EFEITOS DE NANOPARTÍCULAS COMERCIAIS DE ÓXIDO DE FERRO (Fe₂O₃): CITOTOXICIDADE, GENOTOXICIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO

EFFECTS OF COMMERCIAL NANOPARTICLES OF IRON OXIDE (Fe₂O₃): CYTOTOXICITY, GENOTOXICITY AND OXIDATIVE STRESS

Resumo

This study presents the toxicological effects of iron nanoparticles (NP Fe₂O₃) using in vitro and in vivo tests. Initially nanoparticles were characterized physic-chemically followed by evaluation of cell viability using different cell lines. Allium cepa test and comet assay (cell lines and Danio rerio) were used for evaluation of genotoxicity. Oxidative stress analyses were performed using D. rerio exposed to NP-Fe₂O₃, and the enzymatic activity of the enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST) were evaluated. The results showed that initially nanoparticles had 65.55 nm, 0.24 of polydispersity of and 11.4 mV of zeta potential. Regarding cell viability, it was observed that this did not reach the IC₅₀ up to the concentration 1 x 10¹⁰ NP mL^-1. The in vitro comet assay showed that in concentrations 1.96 x10⁸ and 10⁹ NPs mL^-1 these presented toxicity, for Allium cepa evaluation in concentrations 19.6 and 39.0 x10⁹ NPs mL^-1 presented significant damages when compared to the control. Oxidative stress showed that the liver was the most affected organ when compared to the control. Although studies show that iron nanoparticles do not lead to changes, further studies are needed to make sure they do not lead to environmental changes.

Keywords:
iron oxide nanoparticles; zebrafish; viability; in vitro analysis; in vivo analysis

Keywords:
iron oxide nanoparticles; zebrafish; viability; in vitro analysis; in vivo analysis

INTRODUÇÃO

Com o avanço da nanotecnologia foi possível produzir nanopartículas de ferro as quais apresentam características físico-químicas diferenciadas quando comparadas às características apresentadas em micro/macroescala. Além disso, o átomo de ferro pode originar outros compostos a partir de diferentes combinações, como por exemplo os óxidos de ferro.^1,2 Dentre as nanopartículas (NPs) metálicas, as de óxido de ferro se destacam no mercado devido às suas características físico-químicas, como sua grande capacidade cinética, grande área de superfície em relação ao volume, alta reatividade, possíveis propriedades magnéticas, além de permitirem o recobrimento com diversos tipos de ligantes específicos.^3-7

Atualmente a maioria dos estudos de NPs de óxidos de ferro (NP Fe₂O₃) na área ambiental está direcionada à remediação (nanorremediação), que consiste na utilização das nanoparticulas para a descontaminação da água e solo.^5,8 Em relação a área médica, sua utilização ocorre principalmente como meio de contraste em imagens por ressonância magnética, carreadores de fármacos, em pesquisas gênicas, proteômica e tratamentos anticâncer.^2,6,7,9-12 As NP Fe₂O₃ também são utilizadas como constituintes de diferentes tipos de materiais comercializados: tintas, revestimentos, plásticos, cosméticos,¹³ nutrientes² e semicondutores.⁸ Assim, devido à ampla comercialização de produtos que apresentam NPs em sua composição, é observado como consequência um aumento do descarte das mesmas nos ambientes aquático e terrestre.^14-16

No ambiente, as NP Fe₂O₃ tendem a se agregar ou aglomerar com outros diferentes compostos dispersos no meio, podendo levar à alteração de suas características físico-químicas, as quais anteriormente eram consideradas estáveis devido a sua produção em meio controlado.^14,17 Desta forma, quando descartadas no ambiente, podem tornar-se instáveis e sofrer degradação, oferecendo risco para os seres vivos.^5,18 Diante de tais fatores, os possíveis efeitos adversos e riscos para a saúde causados por estas nanopartículas por mecanismos relacionados à citotoxicidade e à genotoxicidade precisam ser melhor compreendidos, pois podem ser potencialmente tóxicas aos organismos, assim como apresentar novas características e se tornar carreadoras de outros compostos tóxicos.^19-21

