Gama-orizanol reduz a inflamação e o estresse oxidativo nos rins pela modulação do eixo RAGE/AGEs em animais submetidos a uma dieta rica em gordura e açúcar

Resumo

Introdução:

O receptor para AGEs (RAGE) é um membro multiligante da superfamília das imunoglobulinas dos receptores de superfície celular expresso em muitos órgãos, entre eles, os rins. Quando ativado, o RAGE leva a uma sequência de sinalização que resulta em inflamação e estresse oxidativo, ambos envolvidos na patogênese de doenças renais. O gama-orizanol (γOz) compreende uma mistura de ésteres de ácido ferúlico (AF) e fitoesteróis (esteróis e álcoois triterpenos) encontrados principalmente no arroz, com atividades antioxidantes e anti-inflamatórias.

Objetivo:

Avaliar o efeito do γOz para reduzir a inflamação renal e o estresse oxidativo pela modulação do eixo RAGE/AGEs em animais submetidos a uma dieta rica em gordura e açúcar.

Métodos:

Ratos Wistar machos (±187g) foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais: controle (n = 7 animais) e dieta rica em gordura e açúcar (HSF, do inglês high sugar-fat diet, n = 14 animais) por 20 semanas. Após este período, quando foi detectada a presença de fatores de risco de doença renal no grupo HSF (resistência à insulina, dislipidemia, aumento da pressão arterial sistólica e obesidade), os animais HSF foram divididos para iniciar o tratamento com γOz ou continuar recebendo apenas HSF por mais 10 semanas.

Resultados:

Não foi observado nenhum efeito do γOz na obesidade e nos parâmetros metabólicos. No entanto, a inflamação e o estresse oxidativo renais diminuíram assim que os níveis de RAGE foram reduzidos em HSF + γOz.

Conclusão:

É possível concluir que o gama- orizanol foi eficaz em reduzir a inflamação e o estresse oxidativo no rim pela modulação do eixo RAGE/AGEs.

Descritores:
Receptor RAGE; Inflamação; Antioxidante; Rim; Obesidade

Abstract

Introduction:

The receptor for AGEs (RAGE) is a multiligand member of the immunoglobulin superfamily of cell surface receptors expressed in many organs, among them, the kidneys. When activated, RAGE leads to a sequence of signaling that results in inflammation and oxidative stress, both involved in kidney disease pathogenesis. Gamma-oryzanol (γOz) comprises a mixture of ferulic acid (FA) esters and phytosterols (sterols and triterpene alcohols) mainly found in rice, with antioxidant and anti-inflammatory activities.

Aim:

To evaluate the effect of γOz to reduce renal inflammation and oxidative stress by modulating AGEs/RAGE axis in animals submitted to a high sugar-fat diet.

Methods:

Male Wistar rats (±187g) were randomly divided into two experimental groups: control (n = 7 animals) and high sugar-fat diet (HSF, n = 14 animals) for 20 weeks. After this period, when the presence of renal disease risk factors was detected in the HSF group (insulin resistance, dyslipidemia, increased systolic blood pressure and obesity), the HSF animals were divided to begin the treatment with γOz or continue receiving only HSF for 10 more weeks.

Results:

No effect of γOz on obesity and metabolic parameters was observed. However, kidney inflammation and oxidative stress decreased as soon as RAGE levels were reduced in HSF + γOz.

Conclusion:

It is possible to conclude that the gamma- oryzanol was effective in reducing inflammation and oxidative stress in the kidney by modulating the AGEs/RAGE axis.

