Uma montagem experimental para a medida de fluorescência

An experimental setup for fluorescence measurement

DESENVOLVIMENTO EM ENSINO DE FÍSICA

Uma montagem experimental para a medida de fluorescência

An experimental setup for fluorescence measurement

J.F. Pavoni^I,1; W.F.P. Neves-Junior^II; M.A. Spiropulos^I; D.B. de Araújo^I,III

^IDepartamento de Física, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil

^IIDepartamento de Radioterapia, Hospital Sírio Libanês, São Paulo, SP, Brasil

^IIIInstituto do Cérebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

RESUMO

Neste trabalho apresentamos um arranjo simples e bastante ilustrativo que utiliza materiais disponíveis em laboratórios de pesquisa e ensino de física para a medida da fluorescência. O fluorímetro proposto é composto basicamente por um sistema de iluminação duplo de leds, que excitam a amostra e produzem sua emissão. Em seguida, uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada de um monocromador e um chopper é utilizado para modular este sinal com uma frequência conhecida através de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em um monocromador que é responsável pela decomposição espectral, cujos componentes são detectados com um fotodiodo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é muito baixa, utiliza-se um amplificador lock-in para filtrai' esse sinal através do sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico. Este fluorímetro foi testado em uma amostra fluorescente de laranja de acridina e os resultados obtidos foram bastante semelhantes aos resultados esperados por um fluorímetro comercial.

Palavras-chave: fluorímetro, fluorescência, medida da fluorescência, espectroscopia de fluorescência.

ABSTRACT

In this work we present a simple and illustrative arrangement using materials available in research and teaching laboratories to measure fluorescence. The developed fluorimeter is basically composed of a dual LED lighting to excite the samples and produce their emission. Then, a converging lens focuses the emitted light in the entrance of a monochromator and a chopper is used to modulate this signal with a known frequency measured by an optical coupler. After that, the light enters the monochromator that is responsible for its spectral decomposition into components that are finally detected by an amplified photodiode. Since the intensity of the emitted light is very low, a lock-in amplifier is used for filtering this signal by the reference signal provided by the optical coupler. This fluorimeter was tested using an acridine orange fluorescence sample and the results were very similar to those expected by a commercial fluorimeter.

Keywords: fluorimeter, fluorescence, fluorescence measurement, fluorescence spectroscopy.

1. Introdução

A ciência tem desvendado a estrutura da matéria através do uso da radiação eletromagnética em técnicas espectroscópicas [1]. Essas técnicas analisam a radiação que é absorvida, emitida ou espalhada pela amostra de interesse. Os dados espectroscópicos são geralmente representados por um espectro, que é a representação gráfica da resposta de interesse em função do comprimento de onda e que são fornecidos por aparelhos chamados espectrómetros.

Os espectrómetros são amplamente utilizados em pesquisas físicas e diversos equipamentos comerciais estão disponíveis nos laboratórios de pesquisa e ensino. Eles podem apresentar diversos arranjos experimentais, mas em geral possuem três elementos básicos: uma fonte de radiação, um monocromador e um detector. A maior parte destes equipamentos comerciais são fechados e, a partir da colocação da amostra, fornecem diretamente o espectro desejado.

Neste trabalho propõem-se a construção de um espectrómetro de fluorescência ou simplesmente um fluorímetro [2], utilizando soluções baratas e/ou previamente disponíveis em laboratórios de ensino, para que seja usado em atividades experimentais de física moderna para ilustração de todos os passos envolvidos na aquisição do espectro de fluorescência.

A fluorescência é um fenómeno muito estudado, pois diversos processos e sistemas de interesse biológico envolvem moléculas que absorvem e emitem radiação na faixa do ultravioleta e visível do espectro. As medidas de fluorescência de macromoléculas fornecem informações sobre: conformação, sítios de ligação, interações com solventes, grau de flexibilidade, distâncias intermoleculares e coeficiente de difusão rotacional de macromoléculas.

Como o tempo característico envolvido no processo de fluorescência (da ordem de 10^-9 s) é comparável com eventos relacionados à interação com o meio circundante, esta técnica é particularmente atraente para o estudo de diversos fenômenos relacionados às propriedades biofísicas de moléculas biológicas. Além disso, por ser um método extremamente sensível, mesmo baixas concentrações de amostra podem ser estudadas, o que a torna uma técnica de grande interesse para estudos químicos e farmacêuticos.