Após a introdução de NPs no ambiente, estas podem sofrer alterações que envolvem processos biológicos, físicos e químicos, os quais dificultam sua avaliação e quantificação no ambiente, sendo difícil verificar o grau de toxicidade. Até o momento, os estudos com as NP Fe₂O₃ mostram diferentes efeitos toxicológicos, tais como alteração no ciclo celular, dano no DNA, alterações de proteínas e dano mitocondrial,²² entretanto, o conhecimento atual sobre seus efeitos ainda é restrito. É sugerido que o mecanismo que desencadeia o estresse oxidativo pode ocasionar reações inflamatórias, as quais resultam na toxicidade destas NPs.²²

Estudos sobre os efeitos ecotoxicológicos de nanopartículas em meio aquático vêm sendo realizados, como o estudo de Hao et al.,²³ no qual foram verificados danos nas membranas lipídicas de células e de organelas celulares e consequentemente disfunção celular por formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em carpas (Cyprinus carpio) expostas a NPs de titânio. Outro estudo mostra que embriões de zebrafish (Danio rerio) expostos a 10 mg L^-1 de NP Fe₂O₃ apresentaram malformação,²⁴ enquanto embriões de medaka (Oryzias latipes) expostos a NP Fe₂O₃ nas concentrações 0,5; 5,0 e 50 μg mL^-1 apresentaram inibição da enzima superóxido dismutase (SOD) e indução de peroxidação lipídica por formação de malondialdeido (MDA), neste estudo foi mostrado que houve a indução de EROs apenas nas maiores concentrações de NPs, no entanto, nos adultos expostos às mesmas concentrações de NPs não foram observados danos celulares, mostrando que as defesas antioxidantes foram eficientes.²⁵

Alguns estudos toxicológicos utilizando plantas demonstraram os possíveis efeitos das NP Fe₂O₃ sobre as mesmas. Em estudo realizado com rabanete (Raphanus sativus) foi observada uma redução no desenvolvimento da cultura devido à adsorção das NPs na semente e à liberação de íons livres de ferro.²⁶ Já em estudos realizados com tomates (Solanumlyco persicum), expostos a 100 mg L^-1 de NP Fe₂O₃, foi observado estresse hídrico e também processo de oxidação com formação de EROs, devido à agregação das NPs nas raízes.²⁷

Embora existam estudos que avaliem a toxicidade de NP Fe₂O₃, ainda se faz necessária a padronização de testes e a compreensão da ação destas NPs nos sistemas biológicos. Nesse estudo foi realizada a caracterização de uma nanopartícula de óxido de ferro (Fe₂O₃) comercial (Sigma Aldrich), em dois diferentes meios (água e meio de cultura DMEM), em seguida foi avaliada a citotoxicidade e a genotoxicidade in vitro, além do potencial genotóxico in vivo e alterações bioquímicas em indivíduos adultos da espécie Danio rerio (zebrafish). Tais estudos apresentam grande relevância devido à necessidade da ampliação dos conhecimentos sobre as ações nocivas das nanopartículas de óxido de ferro (Fe₂O₃), podendo contribuir assim para o conhecimento científico na área da nanotecnologia.

MATERIAL E MÉTODOS

Nanopartículas

Neste estudo foram utilizadas nanopartículas de Fe₂O₃ comercial (Sigma-Aldrich Chemistry - ≤ 100 nm; dispersão entre 15 a 25% wt; densidade 1,07 -1,27 g mL^-1; pH entre 3,4 - 4,0; 20 wt % em água).

Linhagens celulares

Para realização dos testes de viabilidade celular, cometa e caracterização em diferentes meios de dispersão foram utilizadas linhagens celulares padrão (American Type Colection Culture-ATCC) provenientes do Banco de células do Rio de Janeiro (A549, V79, 3T3 e HeLa). As células foram mantidas em garrafas com meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino em estufa, com atmosfera úmida, a 5% de CO₂ e em temperatura de 37 ºC.

Animais

Peixes da espécie Danio rerio (massa corpórea: 0,4 ± 0,06 mg, comprimento total: 2,9 ± 0,3 cm), obtidos na World Fish SA, Brasil, foram aclimatados durante 10 dias em aquários de 40 L em sistema semi-estático e aeração constante. Os animais foram alimentados “ad libitum” com ração comercial para peixes (TetraMin Tropical Flakes). As variáveis físicas e químicas da água (temperatura: 23-25 ºC, oxigênio dissolvido: 6,19-7,82 mg L^-1, pH: 6-7, condutividade: 40-58 μS cm^-3, alcalinidade: 35-43 mg L^-1 como CaCO₃ e dureza total: 39-50 mg L^-1 como CaCO₃) foram monitoradas e se mantiveram constantes durante o período de aclimatação e os ensaios de exposição.