Keywords:
AGE receptor; Inflammation; Antioxidants; Kidney; Obesity

Introdução

A glicação de proteínas é uma série complexa de reações sequenciais chamadas coletivamente de reação de Maillard, que resulta na formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs, do inglês advanced glycation end products). Fontes endógenas de AGEs podem ser encontradas em todos os tecidos e fluidos onde a concentração de glicose é suficiente para reagir com proteínas, tais como em condições de hiperglicemia e diabetes¹. Além disso, a degradação de proteínas glicadas, intermediários glicolíticos e a degradação de aldoses e cetoses resultam na formação de espécies carbonílicas reativas, tais como glioxal (G), metilglioxal (MG) e 3-deoxiglucosona, que também são capazes de reagir com proteínas para formar mais AGEs diretamente². Os mesmos também estão presentes em alimentos ingeridos, caracterizando fontes exógenas de AGEs. O conteúdo depende da composição de nutrientes e de como o alimento é processado (por exemplo, altos níveis de AGEs são encontrados em alimentos torrados, defumados e assados)^1,3.

A nível celular, os efeitos prejudiciais destes produtos têm sido atribuídos a várias proteínas de ligação de AGEs, tais como RAGE (receptor de AGEs), receptor de AGEs (AGER) 1, R2, R3, e receptores scavenger, como CD-3647 e SCR-II⁴. É importante enfatizar que estes receptores de superfície celular podem se ligar a produtos finais da glicação avançada, e também podem interagir com múltiplos ligantes chamados receptores multi-ligantes, entre eles: proteína do grupo de alta mobilidade (B)1 (HMGB1, do inglês high-mobility group protein (B)1), proteína ligante de cálcio S-100, proteína β-amiloide, Mac-1, e fosfatidilserina⁵. Entre os receptores de AGEs, o RAGE é o mais notável, e desencadeia estresse oxidativo e inflamação tanto em doenças agudas como crônicas. Especificamente, a ligação do RAGE leva a uma sequência de sinalização com a ativação do fator de transcrição fator nuclear kappa-B (NFκB, do inglês nuclear factor kappa-B) resultando na produção de citocinas pró-inflamatórias, entre elas o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α, do inglês tumoral necrosis factor alfa), a interleucina-6 (IL-6) e a proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1, do inglês monocyte chemoattractant protein-1)⁶.

A ativação de RAGE leva ao estresse oxidativo pela indução de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH)-oxidase (NOX), especialmente NOX-4. A oxidação impulsionada pelo eixo RAGE/AGEs induz a oxidação proteica e lipídica levando à formação de carbonilas de proteínas e peroxidação lipídica, sendo responsável por espécies carbonílicas reativas derivadas de lipídios que, por sua vez, formam adutos carbonílicos de proteínas (ALEs) que também são quelantes de RAGE, sustentando assim a ativação do RAGE⁷. Assim, de acordo com as informações acima descritas, é possível observar que o eixo RAGE/AGEs é uma interface entre estresse oxidativo e inflamação, que são pilares para o desenvolvimento de várias doenças, especialmente em órgãos que expressam esses receptores para AGEs, como cérebro, coração e rins⁸.

O podócito é a principal célula que expressa o RAGE no glomérulo renal^1,9. Tem sido descrito na literatura que a transdução de sinal RAGE-dependente em podócitos leva à apoptose, produção de proteína quimioatraente de monócitos -1, mediadores inflamatórios e estresse oxidativo via NOX-4, causando alterações estruturais renais, resultando em aumento da proteinúria e redução da taxa de filtração glomerular (TFG)⁹. Uma vez que a TFG é a principal forma de excretar AGEs, a exacerbação da lesão renal contribui para o acúmulo de AGEs, caracterizando um feedback vicioso positivo do acúmulo de AGEs através do estresse oxidativo induzido por RAGE/AGEs no curso da progressão da DRC¹.