2. Base teórica

Em temperatura ambiente, a maioria das moléculas está em seu nível vibracional e rotacional fundamental. Quando estas moléculas são irradiadas com fótons de frequências apropriadas, podem absorver energia e passar do estado fundamental para vários estados vibracionais do estado eletrônico excitado. Colisões com outras moléculas fazem com que a molécula excitada perca energia vibracional até alcançar o estado vibracional de menor energia dentro do estado excitado. Como esse estado é instável, as moléculas voltam imediatamente para qualquer nível vibracional do estado eletrônico fundamental emitindo um fóton neste processo, que carrega a energia fluorescente. Por existirem diversos níveis vibracionais no estado fundamental, os fótons emitidos possuem diferentes energias e consequentemente diferentes frequências. Analisando as intensidades emitidas nas diferentes frequências é possível se obter o espectro de emissão de fluorescência na espectroscopia de fluorescência [3,4].

Em geral, o fóton de emissão fluorescente carrega menos energia que o fóton de excitação, devido às possíveis perdas de energia nas transições dos estados vibracionais do estado eletrônico excitado, o que permite que os espectros de absorção e emissão sejam distinguidos. Cada molécula fluorescente possui um comprimento de onda de excitação e um comprimento de onda de emissão característico, sendo a distância entre eles chamada de deslocamento de Stokes (Fig. 1). O deslocamento de Stokes é fundamental para a detecção da fluorescência, especialmente em aplicações biológicas, uma vez que moléculas com grandes deslocamentos de Stokes tem fluorescência facilmente detectável, enquanto que a fluorescência de moléculas com pequenos deslocamentos de Stokes é de difícil detecção.

3. Montagem experimental

O esquema experimental idealizado para o fluorímetro a ser construído está ilustrado na Fig. 2. Toda a montagem é realizada sobre um trilho para alinhamento dos equipamentos. O fluorímetro é composto basicamente por um sistema de iluminação duplo de leds, que excitam a amostra e produzem sua emissão. Em seguida, uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada do monocromador e um chopper é utilizado para modular este sinal com uma frequência conhecida através de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em um monocromador, responsável pela decomposição espectral, cujos componentes são detectados com um fotodiodo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é muito baixa, o sinal detectado ao final do experimento é ruidoso. Assim, para melhoria dos resultados obtidos com a obtenção apenas da componente de luz emitida pela amostra, utilizamos um amplificador lock-in para filtrar esse sinal através do sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico.

3.1. Fonte de excitação da amostra e o sistema de iluminação

A fonte de excitação da amostra do sistema proposto é composta por dois leds azuis com espectro de emissão apresentado na Fig. 3, este espectro foi medido com o espectrómetro Hitachi, modelo F-7000. Estes dois leds foram comprados como sendo iguais, no entanto pequenas diferenças foram encontradas na medida de seus espectros de emissão.

O sistema de iluminação foi construído sobre uma base de acrílico em um suporte para posicionamento sobre o trilho ótico (Fig. 4). No centro desta base foi frezado um local para o encaixe de uma cubeta. Em distâncias iguais e em ambos os lados da cubeta, foram feitos dois suportes em nylon para a fixação dos leds azuis, estes suportes possuem altura regulável através de parafusos laterais na base de acrílico.

Os leds, já ligados aos fios para sua conexão com a fonte, foram colocados dentro de tubos pintados de preto, para condução da luz até a amostra, evitando que ela saísse lateralmente pelo tubo e atrapalhasse a detecção da fluorescência. A distância entre os leds e a cubeta também era ajustável por parafusos, que podem ser visualizados na Fig. 4, na parte superior dos suportes de nylon.

Esta geometria para iluminação da amostra foi idealizada, de maneira a maximizar e homogeneizar a excitação da amostra. Além disso, o arranjo perpendicular de excitação em relação à detecção da fluorescência deveria evitar a detecção direta de luz proveniente dos leds.

3.2. Convergência do feixe de emissão da amostra

Foi utilizada uma lente para convergir o feixe de emissão da amostra na entrada do monocromador, de modo a maximizar a intensidade de luz (Fig. 5). Utilizamos uma lente convergente com uma distância focal pequena (5 cm), de modo a diminuir distância necessária entre o ponto de emissão da amostra e a entrada do monocromador, minimizando a perda de luz no caminho ótico.

3.3. Modulação do sinal para detecção

Um importante artifício usado neste experimento, foi a modulação do feixe de luz emitida pela amostra com uma frequência conhecida. O sinal modulado foi amplificado e filtrado por um lock-in (Stanford Research Systems modelo SR530) com base no sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico, o que permitiu a diminuição da interferência de fontes de luz externas no sinal captado pelo detector.

