Estudo das alterações relacionadas com a idade na pele humana, utilizando métodos de histo-morfometria e autofluorescência

Study of age-related changes in human skin using histomorphometric and autofluorescence approaches

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Estudo das alterações relacionadas com a idade na pele humana, utilizando métodos de histo-morfometria e autofluorescência^*

Study of age-related changes in human skin using histomorphometric and autofluorescence approaches^*

Reinaldo B. Oriá^I; Francisco Valdeci A. Ferreira^II; Érika N. Santana^III; Mariana R. Fernandes^III; Gerly A. C. Brito^I

^IDepartmento de Morfologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil

^IIDepartmento de Patologia e Medicina Legal, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil

^IIIEstudantes de Medicina da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: O processo de envelhecimento tecidual é evidente nas modificações visíveis na pele, resultando em importantes implicações psicológicas para o indivíduo e crescente interesse científico.

OBJETIVOS: O presente trabalho objetivou analisar as alterações da pele normal com o envelhecimento mediante estratégias de histomorfometria e autofluorescência.

MÉTODOS: Foram coletadas amostras de pele do abdômen de 18 cadáveres, incluindo cinco indivíduos jovens (menos de 20 anos), sete indivíduos com idade intermediária (20-60 anos) e seis indivíduos idosos (mais de 60 anos). Foram feitos cortes histológicos em parafina seguidos de coloração pela Hematoxilina-Eosina (H&E) e pelo tricrômio de Van Gieson-elastina. Avaliaram-se a espessura da epiderme e derme, e a superfície de contato epidermo-dérmica. Investigaram-se ainda as modificações qualitativas do aparelho colágeno-elástico, considerando sua disposição espacial na derme. Espécimes corados em H&E também foram utilizados para autofluorescência.

RESULTADOS: A espessura da epiderme e derme do grupo idoso foi significativamente diminuída (p<0,05) em relação aos demais grupos. Os grupos idoso e intermediário exibiram acentuada redução na superfície de contato epiderme-derme (p<0,05). Detectaram-se a perda da distribuição em rede das fibras elásticas com sua progressiva fragmentação, alterações da compactação do colágeno e espessamento da membrana basal com o envelhecimento.

CONCLUSÃO: O envelhecimento leva à redução da espessura da derme e epiderme, bem como ao aplanamento da junção dermo-epidérmica. As mudanças da pele ao longo da vida nem sempre seguem um perfil linear, mostrando drásticas alterações nas últimas décadas de vida. O método de autofluorescência mostrou-se um instrumento valioso no estudo da complexa relação espacial das fibras elásticas e colágenas.

Palavras-chave: derme; envelhecimento; envelhecimento da pele; epiderme; pele.

SUMMARY

BACKGROUND: Age-related changes are easily recognized by examining the skin and lead to important psychological implications, motivating increased scientific interest.

OBJECTIVES: This study aimed to analyze, by histomorphometric and autofluorescence approaches, the aged-related alterations in normal human skin.

METHODS: Normal abdominal skin samples were taken from eighteen cadavers, including five young subjects (below 20 years old), seven subjects with intermediate age (20-60 years old) and six elderly subjects (over 60 years old). Paraffin-embedded sections were prepared and stained by Hematoxylin and Eosin (H&E) and Van Gieson-elastin trichrome. Afterwards, the H&E specimens were also used for autofluorescence technique.

RESULTS: The thickness of elderly epidermis and dermis was reduced compared to middle-aged and young age groups (p<0.05). The elderly and middle-aged groups also showed a marked reduction in the epidermal-dermal contact surface (p<0.05) in comparison to the young group. In addition, we detected a loss of the distribution in the elastic fiber network in the elderly with progressive fragmentation, as demonstrated by Weigert's stain for elastin and poor fluorescent contrast.

CONCLUSION: The thickness of the epidermis, dermis, and epidermal-dermal interface contact surface decreased in the aged skin. The changes throughout life in the normal skin did not follow a continuous linear profile, showing drastic alterations especially in the last decades. Autofluorescence approach proved to be an important additional tool for studying the complex relation-ship between the elastic and collagen fibers.