Desta forma, a busca por estratégias para diminuir a carga de ligantes (AGEs e outros ligantes de RAGE) e estratégias para amortecer a ativação de RAGE tem recebido atenção, como o uso de compostos naturais como um promissor pool de substâncias para tratar doenças^10,11. O gama-orizanol (γOz) compreende uma mistura de ésteres de ácido ferúlico (AF) e fitoesteróis (esteróis e álcoois triterpenos) encontrados principalmente no arroz, um grão muito importante na dieta humana. Uma grande variedade de efeitos biológicos tem sido atribuída ao γOz, tais como efeitos antidiabéticos, antioxidantes, anti-inflamatórios e anti-obesidade¹². Outros estudos já demonstraram um efeito positivo do γOz para prevenir a síndrome metabólica cardiorrenal¹³, melhorar a doença renal¹⁰, e aumentar o crescimento muscular e o desempenho esportivo¹⁴.

Assim, uma vez que a ligação RAGE/AGEs é capaz de induzir inflamação renal e estresse oxidativo e dada a falta de estudos que avaliem o efeito do γOz na modulação de RAGEs/AGE renais, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do γOz na redução da inflamação renal e do estresse oxidativo pela modulação do eixo RAGE/AGEs em animais submetidos a uma dieta rica em gordura e açúcar. A lógica da utilização do γOz neste modelo animal é sustentada pela literatura recente que demonstra que esta classe de compostos, além de ter uma atividade antioxidante bem estabelecida, exerce um efeito antiglicante direto¹⁵.

Material e Métodos

Protocolo experimental

Todos os experimentos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu (1150/2015) e foram realizados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. Ratos Wistar machos (±187 g) foram alojados em gaiolas individuais em uma sala com ambiente controlado (22±3 °C; ciclo claro-escuro de 12 h, e umidade relativa de 60±5 %) e divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais: controle (n = 7 animais) e dieta rica em gordura e açúcar (HSF, n = 14 animais) por 20 semanas. Na 20ª semana, quando foi detectada a presença de fatores de risco para doença renal no grupo HSF^10,13 (resistência à insulina, dislipidemia, aumento da pressão arterial sistólica e obesidade), os animais foram divididos para iniciar o tratamento com γOz ou continuar recebendo apenas HSF por mais 10 semanas: HSF, n=7 animais e HSF + γOz, n= 7 animais. A dieta HSF continha farinha de soja, sorgo, casca de soja, dextrina, sacarose, frutose, banha, vitaminas e minerais, mais 25% de sacarose na água potável; a dieta controle continha farinha de soja, sorgo, casca de soja, dextrina, óleo de soja, vitaminas e minerais. Os nutrientes e a composição nutricional de cada dieta foram descritos em nosso estudo anterior¹³.

Gama- orizanol

O composto foi adquirido da Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Toshima, Kita-ku, Tóquio) (lote.5ZZYLPJ). O γOz utilizado neste estudo foi adicionado à ração (0,5 w/w), em consonância com nosso estudo anterior¹³, a fim de simular o consumo diário de arroz de um indivíduo adulto no Brasil, de acordo com dados da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) 2008-2009¹⁶.

Parâmetros nutricionais e avaliação dos distúrbios relacionados à obesidade

O perfil nutricional considerado foi: peso corporal final (PCF), índice de adiposidade (IA), resistência à insulina, níveis de triglicerídeos e pressão arterial sistólica (PAS). O peso corporal foi medido semanalmente. Após a eutanásia, os depósitos de gordura (visceral (VAT), epididimal (EAT) e retroperitoneal (RAT)) foram usados para calcular o índice de adiposidade (IA) pela seguinte fórmula: VAT+EAT+RAT /PCF ×100¹⁷.

Após jejum de 12 h, foi coletado sangue, e o plasma foi usado para medir parâmetros insulínicos e bioquímicos. O sangue de animais em jejum foi coletado em tubos contendo EDTA e centrifugado a 3500 rpm e o plasma foi coletado para análise. A concentração de glicose foi determinada usando um glicosímetro (Accu-Chek Performa, Roche Diagnostics Brazil Limited); os triglicerídeos foram medidos com um sistema analisador enzimático automático (Chemistry Analyzer BS-200, Mindray Medical International Limited, Shenzhen, China). Os níveis de insulina foram medidos usando o método de ensaio imunoenzimático (ELISA) usando kits comerciais (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA). O modelo homeostático de avaliação da resistência à insulina (HOMA-IR) foi utilizado como um índice de resistência à insulina, calculado de acordo com a seguinte fórmula: HOMA-IR= (glicose de jejum (mmol/L) × insulina de jejum (µU/mL)) / 22,5¹⁸.