Após o período de aclimatação foi realizada a exposição dos peixes às nanopartículas, visando o estudo da ecotoxicidade das mesmas por meio de análise cometa e ensaios bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo. Os peixes foram expostos a controle, 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1, 3,90 x 10⁹ NPs mL^-1 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1, durante 72 horas. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro aquários, em duplicata de aquários (n=15 peixes/aquário 2 L) em sistema semi-estático. Durante o período de exposição os animais não foram alimentados.

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Sorocaba (protocolo 004/2012). Todos os procedimentos seguiram a resolução nº 1000 de 11 de março de 2012 que dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais e dá outras providências.

Caracterização das nanopartículas

A caracterização das nanopartículas foi realizada visando à obtenção dos parâmetros físico-químicos diâmetro hidrodinâmico e índice de polidispersão (PDI), através da técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS), e potencial zeta, por mobilidade eletroforética. Para essas análises as nanopartículas foram diluídas a 500 μg mL^-1 e os resultados analíticos foram obtidos a partir da média de 3 leituras realizadas a um ângulode 90º, a temperatura de 25 ºC, utilizando o equipamento Zetasizer Nano-ZS90 (MalvernInstruments). A distribuição de tamanho e a concentração das nanopartículas (NPs mL^-1) foram obtidas pela técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA). A amostra foi diluída 20.000 vezes em água ultrapura e as leituras realizadas utilizando o equipamento NanoSight LM14 e o software NanoSight v. 2.3.

A caracterização das NPs foi realizada no início do estudo em dispersão em água ultrapura e também em meio de cultura DMEM. Para fins de verificação de alterações nos parâmetros físico-químicos, a caracterização também foi realizada após a exposição dos peixes.

Avaliações da citotoxicidade e genotoxicidade das NPs

Viabilidade celular

Para avaliação da viabilidade celular, diferentes linhagens celulares foram expostas às NP Fe₂O₃ em concentrações entre 1,96 x 10¹ e 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1. Para a análise foi utilizado o kit Tali Apoptosis - Annexin V AlexaFluor^® 488 and Propidium Iodide, conforme instruções do fabricante, seguida de leitura em citômetro de imagem Tali Image-Based (Invitrogen).

Ensaio Cometa

Para a análise cometa in vitro utilizando linhagens celulares, a exposição às nanopartículas de Fe₂O₃ foi realizada nas concentrações de 1,96 x 10⁷, 1,96 x 10⁸ e 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1. Para as análises cometa in vivo com D. rerio, após o período de aclimatação e exposição, os peixes foram anestesiados com 250 mg L^-1 de benzocaína e o sangue (10 μL) foi coletado por punção da veia dorsal da nadadeira anal. Em seguida, os animais ainda anestesiados foram eutanasiados por secção medular indolor. As brânquias foram retiradas e mantidas em soro fetal bovino a 8 ºC.

O ensaio cometa foi realizado segundo metodologia adaptada de Azqueta et al.²⁸ e Collins, Dusinka e Horska.²⁹ Logo após a exposição, no caso do ensaio in vitro, ou a coleta, no caso do ensaio in vivo, as células foram homogeneizadas em agarose low melting 0,8% e espalhadas em lâminas preparadas anteriormente com agarose 1,5%. Após montagem, as lâminas foram mergulhadas em solução de lise por 1 h, seguida de neutralização. Posteriormente, as lâminas foram mantidas em tampão de eletroforese a 4 ºC por 20 minutos seguido de corrida por 20 minutos, 1,6 V cm^-1. Ao final da eletroforese, as lâminas foram secas, fixadas e coradas com solução de prata. As análises foram realizadas em microscópio ótico (40x) sendo consideradas aproximadamente 150 células por lâmina seguindo critério de score visual proposto por Collins, Fleming, Gedik.³⁰ O Índice de danos (ID) de cada tratamento foi calculado dividindo-se o score de cada lâmina pelo número de células analisadas.

Ensaio Allium cepa

A avaliação por Allium cepa foi realizada após exposição das raízes às nanopartículas de Fe₂O₃ por 24 h nas concentrações 1,9 x 10⁹; 3,9 x 10⁹; 19,6 x 10⁹ e 39 x 10⁹ NPs mL^-1. Após o tempo de contato as raízes foram fixadas em Carnoy (Ácido acético e etanol 1:3) por 24 h, seguida por hidrólise ácida (Ácido Clorídrico 1 mol/L) a 60 ºC. Após a hidrólise, as raízes foram coradas em reativo de Schiff por 2 h. As lâminas foram montadas por esmagamento da região meristemática banhada em uma gota de Carmin Acético 2%.

