Comportamento quimiometabólico do músculo sóleo na fase aguda da imobilização articular

Chemical metabolic behaviour of the soleus muscle during the acute phase of joint immobilisation

PESQUISA ORIGINAL ORIGINAL RESEARCH

Comportamento quimiometabólico do músculo sóleo na fase aguda da imobilização articular

Chemical metabolic behaviour of the soleus muscle during the acute phase of joint immobilisation

Luciano Júlio Chingui^I; Rommel Padovan Braquinho^I; Maria Theresa Munhoz Severi^I; Carlos Alberto da Silva^II

^IFisioterapeutas Ms.

^IIProf. Dr. do Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia da Unimep

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O objetivo foi avaliar o perfil fisiológico do músculo sóleo na fase aguda da imobilização articular na posição de 90o. Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos (n=6 cada): controle (C), imobilizado por 1 (Im1), 2 (Im2) e 3 dias (Im3). Após o período experimental, o músculo sóleo foi retirado e foram mensurados: o peso muscular, o índice de hidratação, a concentração de glicogênio e a concentração de DNA/proteínas totais. Os dados foram submetidos a análise estatística, com nível de significância fixado em p<0,05. No primeiro dia não houve alterações nas reservas glicogênicas, sendo observada redução progressiva das reservas: 53% no segundo dia e 65% no terceiro dia de imobilização. O peso muscular sofreu redução de 28,57% apenas no terceiro dia; o índice de hidratação aumentou 6,44% no segundo e 8,58% no terceiro dia. As concentrações de DNA tiveram elevação de 43,18% no primeiro dia, 59,09% no segundo e 75% no terceiro. Quanto à concentração de proteínas totais, houve elevação de 45,9% no primeiro dia, 32,25% no segundo e 58,95% no terceiro dia. Os resultados sugerem que a hipotrofia muscular é um processo desencadeado precocemente, envolvendo alterações quimiofisiológicas que são deflagradas na fase aguda da imobilização.

Descritores: Atrofia muscular; Imobilização; Músculo esquelético/metabolismo

ABSTRACT

The purpose of this study was to outline a physiological profile of the soleus muscle during the acute phase of joint immobilization at a 90º position. Male Wistar rats were divided into four groups (n=6): Control (C), immobilised for 1 (Im1), 2 (Im2), and 3 (Im3) days. After the experimental period, the soleus muscle was obtained in order to assess: glycogen content, muscle weight, hydration index, and protein-DNA interactions. Data were statistically analysed and significance level set at p<0.05. On the first day, no changes were observed on glycogen content, but progressive reduction was witnessed along the following days -53% on the second day and 65% on the third day of immobilization. Muscle weight suffered a reduction of 28.57% only on the third day, while hydration index increased 6.44% on the second day and 8.58% on the third day. Concentrations of DNA raised 43.18% on the first day, 59.09% on the second, and 75% on the third day. Protein concentrations also increased, reaching values of 45.9% on the first day, 32.25% on the second day, and 58.95% on the third day. These results suggest that muscular hypotrophy is an early-developing process, involving chemical-physiological alterations that are launched during the acute phase of immobilization.

Key words: Immobilisation; Muscle, skeletal/metabolism; Muscular atrophy

INTRODUÇÃO

A musculatura esquelética constitui um dos principais tecidos alvos da fisioterapêutica, uma vez que está envolvida com diversas afecções, em especial as ortopédicas. No âmbito da ortopedia, a imobilização é um recurso terapêutico eficiente e amplamente utilizado, mas que acarreta diversos efeitos indesejados, como o comprometimento da homeostasia das fibras musculares. A literatura científica mostra que, simultaneamente ao desuso, ocorrem alterações como hipotrofia muscular, fibrose intramuscular, redução da extensibilidade muscular, além de limitação de movimento articular¹.