A avaliação da pressão arterial sistólica (PAS) foi feita em ratos conscientes pelo método não-invasivo de cauda-manguito com um eletrofigmomanômetro Narco Bio-Systems® (International Biomedical, Austin, TX, EUA). Os animais foram mantidos em uma caixa de madeira (50×40 cm) entre 38 e 40 °C durante 4-5 minutos para estimular a vasodilatação arterial¹⁹. Após este procedimento, um manguito com um sensor de pulso pneumático foi fixado à cauda de cada animal. O manguito foi inflado a 200 mmHg de pressão e posteriormente desinflado. Os valores da pressão arterial foram registrados em um polígrafo Gould RS 3200 (Gould Instrumental Valley View, Ohio, EUA). A média de três leituras de pressão foi registrada para cada animal.

Níveis de RAGE

O tecido renal (±150 mg) foi homogeneizado (ULTRA-TURRAX® T 25 básico IKA® Werke, Staufen, Alemanha) em 1,0 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) com pH 7,4 e centrifugado a 800 g a 4 °C durante 10 min. O sobrenadante (100 µL) foi utilizado na análise. Os níveis de receptores para produtos finais da glicação avançada (RAGE) foram medidos usando o método de ensaio imunoenzimático (ELISA) usando kits comerciais da R&D System, Minneapolis, EUA (DY- 1616; 4000- 31,3 pg/mL de detecção). Os resultados foram corrigidos de acordo com a quantidade de proteína.

Níveis de AGEs

A maioria dos AGEs tem uma fluorescência característica. Assim, a determinação dos AGEs foi baseada na detecção espectrofluorométrica de acordo com Henle et al. (1991)²¹ e Münch et al. (1997)²¹. Plasma e urina foram diluídos 1:20 com PBS (tampão fosfato) pH 7,4 e a intensidade de fluorescência foi registrada no máximo de emissão (440 nm) após excitação a 370 nm (espectrofluorômetro Fluoromax-3, Jobin Yvon Horiba, EUA). A intensidade da fluorescência é expressa em unidades arbitrárias (UF/mg de proteína).

Parâmetros inflamatórios renais

A própria inflamação é um fator de risco para a perda da função renal²². A ativação do RAGE leva a uma sequência de sinalização com ativação de resposta inflamatória¹.

O tecido renal (±150 mg) foi homogeneizado (ULTRA-TURRAX® T 25 básico IKA® Werke, Staufen, Alemanha) em 1,0 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) pH 7,4 e centrifugado a 800 g a 4°C por 10min. O sobrenadante (100 µL) foi utilizado na análise. Os níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) foram medidos pelo método ELISA usando kits comerciais da R&D Systems, Minneapolis, EUA (TNF-α: DY 510; IL-6: DY 506; MCP-1). O limite de detecção do TNF-α foi de 4000-62,5 pg/mL, o limite de detecção da IL-6 foi de 8000-125 pg/mL, e o limite da MCP-1 foi de 1000-15,6 pg/mL. O sobrenadante (100 µL) foi utilizado para análise, e os resultados foram corrigidos de acordo com a quantidade de proteína.

Carbonilação de proteína renal

A carbonilação é uma modificação proteica irreversível induzida por espécies reativas de oxigênio (ERO). Pode ser produzida por clivagem oxidativa da cadeia principal da proteína ou por um ataque por radicais de ERO a alguns aminoácidos específicos nas cadeias laterais, como lisina, arginina, prolina ou treonina. As carbonilas proteicas são os marcadores mais amplamente utilizados para medir o dano proteico oxidativo²³.