Foi então realizada análise microscópica por meio da contagem de 1000 células por lâmina (triplicata). O índice de alterações (IA) foi calculado, sendo IA = Número de células com alterações cromossômicas/Total de células em divisão.

Análises bioquímicas

Após a exposição dos peixes, foi realizada a coleta dos órgãos cérebro, coração, fígado, pele e músculo, os quais foram dissociados em PBS 7,2 (1:10 w/v) e centrifugados por 20 min a 10.500 rpm, -4 ºC. Após este procedimento o sobrenadante foi imediatamente acondicionado em freezer -80 ºC.

A determinação da concentração de proteína nas amostras dos órgãos foi realizada de acordo com o método descrito por Bradford.³¹

A atividade da Catalase (CAT) foi avaliada pelo decaimento da concentração de H₂O₂ de acordo com o método descrito por Beutler.³² A atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) foi determinada pela oxidação de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) em presença de t-butyl de acordo com o método descrito por Beutler.³³ A atividade da Glutationa-S-Transferase (GST) foi realizada utilizando como substrato o reagente 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) de acordo com o método descrito por Keen et al.³⁴ A atividade específica de cada enzima foi expressa em unidades internacionais por micrograma (μg) de proteína (UI/mg de proteína).

Análise Estatística dos resultados

A estatística foi realizada utilizando a análise de variância (One-way, ANOVA com teste posterior de Tukey-Kramer), o programa utilizado foi o GraphPadPrism 7.0, significância definida como p <0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização físico-química das nanopartículas de Fe₂O₃ dispersas em diferentes meios

A caracterização físico-química das NPs de Fe₂O₃ dispersas em água ultra pura e meio de cultura DMEM foi realizada 24 horas após a dispersão. A concentração das NPs para a análise foi de 500 μg mL^-1, concentração correspondente a 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1 (Figura 1)

Figura 1
Diâmetro médio (A), índice de polidispersão (B) e potencial zeta (C) ± desvio padrão das nanopartículas de óxido de ferro na concentração de 1,96 x 10¹¹ NPs mL^-1 nos seguintes meios dispersantes: água ultra pura, meio de cultura DMEM

As NP Fe₂O₃ dispersas em meio DMEM apresentaram maior diâmetro quando comparadas às NP Fe₂O₃ dispersas em água (Figura 1A). Provavelmente este resultado é devido à formação de corona que ocorre quando as NPs são dispersas em meio contendo proteínas, podendo ocorrer o processo de adsorção das mesmas pela superfície metálica, e a consequente alteração no diâmetro das NPs pode alterar suas características físico-químicas.^35-37

Os resultados de PDI (Figura 1B) indicam a homogeneidade das NPs tanto em água como em meio de cultura, já o potencial zeta (Figura 1C) apresentou variações nos diferentes meios, sendo que a dispersão em meio de cultura alterou o valor de positivo para negativo. Isso se deve, provavelmente, à carga negativa das proteínas presentes na corona.³⁸

Caracterização físico-química das nanopartículas Fe₂O₃ na água após exposição dos peixes

Para avaliar a possibilidade de alteração nos parâmetros físico-químicos, as nanopartículas dispersas em água foram avaliadas após a exposição dos peixes por 72 h, isto foi realizado uma vez que, a literatura mostra que estas podem interagir com substâncias do ambiente e alterar suas características e consequentemente sua toxicidade. As análises mostraram alterações das características das nanopartículas quando comparadas aos parâmetros obtidos anteriormente à exposição, sendo possível observar maior tamanho, consequência de possível agregação, maior polidispersão, resultado da perda de homogeneidade, e aumento do potencial zeta, provavelmente em consequência da formação de corona proteica através da interação com o ambiente (Tabela 1).

