable (red fluorescence) cells.

ENSAIOS TÉCNICOS

Método fluorescente (diacetato de fluoresceína e brometo de etídeo) para o estudo da viabilidade de Cryptococcus neoformans em líquor

Fluorescein method (fluorescein diacetate and ethidium bromide) to study the viability of Cryptococcus neoformans in liquor

Benedito Corrêa^I; Adhemar Purchio^I; Claudete R. Paula^I; Walderez Gambale^I; Maria Aparecida Shikanai-Yasuda^II

^IDepartamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. São Paulo, SP, Brasil

^IIDepartamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. São Paulo, SP, Brasil

^{Endereço para correspondência} Endereço para correspondência: Dr. Benedito Corrêa Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo Av. Prof. Lineu Prestes, 1374 CEP 05508 São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

Padronizou-se método de fluorescência (solução de diacetato de fluoresceína DF e brometo de etídio BE) para análise de viabilidade de células fúngicas, em 40 amostras de liquor, provenientes de casos comprovados de neurocriptococose. A utilização de solução aquosa de saponina a 0,3% eliminou fluorescências interferentes emitidas por hemácias e leucócitos. Após o processamento dos materiais biológicos, foram retiradas alíquotas de 0,1 ml das supensões obtidas e misturadas a volumes iguais da solução DF-BE preparada pouco antes do uso. O tempo de coloração ideal foi de 30 minutos, resultando perfeita diferenciação entre microrganismos viáveis (fluorescência verde) e não viáveis (fluorescência vermelha).

Unitermos: Cryptococcus neoformans; Viabilidade; Fluorescência.

SUMMARY

The utilization of the fluorescent method (fluorescein diacetate DF and ethidium bromide BE), to verify the viability of fungal cells, was studied in 40 samples of liquor, from patients with neurocryptococcosis. For removing leukocytes and red blood cells, which produce interfering fluorescence, good results were obtained with 0.3% saponin solution. After processing of liquor, 0.1 ml aliquots of resulting suspension were mixed to equal volumes of fresh DF-BE solution. The best incubation period for staining was 30 minutes, resulting in good differentiation between viable (green fluorescence) and non viable (red fluorescence) cells.

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Recebido para publicação em 14/4/1989.

1. BRUNIUS, G. - Technical aspects of the use of 3', 6 diacetyl fluoresccin or vital fluorescent staining of bacteria. Curr. Microbiol., 4: 321-323, 1980.
2. CALICH, V.L.G.; PURCHIO, A. & PAULA, C.R. - A new fluorescent viability test for fungi cells. Mycopathologia (Den Haag), 66: 173-177, 1978.
3. CORLISS, D.A. & WHITE Jr., W.E. - Fluorescence of yeast. Vitally staining with ethidium bromide and propidium iodite. J. Histochem. Cytochem., 29: 45-48, 1981.
4. CORRĘA, B.; PURCHIO, A.; PAULA, C.R. & GAMBALE, W. - evaluation of a fluorescent method (fluorescein diacetate and ethidium bromide solution) in the study of the viability of Cryptococcus neoformans strains. Mycopathologia (Den Haag), 96: 91-96, 1986.
5. CORRĘA, B.; PURCHIO, A.; PAULA, C.R. & GAMBALE, W. - evaluation of a fluorescent method in the study of the viability of Candida albicans strain. Rev. Microbiol. (S. Paulo), 18: 258-263, 1987.
6. CORRĘA, B.; GAMBALE, W.; PAULA, C.R. & CHACON-RECHE, N.O. - Aplicaçăo do método fluorescente (soluçăo de diacetato de fluoresceína e brometo de etídio) no estudo da viabilidade de Metarhizium anisopliae. Rev. Microbiol. (S. Paulo), 20: 341-349, 1989.
7. CORRĘA, B.; GAMBALE, W.; PAULA, C.R. & PALAZZO, S. - Morfogęnese de Sporothrix schenckii "in vivo" e "in vitro" através do método de viabilidade pela fluorescęncia. In: Congresso Brasileiro de Microbiologia, 15., Anais. Ribeirăo Preto, 1989. p.348.
8. EDIDIN, M. - A rapid quantitative fluorescence assay for cell damage by cytotoxic antibodies. J. Immunol., 104: 1303-1306, 1970.
9. EUROPEAN BREWERY CONVEMTION: Analytical microbiologica. Method. 2.2.2.3. Methylene blue staining. J. Inst. Brewing, 83: 109-118, 1977.
10. JARNAGIN, J.L. & LUCHSINGER, D.W. - The use of fluorescein diacetate and ethidium bromide as stain for evaluation viability of Mycobacteria. Stain Technol., 55: 253-259, 1980.
11. KVACH, J.T.; MUNGUIA, G. & STRAND, S.H. - Staining tissue derived Mycobacterium leprae with fluorescein diacetate and ethidium bromide. Int. J. Leprosy., 52: 176-182, 1984.
12. MEDZON, E.L. & BRADY, M.L. - Direct measurement of acetylesterase in living protest cells. J. Bact., 97: 402-415, 1969.
¹³
MERCK Laboratories: Chemical methods of medical investigation. 3.ed. Darmstadt, 1964. p.146.
14. MOURA, R.A.; WADA, C.S.; PURCHIO, A. & ALMEIDA, T.V. - Técnicas de laboratório. Rio de Janeiro, Atheneu, 1987. p.498.
15. RESTREPO, A.; CANO, L.E.; BEDOUT, C.; BRUMMER, E. & STEVENS, A.D. - Comparison of various techniques for determining viability of Paracoccidioides brasiliensis yeasts form cells. J. clin. Microbiol., 16: 209-211, 1982.
16. ROJAS PEDRAL, M.M.E. & PURCHIO, A. - Avaliaçăo da eficácia do método de fluorescęncia (soluçăo de diacetato de fluoresceína e brometo de etídio) no estudo da viabilidade de células leveduriformes de Sporothrix schenckii. Rev. lat.-amer. Microbiol., 30: 197-200, 1988.
17. ROTMAN, B. & PAPERMASTER, B.W. - Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolyses of fluorogenic esteres. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), 55: 134-141, 1966.
18. SODESTRON, B.E. - Vital staining of fungi in pure cultures and in soil with fluorescein diacetate. Soil Biol. Biochem., 9: 59-63, 1977.
19. TREVORS, J.T.; MERRICK, R.L.; RUSSEL, I. & STEWART, G.G. - A comparison of methods for assessing yeast viability. Biotech. Letters, 5: 131-134, 1983.
20. WARING, M.J. - Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids. J. molec. Biol., 13: 269-282, 1965.