O sobrenadante descrito acima foi usado para análise da carbonilação da proteína renal. As proteínas carboniladas foram medidas por um método não específico que utiliza DNPH (agente de derivatização 2, 4-dinitrofenilhidrazina) e detecção fotométrica de qualquer proteína modificada por carbonilação²⁴. Os níveis de proteína carbonilada são expressos em nmol de DNPH/mg de proteína.

Renal nox-4 gene expression

Das isoformas de NOX, a Nox4 é abundantemente expressa no rim e é uma fonte importante de ERO renal desencadeada por RAGE²⁵. O RNA total foi extraído do tecido renal usando o reagente TRIzol (Invitrogen). O kit SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) foi utilizado para a síntese de 20 mL de DNA complementar a partir de 1000 ng de RNA total. Os níveis de mRNA de NOX-4 (ensaio Rn 00585380_m1; Applied Biosystems) foram determinados por PCR em tempo real. As medições quantitativas foram feitas com um kit comercial (TaqMan PCRq; Applied Biosystems) em um sistema de detecção (StepOne Plus; Applied Biosystems). As condições de ciclagem foram as seguintes: ativação enzimática a 50 ºC por 2 min, desnaturação a 95 ºC por 10 min; produtos complementares de DNA foram amplificados por quarenta ciclos de desnaturação a 95 ºC por 15s e anelamento/extensão a 60 ºC por 1 min. A expressão gênica foi quantificada em relação aos valores do grupo Controle após a normalização por um controle interno (ciclofilina: ensaio Rn 00690933_m1; Applied Biosystems) pelo método 22DDCT, conforme descrito anteriormente²⁶.

Função renal

Após a coleta da urina de 24 horas das gaiolas metabólicas, a função renal foi avaliada considerando a taxa de filtração glomerular (TFG = (creatinina urinária × fluxo) / creatinina plasmática)¹⁰ e a relação proteína/creatinina, uma vez que reflete a proteinúria e é considerado um marcador da função renal²⁷.

Análise estatística

Os resultados são reportados como média ± desvio padrão (DP) ou mediana (intervalo interquartil). As diferenças entre os grupos foram determinadas pela análise de variância unidirecional. As variáveis estatisticamente significativas foram submetidas ao teste post-hoc de Tukey para comparar todos os grupos. As análises estatísticas foram realizadas usando Sigma Stat para Windows Versão 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). Considerou-se estatisticamente significativo um valor de p de 0,05.

Resultados

A Figura 1 apresenta os parâmetros nutricionais dos grupos. É possível verificar que ambos os grupos que receberam dieta HSF (grupos HSF e HSF + γOz) apresentaram aumento do índice de adiposidade, resistência à insulina, dislipidemia e pressão arterial sistólica em comparação com o grupo controle. Não foi observado nenhum efeito do γOz sobre estes parâmetros.

Figura 1
Parâmetros de transtornos nutricionais e relacionados à obesidade ao final de 30 semanas. (A) Peso corporal final (g); (B) Índice de adiposidade (%); (C) HOMA-IR; (D) Níveis de triglicerídeos plasmáticos (mg/dL); (E) Pressão arterial sistólica (mmHg). Os dados são expressos em médias ± desvios padrão ou medianas e intervalos interquartis (n = 7 animais/grupo). Comparação por ANOVA One Way com post-hoc de Tukey. *p < 0,05. HSF: dieta rica em gordura e açúcar; HSF + γOz: dieta rica em gordura e açúcar + gama-orizanol.

Os níveis plasmáticos de AGEs foram os mesmos nos grupos HSF e HSF + γOz e mais elevados que os do grupo controle. O grupo HSF apresentou menor AGE na urina e aumento do RAGE nos rins em comparação com o grupo controle. O grupo HSF + γOz apresentou um aumento dos níveis de AGEs na urina e uma redução dos níveis de RAGE em comparação com o grupo HSF (Figura 2).