Para a modulação foi construído um chopper, composto por um disco de alumínio fixo em um motor que produziria a sua rotação (Fig. 6a). Na parte inferior do chopper, através de uma haste, foi fixado um acoplador ótico. O esquema desse sinal pode ser visualizado na Fig. 6b. Para o chopper foi feita a conexão do motor com a fonte geradora e para o acoplador ótico, além da conexão com a fonte, foi feita uma saída direta com cabo coaxial para o lock-in.

A frequência utilizada no chopper foi regulada em 30Hz por limitações mecânicas do motor utilizado, esta foi a maior freqüência que era possível ser mantida estável por um bom intervalo de tempo, sem risco de danificar o motor. No entanto, idealmente, quanto maior a freqüência, menor a influência do ruído rosa (ou de l/f), e uma freqüência da ordem de 1 kHz seria suficiente para minimizar tal influência, desde que o amplificador lock-in utilizado consiga operar faixa. E importante também ressaltar que a freqüência de 60 Hz (e seus harmônicos, e.g.: 120 Hz) de oscilação da rede elétrica AC deve ser evitada para livrar o sinal de fontes de luz ambiente indesejadas.

3.4. Monocromador e a seleção dos comprimentos de onda de detecção

Na montagem experimental foi utilizado um monocromador comercial (Oriel, modelo 7240) para coletar a luz emitida pela amostra e fornecer como saída uma única linha espectral para construção do espectro de emissão da amostra (Fig. 7). As fendas utilizadas no monocromador foram construídas utilizando lâminas de barbear contrapostas, com uma abertura de aproximadamente 1 mm.

3.5. Sistema de detecção

O detector utilizado nesta montagem foi o OPT301 [5], um circuito integrado opto-eletrônico contendo um fotodiodo e um amplificador de transimpedância em um único chip isolado dieletricamente (Fig. 8a). Ele inclui um conversor corrente-tensão que proporciona na saída uma tensão proporcional à luz recebida. Além disso, o conversor é implementado com um amplificador operacional e, portanto, também amplifica o sinal, de modo a conseguir boa sensibilidade. Sendo assim, basta alimentar o dispositivo com duas tensões de polaridades oposta referentes à massa, para ter um completo sensor analógico de luminosidade (Fig. 8b). A combinação integrada de fotodiodo e amplificador de transimpedância em um único chip elimina os problemas frequentemente encontrados em circuitos discretos, tal como erros por corrente de fuga, ruído e picos de ganho devido à perda de capacitância.

A corrente do fotodiodo é proporcional à potência radiante ou fluxo (em watts) incidindo no fotodiodo. Para um comprimento de onda de 650 nm (luz vermelha) a capacidade de resposta do fotodiodo é aproximadamente 0,47 A/W. A capacidade de resposta para outros comprimentos de onda é mostrada em uma curva de performance típica (Fig. 8c).

O sistema de detecção utilizado no experimento foi montado colocando o detector OPT301 em uma caixa (Fig. 9). Sua alimentação foi feita com duas baterias de 9 V. Com isso foram evitadas flutuações da rede elétrica e consequentemente algum dano no detector. Também foi feita a ligação direta do detector com o lock-in utilizando novamente um cabo coaxial.

3.6. Filtragem e amplificação do sinal detectado

Como já foi dito, foi utilizado um amplificador lockin para a filtragem e amplificação do sinal detectado de emissão de fluorescência da amostra. Nesse experimento, devido à baixa intensidade de luz emitida pela amostra e a grande interferência de fontes de luz externas, que causam um grande ruído no sinal medido, a utilização de um lock-in é de essencial importância para a qualidade dos resultados obtidos.

3.7. Montagem do fluorímetro

A montagem total do experimento foi feita sobre uma bancada e em um laboratório que pudesse ser mantido escuro durante toda a realização da medida. Esta etapa inclui o alinhamento do sistema ótico e para isso alguns procedimentos foram realizados:

1º) Posicionamento dos componentes do sistema na mesma altura e em linha reta:

Para alinhar a posição vertical e lateral de cada uma das peças do sistema óptico foi ligado um laser e direcionamos seu feixe paralelamente ao eixo óptico do sistema, passando pela altura da excitação da amostra pelos leds. Feito isso, foram posicionados cada um dos componentes de maneira que o feixe de laser passasse por todos eles sem sofrer desvios. Ou seja, foram alinhados o chopper de maneira que o laser passasse exatamente pelo meio de uma das aberturas, a lente de maneira que o laser passasse pelo seu centro e o monocromador de maneira que o laser incidisse no meio da fenda de entrada.