Tabela 1
Características físico-químicas das Fe₂O₃ pela técnica de DLS na água de exposição de D. rerio

Tipo de meio	Concentrações (NPs mL-1)	Diâmetro médio (nm)	Índice de polidispersão	Potencial zeta (mV)
Água/peixes	1,96 x 109	797,5 ± 261,5	1 ± 0	-21,0 ± 1,55
	3,90 x 109	1629 ± 260,7	1 ± 0	-21,8 ± 0,360
	19,6 x 109	1181 ± 140,38	0,787 ± 0,36	-15,4 ± 2,34
Meio com células	1,96 x 1010	105,0 + 1,3	0,263 + 0,026	-11,5 + 1,21

Os dados referentes a diâmetro, polidispersão e potencial zeta das nanopartículas após a exposição em culturas celulares mostrou que estas apresentam pequena alteração após exposição, mostrando maior estabilidade quando comparadas à exposição em água com peixes, porém é necessário considerar que o ambiente foi controlado, existindo apenas metabólitos resultantes das células em exposição. Situação diferente da exposição em água com peixes, as quais estavam expostas a dejetos, os quais podem ter colaborado para a agregação.

Resultados apresentados em estudos referentes à agregação de nanopartículas de ferro mostram que estas podem ocasionar efeitos tóxicos em organismos aquáticos. Amde et al.,³⁹ em revisão realizada sobre NPs de óxidos metálicos relatam que devido as características físico-químicas das NPs pode ocorrer agregação/aglomeração, o que pode induzir à deposição deste material no sedimento, com consequente diminuição da concentração de NPs metálicas em suspensão ao longo do tempo, em contraponto ao aumento ocorrido nos sedimentos. Outro fator a ser considerado é que no ambiente as NP Fe₂O₃ podem sofrer dissociação levando à liberação de íons, fato que pode interferir na toxicidade nos sistemas biológicos.

Em estudo realizado com embriões de D. rerio, Zhu et al.²⁴ demonstraram que agregados resultantes da sedimentação de NPs Fe₂O₃ causaram adiantamento na eclosão dos ovos quando em concentrações maiores que 10 mg L^-1. Foi observado também o aparecimento de malformações como ulcerações na pele, edemas, assim como danos articulares. Em concentrações de 50 e 100 mg L^-1 ocorreu a morte dos peixes, fato que contribui para a compreensão do potencial tóxico das NPs liberadas no ambiente. Em outro estudo com mexilhões expostos a NPs de óxido ferro foi verificado que a toxicidade é induzida nas concentrações de 10 e 50 mg mL^-1, sendo estas internalizadas nos hemócitos levando ao aumento de EROs e aumento de danos no DNA.⁴⁰

Avaliação da toxicidade utilizando ensaios in vitro

A avaliação da viabilidade celular mostrou que as linhagens V79 e HeLa foram mais sensíveis à exposição das nanopartículas, atingindo, respectivamente, 69 e 60% de viabilidade celular na maior concentração testada 1,96 x10¹¹. Como já mostrado em diversos estudos a linhagem V79 apresenta alta sensibilidade, o que provavelmente resultou em maior morte celular. Em relação à linhagem Hela, por se tratar de uma linhagem tumoral provavelmente não obteve sucesso no reparo de danos que ocorreram no DNA devido à exposição às nanopartículas. Entretanto, as linhagens A549 e 3T3, na mesma concentração, apresentaram viabilidade acima de 90% (Figura 2A). O fato da linhagem A549 não apresentar morte celular, mesmo se tratando de uma linhagem tumoral, pode ser explicada devido ao fato desta não ter sofrido tantos danos como a linhagem HeLa, como mostrado na Figura 2B.

Figura 2
Avaliação da toxicidade - ensaio in vitro - em linhagens celulares: A549, V79, 3T3 e HeLa expostas às concentrações de 0,0 NP mL_-1, 1,96 x 10₇; 10₈e 10₉ NPs mL_-1. a) viabilidade celular por citometria de imagem; b) Danos de DNA pelo ensaio cometa. Números iguais não apresentam significância estatística (p > 0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05). Indicações a(controle x tratamento); b (entre tratamentos) e c (entre linhagens)

As análises de genotoxicidade (ensaio cometa) com as linhagens celulares A549, V79, 3T3 e HeLa expostas às NPs de Fe₂O₃ por uma hora em diferentes concentrações mostraram que em maiores concentrações ocorreram os menores índices de danos no DNA, o que pode ser explicado pela provável agregação das NPs em altas concentrações (Figura 2B).