Figura 2
Níveis de AGEs e RAGE. (A) Níveis plasmáticos de AGEs (UF/mg de proteína); (B) Níveis de AGEs na urina (UF/mg de proteína); (C) Níveis de RAGE no rim (pg/g de proteína) (C). Os dados são reportados em médias ± desvios padrão (n = 7 animais/grupo). Comparação por ANOVA One Way. Com o teste post-hoc de Tukey. *p < 0,05. HSF: dieta rica em gordura e açúcar; HSF + γOz: dieta rica em gordura e açúcar + gama- orizanol.

Os parâmetros de estresse oxidativo renal são apresentados na Figura 3. O grupo HSF apresentou maior expressão gênica de NOX-4 em comparação com o grupo controle. O tratamento com gama-orizanol foi eficaz para reduzir a carbonilação e a expressão gênica de NOX-4 no HSF + γOz em comparação com o grupo HSF.

Figura 3
Parâmetros de estresse oxidativo renal. (A) Carbonilação de proteína renal (nmol/mg de proteína); (B) Expressão gênica relativa de NOX-4. Os dados são reportados em médias ± desvios padrão (n = 7 animais/grupo). Comparação por ANOVA One Way com o teste post-hoc de Tukey. *p < 0,05. HSF: dieta rica em gordura e açúcar; HSF + γOz: dieta rica em gordura e açúcar + gama-orizanol.

A Figura 4 mostra os parâmetros inflamatórios renais. O grupo HSF apresentou níveis mais altos de parâmetros pró-inflamatórios em comparação com o grupo controle, enquanto o grupo HSF + γOz apresentou níveis mais baixos de IL-6, TNF-α e MCP-1 do que o grupo HSF.

Figura 4
Parâmetros inflamatórios renais. (A) Interleucina-6 (IL-6, pg/g de proteína); (B) Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α, pg/g de proteína); (C) Proteína quimioatraente de monócitos -1 (MCP-1, pg/g de proteína). Os dados são reportados em médias ± desvios padrão ou medianas e intervalos interquartis (n = 7 animais/grupo). Comparação por ANOVA One Way com teste post-hoc de Tukey. *p < 0,05. HSF- dieta rica em gordura e açúcar; HSF + γOz- dieta rica em gordura e açúcar + gama-orizanol.

Os parâmetros da função renal são apresentados na Figura 5. O grupo HSF apresentou aumento da relação proteína/creatinina e menor TFG em comparação com o grupo controle. Por outro lado, o grupo HSF + γOz apresentou melhora na função renal, caracterizada pelo aumento da taxa de filtração glomerular. Este grupo também apresentou redução na lesão renal, com menor proteinúria (relação proteína/creatinina) em comparação com o HSF.

Figura 5
Parâmetros da função renal. (A) Relação proteína/creatinina urinária; (B) Taxa de filtração glomerular (TFG, mL/min). Os dados são reportados em medianas e intervalos interquartis (n = 7 animais/grupo). Comparação por ANOVA One Way com teste post-hoc de Tukey. *p < 0,05. HSF: dieta rica em gordura e açúcar; HSF + γOz: dieta rica em gordura e açúcar + gama-orizanol.