2º) Focalização com a lente:

A lente foi posicionada de maneira que ficasse com seu foco na fenda de entrada do monocromador. Para isso, o laser foi desligado, o sistema de excitação da amostra foi ligado e, com o olho na fenda de saída do monocromador foi visualizada em que posição da lente podia-se enxergar uma maior intensidade de sinal. Note que para isso o monocromador dever estar regulado no comprimento de onda de mais alta intensidade de fluorescência da amostra. E também é necessário muito cuidado para não desalinhar a altura da lente, bem como sua posição lateral, ou seja, deve-se movê-la lentamente apenas no sentido longitudinal do sistema, até encontrar a posição ideal.

3º) Posicionamento do detector:

O posicionamento do detector é feito ao final do processo, para isso é ligado novamente o laser e o detector é posicionado encostado na fenda de saída do monocromador. Para encontrar a posição correta do detector, seu posicionamento é feito com ele ligado e conectado a um osciloscópio, até que encontre-se a indicação do sinal devido à intensidade do laser. Em seguida, o detector é conectado ao lock-in.

Na Fig. 10 temos uma visão geral de todo o experimento e a Fig. 11 apresenta em detalhes o sistema de iluminação, a lente, o chopper e a entrada do monocromador.

4. Seleção da amostra fluorescente

A escolha da amostra foi muito importante para o sucesso do experimento. Foi utilizada uma amostra com alta emissão uorescente e que tivesse seu espectro de absorção em uma região próxima a ao espectro de emissão dos leds.

A substância escolhida foi a laranja de acridina, cuja fórmula estrutural está indicada na Fig. 12. A presença de anéis benzênicos na sua estrutura comprova que a substância é fluorescente. O espectro de absorção e de fluorescência desta amostra foram medidos em um espectrómetro de fluorescência comercial (Hitachi, modelo F-7000) e os resultados obtidos estão indicados na Fig. 13, esta curva de fluorescência será utilizada como referência para a avaliação dos resultados obtidos com o fluorímetro montado.

Comparando os espectros de absorção da amostra e de emissão dos leds (Fig. 14) foi comprovado que essa substância pode ser utilizada para medida no fluorímetro proposto.

A preparação da solução de laranja de acridina é feita apenas pela sua diluição em água, a quantidade necessária da substância é muito pequena, basta encostar o bico de um pasteur no pó e depois colocá-lo na cubeta com água. A solução resultante fica praticamente incolor. E necessária atenção para não deixar a solução muito concentrada, pois isso causaria um efeito de filtro interno e toda luz fluorescente seria reabsorvida pela própria solução, deixando que a intensidade de fluorescência medida neste caso seja muito baixa.

5. Aquisição do espectro de fluorescência

Com o fluorímetro montado e alinhado, liga-se todos os componentes: leds, chopper, detector e lock-in e iniciase o processo de medida que consiste em variar o comprimento de onda de saída no monocromador e medir a intensidade de voltagem indicada pelo lock-in, com seu respectivo erro, que corresponde à oscilação no valor indicado. A curva de fluorescência da amostra foi levantada duas vezes para comprimentos de onda variando de 350 a 700 nm.

6. Resultados e discussão dos dados

A Fig. 15 apresenta as duas curvas de fluorescência levantadas utilizando o sistema desenvolvido e também a curva esperada obtida com o fluorímetro comercial. Em detalhe, visualiza-se uma foto da amostra sendo excitada com a luz azul e fluorescendo com a luz verde.

Pode-se notar pela Fig. 15 que os resultados obtidos concordam bastante com o resultado esperado. No entanto, comparando as curvas obtidas com a curva esperada notamos a presença de dois picos extras, um em torno de 450 nm e outro a 600 nm, que não fazem parte do espectro esperado da amostra.

O primeiro pico pode ser facilmente justificado, pois ocorre aproximadamente no pico da emissão dos leds utilizados para excitação e, sendo assim, corresponde à detecção de luz espalhada proveniente dos leds de excitação. Já o segundo pico, na faixa de 600 nm, pode ser explicado pelo fato do detector OPT301 ter uma sensibilidade variável com o comprimento de onda (ver Fig. 8c). Em virtude disso, pode-se aperfeiçoar a análise dos resultados aplicando uma correção de forma a eliminar a contribuição intrínseca da diferença de sensibilidade do detector para os diferentes comprimentos de onda do espectro.

Para fazer esta correção, foi extraída parte da curva de sensibilidade do detector (Fig. 8c) correspondente à faixa de comprimentos de onda de interesse. A curva obtida foi normalizada pelo seu valor máximo e invertida para a criação da curva de correção a ser aplicada aos resultados (Fig. 16). Com isso, multiplicando-se a curva de correção ponto a ponto à curva experimental obtida com nosso sistema, anula-se a influência da variação da sensibilidade do detector para os diferentes comprimentos de onda estudados.