Endereço para correspondência:

Dr. Benedito Corrêa

Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

Av. Prof. Lineu Prestes, 1374

CEP 05508 São Paulo, SP, Brasil

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
13 Set 2006
Data do Fascículo
Fev 1990

Histórico

Recebido
14 Abr 1989

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[1] 1. BRUNIUS, G. - Technical aspects of the use of 3', 6 diacetyl fluoresccin or vital fluorescent staining of bacteria. Curr. Microbiol., 4: 321-323, 1980.

[2] 2. CALICH, V.L.G.; PURCHIO, A. & PAULA, C.R. - A new fluorescent viability test for fungi cells. Mycopathologia (Den Haag), 66: 173-177, 1978.

[3] 3. CORLISS, D.A. & WHITE Jr., W.E. - Fluorescence of yeast. Vitally staining with ethidium bromide and propidium iodite. J. Histochem. Cytochem., 29: 45-48, 1981.

[4] 4. CORRĘA, B.; PURCHIO, A.; PAULA, C.R. & GAMBALE, W. - evaluation of a fluorescent method (fluorescein diacetate and ethidium bromide solution) in the study of the viability of Cryptococcus neoformans strains. Mycopathologia (Den Haag), 96: 91-96, 1986.

[5] 5. CORRĘA, B.; PURCHIO, A.; PAULA, C.R. & GAMBALE, W. - evaluation of a fluorescent method in the study of the viability of Candida albicans strain. Rev. Microbiol. (S. Paulo), 18: 258-263, 1987.

[6] 6. CORRĘA, B.; GAMBALE, W.; PAULA, C.R. & CHACON-RECHE, N.O. - Aplicaçăo do método fluorescente (soluçăo de diacetato de fluoresceína e brometo de etídio) no estudo da viabilidade de Metarhizium anisopliae. Rev. Microbiol. (S. Paulo), 20: 341-349, 1989.

[7] 7. CORRĘA, B.; GAMBALE, W.; PAULA, C.R. & PALAZZO, S. - Morfogęnese de Sporothrix schenckii "in vivo" e "in vitro" através do método de viabilidade pela fluorescęncia. In: Congresso Brasileiro de Microbiologia, 15., Anais. Ribeirăo Preto, 1989. p.348.

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[13] ¹³
MERCK Laboratories: Chemical methods of medical investigation. 3.ed. Darmstadt, 1964. p.146.

[14] 14. MOURA, R.A.; WADA, C.S.; PURCHIO, A. & ALMEIDA, T.V. - Técnicas de laboratório. Rio de Janeiro, Atheneu, 1987. p.498.

[15] 15. RESTREPO, A.; CANO, L.E.; BEDOUT, C.; BRUMMER, E. & STEVENS, A.D. - Comparison of various techniques for determining viability of Paracoccidioides brasiliensis yeasts form cells. J. clin. Microbiol., 16: 209-211, 1982.

[16] 16. ROJAS PEDRAL, M.M.E. & PURCHIO, A. - Avaliaçăo da eficácia do método de fluorescęncia (soluçăo de diacetato de fluoresceína e brometo de etídio) no estudo da viabilidade de células leveduriformes de Sporothrix schenckii. Rev. lat.-amer. Microbiol., 30: 197-200, 1988.

[17] 17. ROTMAN, B. & PAPERMASTER, B.W. - Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolyses of fluorogenic esteres. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), 55: 134-141, 1966.

[18] 18. SODESTRON, B.E. - Vital staining of fungi in pure cultures and in soil with fluorescein diacetate. Soil Biol. Biochem., 9: 59-63, 1977.

[19] 19. TREVORS, J.T.; MERRICK, R.L.; RUSSEL, I. & STEWART, G.G. - A comparison of methods for assessing yeast viability. Biotech. Letters, 5: 131-134, 1983.

[20] 20. WARING, M.J. - Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids. J. molec. Biol., 13: 269-282, 1965.

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