Discussão

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do γOz na redução da inflamação renal e do estresse oxidativo pela modulação do eixo RAGE/AGEs em animais submetidos a uma dieta rica em gordura e açúcar. A obesidade é uma condição associada a vários transtornos considerados fatores de risco para o desenvolvimento de doenças renais, entre eles, obesidade central, aumento dos níveis de triglicerídeos, baixa lipoproteína de alta densidade, hipertensão e glicemia de jejum elevada²⁸. Algumas vias possíveis para induzir doenças renais são a resistência à insulina e inflamação crônica, um dos principais contribuintes para a remodelação microvascular; dislipidemia e disponibilidade excessiva de nutrientes que podem induzir disfunção mitocondrial; desequilíbrio de adipocinas; o sistema renina-angiotensina; e estresse oxidativo. Nossos resultados não mostraram nenhum efeito do γOz sobre os parâmetros metabólicos, em contraste com a literatura que mostra efeitos positivos, especialmente nos níveis de glicose e dislipidemia. Esta divergência pode ser explicada pelo uso de diferentes modelos animais, dose de γOz, e tempo de tratamento. Nosso estudo tratou ratos Wistar machos com 0,5% de γOz na ração durante 10 semanas, uma dose correspondente a um consumo médio de 50 mg/dia de γOz. Wang et al. (2015)²⁹ alimentaram ratos Sprague Dawley machos com uma dieta rica em gorduras e frutose, suplementada com 0,05% de AF ou 0,16% de γOz por 13 semanas e descobriram que o AF e γOz apresentaram efeitos semelhantes no alívio da obesidade, hiperlipidemia, hiperglicemia e resistência à insulina. Cheng et al. (2013)³⁰ estudaram o efeito de uma dieta com 15% de óleo de palma com a adição de 5,25 g de gama-orizanol durante 5 semanas em ratos Wistar machos com diabetes tipo 2 induzida por estreptozotocina. Nenhum efeito de γOz foi observado na gordura corporal, glicose e insulina; no entanto, os níveis de resistência à insulina (área sob a curva), triglicerídeos e colesterol LDL foram reduzidos com o composto.

O papel da inflamação na patogênese e progressão da doença renal crônica (DRC) tem sido reconhecido desde o final dos anos 90, quando os níveis de IL-1 foram associados a complicações importantes e ao aumento da taxa de mortalidade em pacientes submetidos à diálise crônica. Os estudos seguintes demonstraram que a inflamação persistente é capaz de promover consequências adversas para os rins³¹. Evidências mostram que inflamações e reações inflamatórias de qualquer causa podem modificar ou interferir com a regulação microcirculatória intrarrenal e a distribuição da perfusão e podem induzir dano renal, melhorando assim a progressão da doença renal³¹. Nossos resultados mostraram que a resposta inflamatória no rim foi atenuada no grupo HSF tratado com γOz , corroborando o efeito anti-inflamatório do composto.

A patogênese do estresse oxidativo em pacientes com DRC tem sido bem documentada na literatura atual³². A produção excessiva de ERO resulta na ativação de vários sistemas enzimáticos, como a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase e a cadeia respiratória mitocondrial, e, juntamente com mecanismos de defesa antioxidante comprometidos, são os principais fatores para a condição de estresse oxidativo que ocorre na DRC, o que leva à oxidação de macromoléculas, danos aos tecidos e disfunção. Portanto, a geração excessiva de ERO tem sido diretamente ligada aos mecanismos e processos da doença associados ao início e progressão da DRC, incluindo proteinúria, hipertensão arterial e diabetes mellitus. Além disso, a associação entre estresse oxidativo e disfunção crônica e endotelial mantém e perpetua o círculo vicioso onde o dano renal crônico gera mais lesão renal e complicações sistêmicas da DRC, como disfunção cardiovascular. Evidências mostram que o estresse oxidativo já está presente mesmo nos estágios iniciais da DRC com o aumento da produção de NADPH oxidase, especialmente a subunidade NOX-4 da NADPH. Foi demonstrado que partículas de lipoproteínas oxidadas, como proteínas carboniladas, se acumulam na DRC à medida que a disfunção renal progride³³. Assim, como nossos resultados mostram que o grupo HSF + γOz apresentou níveis reduzidos de proteína carbonilada e NOX-4 em comparação com o grupo HSF, podemos confirmar o efeito antioxidante do γOz.