Key-words: dermis; aging; skin aging; epidermis; skin.

INTRODUÇÃO

Os tecidos gradualmente passam por mudanças de acordo com a idade, sendo que, na pele, essas alterações são mais facilmente reconhecidas.^1,2 Atrofia, enrugamento, ptose e lassidão representam os sinais mais aparentes de uma pele senil.^3-5

Mudanças nas características da pele humana durante o envelhecimento são freqüentemente determinadas por forças ambientais ou extrínsecas, tais como radiação ultravioleta,^6,7 assim como por fatores intrínsecos,^8-10 alguns deles relacionados com alterações no tecido conjuntivo da derme.^11-13 Alterações no tecido conjuntivo, que atua como alicerce estrutural para epiderme, delineiam essas mudanças na aparência externa, que são refletidas no estrato córneo.^14,15 As modificações do aparelho colágeno-elástico ao longo da vida estabelecem uma base morfológica substancial para compreender as adaptações bioquímicas e biomecânicas da pele com a idade.^16-19 A espessura da pele e suas propriedades viscoelásticas não dependem apenas da quantidade de material presente na derme, mas também de sua organização estrutural.^20,21

Para estudar os mecanismos envolvidos no envelhecimento, portanto, é necessário compreender melhor as mudanças estruturais e funcionais que ocorrem com o avançar da idade, distinguindo as alterações que possam representar um processo intrínseco daquelas que refletem efeitos patológicos cumulativos ou agressões ambientais externas.^22,23 Convém ainda considerar que, independente da idade do indivíduo, a espessura total da pele, espessura relativa da epiderme e derme, distribuição e fenótipo da população celular na derme, presença de anexos cutâneos e densidade da microvasculatura e de nervos variam conforme a região do corpo.^24-26

Exames histológicos e ultra-estruturais da pele, a partir de espécimes obtidos por autópsia, documentam importantes alterações estruturais na epiderme, junção epidermo-dérmica, derme e anexos epidérmicos. Com intuito de investigar as mudanças cronológicas da pele humana, foram utilizados métodos de microscopia de fluorescência, a partir de coloração por H&E e histomorfometria, possibilitando, dessa forma, retratar as modificações teciduais ao longo da vida, no que diz respeito a sua textura e conformação, relacionando com sua modelação biomecânica no espaço.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras de pele foram coletadas de 18 cadáveres, incluindo cinco indivíduos jovens (abaixo dos 20 anos), sete indivíduos com idade intermediária (20-60 anos) e seis indivíduos idosos (com mais de 60 anos). Usaram-se como critérios de inclusão pacientes de ambos os sexos, sem discriminação de raça, cuja causa da morte não incluíssem doenças que afetam diretamente a pele. Foram excluídos do trabalho os indivíduos com doença dermatológica ou sistêmicas ligadas diretamente a alterações cutâneas relatadas no prontuário. Amostras de pele medindo 1cm² foram colhidas da região abdominal, 2cm acima da cicatriz umbilical. Como indicado por Faria et al.²⁷ e Gonçalves,¹ a pele do abdômen é apropriada para o estudo das alterações causadas pelo processo de envelhecimento. Os espécimes foram obtidos durante o procedimento de autópsia realizado no Departamento de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará (UFC). O protocolo experimental foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário Walter Cantídio/UFC. As amostras de pele foram imediatamente fixadas em solução de formalina tamponada a 10% por 24h e embebidas em parafina. Foram realizadas secções de seis micrômetros de espessura dos blocos de parafina; em seguida, as peças foram hidratadas após a remoção da parafina, coradas e montadas em meio de Entelan nas lâminas histológicas. Todos os espécimes foram corados em H&E para posteriormente serem analisados pelo método de autofluo-rescência. O método de Hematoxilina-Eosina e o tricrômio de Van Gieson-elastina, como descritos por Kiernan,²⁸ foram escolhidos para estudar a morfologia da pele.