Variações na resposta de linhagens celulares em relação à toxicidade de NPs de Fe₂O₃ são encontradas na literatura,² sendo estes resultados explicados pela diversidade metabólica apresentada pelas diferentes linhagens. Chusei et al.⁴¹ verificaram aproximadamente 100% de viabilidade da linhagem celular A549 pelo ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil Tetrazolium) nas concentrações de 0-100 μg mL^-1 de NPs Fe₂O₃. Rajiv et al.¹² em estudos realizados com linfócitos humanos mostraram que estes foram sensíveis às NPs Fe₂O₃, apresentando viabilidade em torno de 50% em exposição a 100 μg mL^-1.

Embora os resultados mostrem a presença de danos de DNA (análise cometa) quando as células foram expostas às NPs, em análise de viabilidade celular as mesmas não apresentaram morte celular, logo existe a sugestão de que o meio intracelular pode apresentar respostas de reparo do material genético, o que faz com que a célula seja tolerante a este tipo de NPs.^42,43 Estudos mostram que o mecanismo de ação das NP Fe₂O₃ está ligado à geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) podendo resultar em processos inflamatórios nas células e consequente ruptura na membrana das mitocôndrias, danos no DNA e morte celular programada por apoptose.^2,7,42-44 Entretanto, as reações causadas pelos íons de ferro gerados pela dissociação das NPs no citoplasma celular são controladas por um complexo de proteínas que podem fazer o transporte ou armazenamento deste nanocomposto, justificando a tolerância celular às NPs de Fe₂O_3.^7,42,43

Análises de Genotoxicidade em Allium cepa

No ensaio Allium cepa foram observados maiores índices de alterações (IA) nas maiores concentrações testadas (19,6 e 39 x 10⁹ NPs mL^-1) (Figura 3).

Figura 3
Resultados das análises de genotoxicidade em teste de Allium cepa por índices de alterações (IA) após exposição a diferentes concentrações de NP Fe₂O₃: 0,00; 1,96; 3,9; 19,6 e 39 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais não apresentam significância estatística (p > 0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05)

Saquib et al.⁴⁵ ao utilizarem modelo vegetal Raphanus sativus demonstraram que o potencial genotóxico da NPs de Fe₂O₃ está relacionado à concentração. Os autores relatam que as NPs agem no interior da célula, liberando íons tóxicos e ocasionando o estresse oxidativo, levando à alteração do funcionamento mitocondrial e danos ao DNA. Estes danos no material genético comprovam a necessidade de aprofundamento nos estudos sobre a toxicidade destas NPs.^26,45,46 Desta forma, é importante a investigação e diversificação dos estudos com plantas e o conhecimento dos mecanismos intracelulares das NPs no metabolismo celular.

Avaliação da toxicidade em zebrafish (Danio rerio)

Ensaio cometa em células sanguíneas e branquiais de D. rerio

Os resultados das análises de genotoxicidade em células sanguíneas e branquiais mostraram diferença significativa em concentrações mais elevadas quando comparadas ao controle. As células branquiais apresentaram maior sensibilidade (3,902; 19,6 x10⁹ NPs mL^-1) que as células sanguíneas quando em concentração 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1 (Figura 4).

Figura 4
Resultados da genotoxicidade em células sanguíneas e branquiais de D. rerio indicados por índice de relativos de danos após exposição a diferentes concentrações de NPs de óxido de ferro: 0,0 (controle); 1,96; 3,90; 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais não apresentam significância estatística e números diferentes apresentam significância estatística

Esses resultados são condizentes com a literatura, visto que em estudos realizados com peixes foram observados maiores índices de danos no DNA de células branquiais. Os autores justificam que estes órgãos podem adsorver as NPs de Fe₂O₃, pois estão em contato direto com as NPs presentes no ambiente.^21,47,48

Diversos estudos realizados em peixes demonstram o potencial genotóxico de diferentes nanocompostos e a sensibilidade do ensaio cometa, lembrando que este é considerado um pré-teste. Em estudo realizado com D. rerio expostos por 96 h a 200 mg L^-1 a NPs de vermiculite esfoliada magnética e NPs vermiculite esfoliada com tamanho médio de 150 nm, foi possível observar, pelo ensaio cometa com eritrócitos, que estes apresentaram índice de danos significativo em relação ao controle.⁴⁹ Em outro estudo realizado com fêmeas de Poedilia reticulata expostas a NPs γ-Fe₂O₃ com tamanho médio de 4 nm (0,3 mg/L) foi observada genotoxicidade nas exposições entre 3 e 7 dias, e genotoxicidade e mutagenicidade (teste de micronúcleo) em exposições por mais 14 e 21 dias.⁵⁰