As alterações metabólicas presentes nos grupos HSF são capazes de levar à inflamação renal e às vias de ativação do estresse oxidativo. No entanto, mesmo sem nenhum efeito de γOz, os animais tratados apresentaram redução da inflamação e do estresse oxidativo. Isto pode ser explicado pelo efeito do γOz na modulação do eixo RAGE/AGEs nos animais HSF + γOz. Os AGEs são produtos fluorescentes complexos e são formados através de diferentes vias envolvendo uma glicação direta seguida de rearranjos ou pela reação de espécies carbonílicas reativas (ECR), tais como glioxal, metilglioxal e 3-deoxiglucosona, que são formadas através de vias de degradação de açúcares. Com base no mecanismo de formação de AGEs, podemos considerar que no presente modelo animal, os AGEs são formados pelo aumento de açúcares presentes na dieta, levando a uma glicação proteica direta e, em seguida, produtos fluorescentes por reações de rearranjo. Os AGEs induzem estresse oxidativo por meio da ativação de RAGE, como demonstrado aqui pela regulação positiva de NOX-4, que sustenta ainda mais a formação de AGEs ao formar espécies ECR, reduzindo a oxidação de açúcar. O estresse oxidativo também promove a carbonilação de proteínas e a formação de produtos finais da lipoxidação avançada (ALEs), que resultam de uma oxidação direta ou por ECR da peroxidação lipídica, como 4-hidroxinonenal (HNE), MDA, e acroleína³⁴. Os eventos acima mencionados foram confirmados no estudo e, em particular, descobrimos que o aumento da expressão de RAGE e NOX-4 no rim foi acompanhado por um aumento da carbonilação de proteínas.

Constatou-se que os AGEs foram reduzidos na urina de animais HSF em comparação com os animais controle, e isso pode ser explicado considerando-se uma excreção reduzida desses adutos de proteína. O mecanismo que explica esta redução está sendo avaliado, e uma explicação poderia ser que os AGEs estão presos por RAGE cujo conteúdo aumentou no rim de animais HSF, reduzindo assim o conteúdo urinário dos AGEs. Assim, em animais HSF o eixo RAGE/AGEs é ativado levando a uma resposta de estresse oxidativo, o que promove uma condição inflamatória como observado ao encontrar um aumento de IL-6, TNF-α, e MCP-1. Descobriu-se que o γOz reduz significativamente todos os eventos acima mencionados e em particular o eixo RAGE/AGEs ao aumentar a excreção urinária dos AGEs e reduzir a expressão RAGE, e o dano oxidativo, ao reduzir a oxidação de proteínas e finalmente a resposta anti-inflamatória³⁵. O presente artigo não indica por meio de quais mecanismos o γOz elicita tal mecanismo de proteção, mas pode ser especulado com base na literatura. Muito recentemente, Sobhy et al. (2020)¹⁵ descobriram que o orizanol inibe a glicação e a formação de AGEs por um efeito antiglicação direto e pela eliminação dos radicais livres gerados durante as reações de glicação. Além disso, a atividade antioxidante do γOz foi relatada em experimentos in vitro e in vivo por vários grupos^10,36,37.

Em resumo, este estudo descobriu que o grupo tratado com gama-orizanol apresentou níveis reduzidos de RAGE renal, inflamação e estresse oxidativo e aumento da excreção renal dos AGEs provavelmente devido ao efeito positivo na taxa de filtração glomerular. Assim, é possível concluir que o gama-orizanol foi eficaz na redução da inflamação e do estresse oxidativo no rim pela modulação do eixo RAGE/AGEs.

É importante relatar algumas limitações deste estudo. Somente AGEs ou RAGE gerais, e não específicos, foram analisados, mais marcadores de estresse oxidativo e inflamação poderiam ser incluídos nos parâmetros analisados, a análise imunohistoquímica para RAGE poderia ter sido realizada, assim como a análise histológica dos rins para demonstrar possíveis danos às estruturas.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Universitá degli Studi di Milano e o financiamento do estudo pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)- processos #2015/10626-0 e #2018/15294-3- e CAPES (PDSE- 88881.132505/2016-01).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Jun 2021
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2021

Histórico

• Recebido
  05 Jan 2021
• Aceito
  18 Abr 2021