Os cortes histológicos de pele foram analisados utilizando um microscópio óptico binocular provido de ocular milimetrada (Leitz Wetzlar Germany Periplan, GF x10). Foram avaliadas a espessura da epiderme e derme, e a superfície de contato entre elas. A epiderme e a derme foram medidas em 10 diferentes locais em cada amostra: cinco medidas na papila e cinco nas cristas epidérmicas (Gráfico 1). A seguir, para cada corte foi calculada uma média das medidas da espessura da epiderme e da derme, utilizada então para obtenção da média de cada grupo. A estimativa da junção epidermo-dérmica foi analisada, medindo-se a extensão da superfície de contato, ao longo de 20mm de comprimento, pela disposição de linhas retas, seguindo tangencialmente as irregularidades da borda epitélio-conjuntiva. Estas medidas (espessura da epiderme, derme e estimativa da junção epidermo-dérmica) foram realizadas posicionando a ocular contendo uma reta milimetrada nas posições ilustradas na gráfico 1.

As fibras elásticas foram estudadas pela técnica de Van Gieson-elastina, fazendo-se então uma análise qualitativa do componente elástico reticular nas amostras de pele, considerando sua distribuição, disposição e integridade.

A autofluorescência foi realizada nos cortes corados em H&E da pele normal do abdômen, utilizando-se um microscópio de fluorescência da marca Leica, operando com luz transmitida. A fluorescência dos cortes corados em H&E foi examinada por excitação/emissão de luz ultravioleta e pelo uso de filtros de barreira 420/530 para fluorescência verde, selecionados por causa do aumento na qualidade da resolução, como descrito por Carvalho et al.²⁹

Análise Estatística

Os achados morfométricos foram avaliados utilizando o teste de análise de variância ANOVA, seguido pelo teste de Bonferroni. O valor de p<0,05 foi considerado de significância mínima para todas as análises estudadas.

RESULTADOS

Análise Histomorfométrica

No presente estudo detectou-se que a espessura da epiderme no grupo idoso (0,059 ± 0,006mm) foi estatisticamente inferior (p<0,05) à espessura da epiderme dos grupos jovem (0,094 ± 0,003mm) e intermediário (0,080 ± 0,006mm) (Gráfico 2A). De forma semelhante, a espessura da derme no grupo idoso (1,798 ± 0,306mm) foi estatisticamente inferior (p<0,05) à dos grupos jovem (2,716 ± 0,217mm) e intermediário (2,687 ± 0,112mm) (Gráfico 2B). Os grupos idoso (22 ± 0,6mm) e intermediário (30,2 ± 2mm) exibiram uma redução significativa (p<0,05) da superfície de contato epidermo-dérmica em comparação ao grupo jovem (41,4 ± 2,46mm) (Gráfico 3). Não houve diferença estatística entre os grupos jovem e intermediário nas medidas morfométricas, com exceção da avaliação da superficie de contato epidermo-dérmica.

Métodos de Coloração e Análise por Autofluorescência

Epiderme e Junção Epidermo-Dérmica

A avaliação qualitativa dos preparados histológicos demonstrou acentuada redução da espessura da epiderme na pele senil e ausência do arranjo compacto dos queratinócitos, especialmente ao longo dos estratos de Malpighi. Além disso, observaram-se um arranjo desorganizado e achatamento das células basais, com menor acúmulo de melanosomas e menor densidade de melanócitos no grupo senil (Figuras 1B e ^3B) quando comparado com o grupo jovem (Figuras 1A e ^3A) ou intermediário (dado não mostrado). Detectou-se ainda redução da sinuosidade do trajeto da epiderme ao longo do comprimento da superfície dérmica, ilustrado por uma disposição grosseiramente linear da junção epidermo-dérmica (Figuras 1B e 2B) quando comparado com o grupo jovem (Figuras 1A e 2A). A membrana basal apareceu mais bem definida na pele senil, conforme observação pelo acúmulo de fluorescência (^{Figura 3B} - seta).