Avaliação bioquímica dos efeitos das nanopartículas de óxido de ferro nos diferentes tecidos de D. rerio

A análise das enzimas ligadas ao mecanismo antioxidante, CAT e GPx, e ao processo de biotransformação de xenobióticos, GST, nos diferentes tecidos de D. rerio expostos às NPs de Fe₂O₃ nas concentrações de 1,96; 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1 durante 72 horas são apresentadas na Figura 5. Os resultados das análises bioquímicas mostraram que a CAT aumentou no cérebro e no músculo, em todas as concentrações utilizadas, no coração (em 1,96 x 10⁹ NPs mL^-1) e no fígado (em 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1) quando comparadas com o controle (Figura 5A). Entretanto, a atividade da CAT foi mais elevada no fígado em relação aos outros órgãos. A maior atividade da CAT no fígado confirma o papel deste órgão nos processos de desintoxicação e que este órgão é capaz de eliminar o peróxido de hidrogênio (H₂O₂). Além da desintoxicação, o fígado também está envolvido no processo de filtração como o baço e o rim e, neste sentido, é um órgão alvo em peixes expostos a NPs.⁵¹ Ademais, a atividade aumentada da CAT demonstra também uma resposta adaptativa dos diferentes órgãos às NPs, na tentativa de neutralizar as EROs. De acordo com Hermes-Lima,⁵² maiores atividades da CAT são observadas quando há elevação da peroxidação lipídica.

Figura 5
Atividade das enzimas catalase (CAT) (A), glutationa peroxidase (GPx) (B) e glutationa S-transferase (GST) (C) em Danio rerio expostos às nanopartículas Fe₂O₃ pelo período de 72 h, nas concentrações de 1,96; 3,90 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1. Números iguais não apresentam significância estatística (p>0,05) e números diferentes apresentam significância estatística (p < 0,05)

O mecanismo de defesa antioxidante funciona de forma complexa a partir da ação de diversas enzimas no combate à produção de EROS. As enzimas CAT e SOD são as primeiras a agir na inativação de EROs,^53,54 a SOD desmuta os radicais superóxidos (O₂ ^.-) em H₂O₂ que poderão ser decompostos pela CAT e GPx. A CAT decompõe o H₂O₂ em água e oxigênio. Este sistema irá realizar a desintoxicação do organismo evitando os danos celulares.^42,55

A atividade da GPx (Figura 5B) diminuiu significativamente no cérebro nas concentrações 1,96; 3,902 x 10⁹, porém aumenta na maior concentração 19,6 x 10⁹, no coração é observado aumento da atividade de acordo com o aumento da concentração, na pele (em 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1) ocorreu uma queda na atividade quando esta é comparada com o controle. É possível também observar que a atividade da GPx aumentou significativamente em relação ao controle no coração (em 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1), no fígado, em todas as concentrações testadas, no músculo (em 3,902 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1), assim como na pele (em 1,96 e 3,902 x 10⁹ NPs mL^-1). O aumento da GPx pode indicar que esta enzima está compensando a atividade diminuída da CAT⁵⁶ e mostra também maior susceptibilidade dos peixes às NPs, evidenciando que as mudanças no ambiente podem resultar em alterações bioquímicas no interior das células, o que por sua vez, modulam a atividade destas enzimas. A diminuição da atividade na pele na concentração mais alta pode indicar a agregação da nanopartícula no meio e por consequência não resposta da pele.

Embora não tenha sido avaliado o acúmulo das NPs nos tecidos, o ferro liberado das NP Fe₂O₃ pode ser tóxico quando se acumula em um nível inadequado. Como descrito por Halliwell e Gutteridge⁵³ e Jeong e Connolly⁵⁷ o ferro livre, incluindo Fe (II) e Fe (III), pode participar da reação de Fenton e gerar radicais hidroxílicos citotóxicos. Neste sentido, a produção de EROs ativa os sistemas de defesa antioxidantes que protegem as células dos danos oxidativos. Por outro lado, a diminuição na atividade da GPx em D. rerio pode estar relacionada à produção de O₂, à ação direta das NP Fe₂O₃ sobre a síntese desta enzima e também pode ser um sinal de toxicidade associada à produção de EROs induzida pela presença das NPs. A GPx catalisa a redução do H₂O₂ e peróxidos orgânicos a seus correspondentes alcoóis às custas da conversão da GSH (glutationa reduzida) a GSSG (glutationa oxidada). Portanto, a diminuição da atividade da GPx pode estar relacionada também à escassez de GSH nos tecidos. Os níveis de GSH dependem, principalmente, do equilíbrio entre a taxa de síntese de GSH, a taxa de conjugação (por GSTs), taxa de oxidação (não enzimática ou por GPx), e redução da GSSG para GSH (via glutationa redutase, GR).^58,59 A GSH é a molécula redox mais abundante nas células e, portanto, desempenha um papel importante na desintoxicação de eletrófilos e na prevenção do estresse oxidativo celular (Hermes-Lima, 2004, Latha e Pari, 2004). Outra via metabólica possível para a homeostase de metais na célula se faz por meio da quelação de íons metálicos, que poderá formar complexos protéicos nas mitocôndrias, diminuindo ou até mesmo inibindo o estresse oxidativo⁵⁵.