O resultado corrigido para a medida 2, que foi a que apresentou um pico maior próximo ao comprimento de onda de 600 nm, são apresentados na Fig. 17. Podese notar, que após a correção, o resultado se aproxima ainda mais da curva esperada. No entanto, foi encontrada uma contribuição ainda maior devido ao pico proveniente da luz espalhada dos leds na amostra e cubeta. Essa contribuição poderia ser minimizada por meio de uso de filtros após a lente convergente, mas isso poderia também causar redução no sinal de fluorescência detectado. Outra alternativa seria o uso de um anteparo entre o sistema de iluminação e os demais componentes do fluorímetro, neste anteparo deveria existir uma abertura no eixo ótico do sistema para passagem apenas da luz resultante da fluorescência.

O segundo pico, devido à influência do detector na medida, foi corrigido. A curva ficou também mais estreita, sendo que a região posterior ao pico se aproximou da curva "real", o que era de se esperar, já que o detector é mais sensível na faixa do vermelho e infravermelho próximo que na faixa do azul, onde a curva se afastou da curva real.

A baixa resolução na seleção de comprimento de onda provavelmente foi a razão da maior largura do pico de uorescência em relação ao do espectro obtido com dispositivo comercial. Seria possível melhorar a resolução utilizando um monocromador de maior resolução e também uma fenda mais estreita, de modo a selecionar melhor o comprimento de onda a ser medido (estreitar a faixa de freqüência de saída).

Por tudo o que foi apresentado pode-se verificar que a medida da fluorescência da amostra foi feita de forma simples, obtendo resultados semelhantes ao de um fluorímetro comercial.

Uma característica importante do arranjo apresentado é que ele não se limita aos leds azuis de excitação, nem à laranja de acridina como substância fluorescente, o que amplia sua aplicação prática. Outros comprimentos de onda de excitação e outras substâncias também poderiam ser avaliados, como por exemplo, a excitação com leds vermelhos para medida da fluorescência de um extrato alcoólico de folhas verdes que contém clorofila.

O fluorímetro proposto também não se restringe apenas à medida do espectro de fluorescência, ele pode ser aplicado para estudo de outras características relacionadas ao processo de fluorescência. Dentre elas podemos destacar a supressão de fluorescência, bastándose apenas adicionar compostos supressores da fluorescência à solução estudada que alterem, por exemplo, a sua temperatura ou o seu pH. Além disso, pode-se avaliar também o efeito da concentração da substância fluorescente na solução analisada e seu papel de filtro interno da fluorescência.

7. Conclusões

Foi apresentado um arranjo simples para a medida do espectro de fluorescência de amostras utilizando materiais simples e/ou previamente disponíveis em laboratórios de física. Acredita-se que o entendimento do processo de medida é bem didático e ilustrativo beneficiando alunos de disciplinas experimentais de física moderna no entendimento do processo de espectroscopia.

Acredita-se que, além da visualização passo a passo da medida da fluorescência, esta montagem e análise dos dados também proporciona aos alunos experiências importantes como a correção dos resultados pela sensibilidade do detector, um conhecimento que pode ser aplicado em qualquer medida realizada experimentalmente e contribui bastante para a melhoria dos resultados obtidos, sendo assim uma vivência importante para os alunos.

Agradecimentos

Aos técnicos Eldereis de Paula, José Luiz Aziani, Nelson Nascimento Junior, Élcio Aparecido Navas Lourenço Rocha. Em especial ao professor Iouri Borissevitch pelo suporte na escolha das amostras e nas medidas de referência feitas em equipamentos comerciais.

Recebido em 14/4/2014

Aceito em 10/6/2014

Publicado em 3/10/2014

• [1] C. Raymond, Princípios Básicos de Espectroscopia (Editorial AC, Libros Científicos y Técnicos, Madrid, 1983), 1Ş ed.
• [2] J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy (Springer, Nova Iorque, 2006), 2Ş ed.
• [3] H.H. Jaffe and A.L. Miller, J. Chem. Educ. 43, 469 (1966).
• [4] P. Elumalai., P. Atkins and J. de Paula, Atkins' Physical Chemistry (Oxford University Press, Oxford, 2010), 9Ş ed.
• [5] Burr-Brown Corporation, OPT-SOl - Integrated Photodiode and Amplifier (Burr-Brown Corporation, Tucson, 1994).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Nov 2014
• Data do Fascículo
  Dez 2014

Histórico

• Aceito
  10 Jun 2014
• Recebido
  14 Abr 2014