Derme (aparelho colágeno-elástico)

Em toda extensão da derme do grupo senil foi detectada fragmentação acentuada das fibras elásticas coradas em negro pela coloração de fucsina-resorcina de Weigert (Figura 1B), em contraste com o aspecto contínuo das fibras elásticas dos espécimes do grupo jovem (Figura 1A). As fibras elásticas, nos preparados de pele do grupo dos idosos, apresentavam-se mais frouxamente dispersas e com uma diminuição no entrançamento em relação às fibras colágenas, conforme demonstração pelo contraste fluorescente diminuído (^{Figura 3B}). Além disso, ao longo das rasas papilas dérmicas, foi confirmada a deficiência do mecanismo de ancoragem em ângulo reto das fibras elásticas, ao longo do contorno em campânula do ápice papilar nos preparados dos indivíduos idosos (Figuras 1B e ^3B) em contraste com o arranjo das fibras elásticas dos espécimes do grupo jovem (Figura 1A). No grupo senil, os feixes colágenos estavam menos compactados e ondulados na região média da derme (Figuras 1B* e ^3B*), e o aparelho colágeno-elástico reticular mostrou-se mais susceptível à dispersão. Contudo, um arranjo mais compacto e espesso do aparelho colágeno pode ser visto na derme profunda do grupo senil, ilustrado pela crescente coloração acidofílica (Figura 2B). No grupo senil, a derme superficial exibiu redução em sua celularidade e extensão em alça da microvasculatura papilar, revelada pelo discreto declínio da fluorescência local (^{Figura 3B}).

DISCUSSÃO

O presente estudo documentou as alterações histológicas da pele de cadáveres durante o processo de envelhecimento, mediante estratégias de histomorfometria e autofluorescência. Observou-se redução significativa da espessura da epiderme e derme na pele de idosos, ilustrada pelos resultados histomorfométricos e análise qualitativa dos preparados corados por diversos métodos. Esse achado foi similar ao encontrado por outros autores.^30,31 É importante considerar que algumas alterações estruturais da pele são inerentes ao envelhecimento, enquanto outras estão relacionadas à exposição ao sol, influências ambientais, grau de nutrição ou alterações do estado de saúde, como doenças endócrinas. Cabe também levar em conta as diferenças relacionadas à região do corpo estudada, especialmente no que diz respeito à espessura da pele. Os resultados obtidos pelos autores, em relação à pele do abdômen no grupo jovem, foram semelhantes aos descritos por Shuster et al.³⁰ Esses autores, utilizando pele do antebraço, também detectaram diminuição na espessura da pele com o avançar da idade. Os resultados do presente trabalho mostram que a redução da espessura da epiderme e derme foi uma característica das últimas décadas de vida, evidência demonstrada pela ausência de diferença estatística entre os valores morfométricos na pele de indivíduos jovens e de idade intermediária. Achados semelhantes foram encontrados por Shuster et al.³⁰ para indivíduos do sexo feminino.

De forma diversa, o aplanamento da derme papilar parece ocorrer progressivamente ao longo da vida, conforme observação qualitativa dos preparados histológicos estudados neste trabalho (dados não mostrados para o grupo intermediário), bem como pela redução já estatisticamente significante entre os grupos jovem e intermediário, da estimativa da superfície epidermo-dérmica. O grupo dos indivíduos de idade intermediária e idosos apresentou redução acentuada da superfície de contato epidermo-dérmica em relação ao grupo dos jovens, o que significa que a pele de indivíduos jovens apresenta maior quantidade de papilas dérmicas, com saliências e reentrâncias, comparativamente à pele de indivíduos idosos e intermediários. Isso pode ser explicado, de acordo com Tsuji & Hamada,¹³ pela presença de um arranjo vertical de fibras nas papilas dérmicas que prendem a epiderme à derme dos indivíduos jovens, que é perdido nos idosos, fazendo com que a junção dermo-epidérmica se torne mais achatada e frágil. Essa alteração do arranjo das fibras elásticas foi claramente confirmada nos achados apresentados aqui, que mostram o desaparecimento do arranjo axial-vertical das fibras elásticas na derme dos indivíduos idosos, juntamente com acentuada e evidente fragmentação dessas fibras. Esses resultados foram similares ao de outros autores^20,31,32 que relataram um contínuo colapso das propriedades elásticas na pele senil, pela falha da disposição em um padrão reticular, apesar da maior compactação dessas fibras, vista particularmente na derme profunda. De acordo com Imayama & Braverman,³² o arranjo tridimensional do aparato elástico, analisado por microscopia eletrônica de varredura, exibe fibras elásticas mais fragmentadas e porosas com a idade, conseqüentemente comprometendo a elasticidade da pele normal. O processo de fragmentação das fibras elásticas e de redução da espessura da epiderme e derme foi acelerado nas últimas décadas de vida, fato que foi evidenciado pela ausência de diferença estatística entre os valores morfométricos na pele de indivíduos jovens e de idade intermediária. Entretanto, as forças biomecânicas envolvidas no aplanamento da derme papilar parecem atuar progressivamente ao longo da vida, tendo em vista o contínuo declínio da superfície de contato epidermo-dérmica.