A atividade da GST aumentou significativamente no coração e no fígado nas concentrações de 3,902 x 10⁹ NPs mL^-1 e 19,6 x 10⁹ NPs mL^-1, quando comparados com seus respectivos controles. Entretanto, quando comparada com os órgãos estudados, a atividade da GST foi menor no coração e cérebro. Por outro lado, a atividade da GST no cérebro, músculo e pele, em todas as concentrações estudadas, apresentou semelhança à apresentada pelos controles (Figura 5B). O aumento da atividade da GST indica que o organismo está passando por um processo de desintoxicação.⁵⁹ A GST juntamente com a GPx tem a função de reduzir os peróxidos evitando danos no DNA.⁶⁰

Estudos realizados com NP Fe₂O₃ em peixes demonstram que em adultos a defesa antioxidante e a eliminação das NPs são mais eficientes do que em embriões.²¹ Contudo, em medaka adultos, Oryzias latipes, expostos por 14 dias a 50 μg/mL de NP Fe₂O₃(30 nm) houve indução do estresse oxidativo no fígado e cérebro, no início da exposição, sendo o equilíbrio fisiológico restaurado com o tempo.²⁵ O mesmo comportamento foi observado em D. rerio expostos a 4 e 10 mg L^-1 de NP Fe₂O₃ (140-160nm) por 28 dias, com sangramento e mudança na cor da pele, acúmulo de NPs nos animais nos primeiros dias de exposição por adsorção e ingestão e eliminação das NPs após 24 dias.²¹ Zhang et al.²¹ sugeriram em seu estudo que houve retenção de uma parte destas NPs no sistema gastrointestinal e nas brânquias, e que os íons de ferro induziram o estresse oxidativo nos primeiros dias de exposição.

Em nosso estudo as alterações nas atividades enzimáticas indicam a mudança do funcionamento dos órgãos e indução de estresse oxidativo pelas NPs de Fe₂O₃. Ademais, cada órgão respondeu de maneira distinta às diferentes concentrações de NPs devido às suas capacidades metabólicas. Esta variação de resposta nos diferentes tecidos também foi observada em tilápias, Oreochromis niloticus, expostas as NPs de óxido de ferro, onde foi verificado acúmulo, distribuição fisiológica e eliminação das NPs.⁵¹

CONCLUSÃO

As NPs Fe₂O₃ tiveram suas características físico-químicas alteradas dependendo do meio dispersante; o potencial genotóxico foi dose dependente nos estudos in vitro e nos estudos in vivo os resultados mostraram que estas apresentaram genotoxicidade também em células branquiais e sanguíneas de Danio rerio. Em relação as análises bioquimicas foram observadas alteração nas atividades das enzimas CAT, GPx e GST nos tecidos de Danio rerio e estas podem ser utilizadas como biomarcadores de estresse oxidativo e para monitoramento ambiental. Análises de toxicidade de nanomateriais devem ser melhor investigadas, pois mesmo em baixas concentrações, em caso de nanopartículas metálicas, a exposição pode ser por períodos longos de tempo, fator que pode resultar em efeitos semelhantes aos de exposição a concentrações elevadas por um curto período de tempo. Desta forma é necessário ter cautela no uso das NPs de Fe₂O₃, principalmente devido à possibilidade da modificação de suas propriedades físico-químicas dependente do meio em que estão dispersas, fato que pode influenciar sua toxicidade em diferentes ambientes

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Set 2018

Histórico

• Recebido
  18 Mar 2018
• Aceito
  11 Jul 2018
• Publicado
  14 Ago 2018