A coloração por H&E associada à microscopia de fluorescência, como descrito por Carvalho et al.,²⁹ ajudaram a esclarecer a complexa disposição da rede elástica e sua relação espacial com o colágeno. O entrançamento dos ramos das fibras elásticas em torno dos feixes de colágeno visto na pele jovem, a partir da autofluorescência, corrobora esses dados, sugerindo que ambos os componentes fibrosos estão incluídos num único sistema biomecânico, atuando conjuntamente. A compactação aumentada do colágeno, observada na derme profunda, em relação ao nível médio da derme, poderia ser explicada pelo maior número de ligações intermoleculares cruzadas, interagindo ao longo da matriz colagênica^26,33,34 e, portanto, lentificando o turn over do colágeno nessa área, com o envelhecimento. Essa modificação durante a vida pode ser regionalmente específica. O padrão sinuoso dos feixes de colágeno parece ser mantido pela conexão com as fibras elásticas ao longo de suas concavidades;¹⁵ portanto, a aparência ondulada do colágeno poderia ser afetada pelo colapso do aparelho elástico através da derme reticular em função da idade, levando a uma predominante horizontalização, seguindo uma tendência linear.¹⁹ O comprometimento do colágeno superficial e intermediário e da estrutura do tecido elástico poderia contribuir, dessa forma, com os quadros de ptose e de enrugamento tão bem caracterizados na velhice. De acordo com dados anteriores,³⁵ no presente trabalho foi também identificado o aumento da autofluorescência na membrana basal epidermo-dérmica da pele senil, o que poderia ser explicado pelo crescente depósito de um componente fluorescente e pelo aumento de sua espessura total com a idade, o que reforça ainda mais a premissa do turn over deficiente do colágeno.³⁴

CONCLUSÃO

Utilizando técnicas morfométricas e análise qualitativas de preparados histológicos corados por diferentes métodos associados a técnicas de autofluorescência, o presente estudo mostrou: 1) redução significativa da espessura da epiderme e derme de indivíduos após os 60 anos de idade, sugerindo que esses parâmetros não decrescem de forma contínua, mas decrescem consideravelmente nas últimas décadas de vida; 2) redução progressiva da superfície de contato epiderme-derme ao longo da vida, associada à perda da distribuição em rede das fibras elásticas com sua progressiva fragmentação; 3) que a estratégia da autofluorescência, para análise das mudanças ultra-estruturais em relação ao envelhecimento, é importante ferramenta para o estudo detalhado da complexa disposição da rede elástica e sua relação espacial com o colágeno, mostrando redução do entrançamento dos ramos das fibras elásticas em torno dos feixes de colágeno, alterações regionalmente específicas da compactação e da disposição do colágeno e espessamento da membrana basal com o envelhecimento.

Recebido em 27.08.2002

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 01.04.2003

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*

Trabalho realizado no Departamento de Morfologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Nov 2003
• Data do Fascículo
  Ago 2003

Histórico

• Recebido
  27 Ago 2002
• Aceito
  01 Abr 2003