Nesse contexto, tem-se caracterizado a hipotrofia como um processo específico em cada tipo de músculo². As fibras do tipo I têm menor capacidade de adaptação do que as fibras do tipo II, sendo conseqüentemente mais afetadas pelo desuso³. Isso é ratificado por Caiozzo et al.4, segundo os quais músculos cuja ação é antigravitacional têm maior grau de hipotrofia em situações de desuso. Kasper et al.⁵ observaram maior susceptibilidade à hipotrofia em fibras lentas oxidativas e Tanaka et al.⁶ observaram no músculo sóleo maior comprometimento em situação de desuso, por ser predominantemente formado por fibras do tipo I, ao passo que o extensor longo dos dedos, que tem predomínio de fibras do tipo II, é menos comprometido. Observou-se ainda que as fibras lentas em situação de desuso apresentam marcantes alterações histofisiológicas como irregularidades no retículo sarcoplasmático, fibrilas desintegradas, lesão mitocondrial, linhas Z estendidas, bem como condensação e fragmentação da cromatina nuclear e redução de sarcômeros em paralelo^5,7,8.

Alguns estudos vêm tentando elucidar as alterações metabólicas geradas pela imobilização. Assim, Hilder et al.⁹ em estudo realizado com suspensão de membros posteriores de ratos, demonstraram que a resistência à insulina acompanha o processo de atrofia muscular induzida pelo desuso em músculos esqueléticos de contração lenta, como o músculo sóleo. Simultaneamente, esses autores observaram uma redução na expressão de proteínas nos músculos hipotrofiados e a correlacionaram à degradação da proteína IRS-1; e, ainda observaram uma redução na atividade da Akt. Esses achados evidenciam uma redução na efetividade da sinalização insulínica.

Diversas pesquisas encontraram perdas de massa muscular em períodos de imobilização. Ohira et al.¹⁰ observaram em ratos a implantação rápida da hipotrofia em períodos de sete e dez dias de imobilização por suspensão, sendo evidenciado que, após o 10º dia, a perda de massa ocorre com menor velocidade.

Outros estudos indicam que longos períodos de imobilização promovem redução nas fibras musculares, merecendo destaque o estudo de Veldhuizen et al.¹¹, que verificaram, através de biópsia muscular, redução de 16% no diâmetro da fibra do músculo vasto lateral após quatro semanas de imobilização. Chakravarthy et al.¹² demonstraram uma significativa redução na massa do músculo sóleo e no potencial de proliferação das células satélites residentes após três semanas de imobilização.

Outros estudos, como os realizados por Ohira et al.¹⁰, Kano et al.¹³, Edgerton et al.¹⁴ e Morris et al.¹⁵, também observaram implantação da hipotrofia muscular em períodos de imobilização que variam de cinco dias a várias semanas.

Vale salientar que não há na literatura estudos direcionados à compreensão dos mecanismos fisiológicos deflagrados nos primeiros dias de imobilização, sendo esse considerado o período agudo do desuso.

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil metabólico do músculo sóleo na fase aguda da imobilização do tornozelo de ratos na posição de 90º, com foco no período que se estende do primeiro ao terceiro dia de desuso.

METODOLOGIA

Foram utilizados ratos albinos Wistar com 3 meses de idade, alimentados com ração (Purina^® para roedores) e água ad libitum, submetidos a ciclos de 12 h claro/escuro e distribuídos em quatro grupos experimentais com seis animais, a saber: controle (C) e imobilizados 1 dia (Im1), 2 dias (Im2) e 3 dias (Im3). O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da UFSCar.

Após anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p), a pata posterior esquerda dos animais foi imobilizada com o modelo de órtese de resina acrílica proposto por Silva et al.¹⁶.

Após a fase de imobilização, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o músculo sóleo (S) foi retirado e preparado para a determinação de reservas glicogênicas, peso seco, porcentagem de hidratação e concentrações de DNA e proteínas totais.

Para a determinação do glicogênio, as amostras dos músculos foram digeridas em KOH 30% a 100°C e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol a quente. Entre uma fase e outra da precipitação, a amostra foi centrifugada a 3.000 rpm durante 10 minutos. O glicogênio precipitado foi submetido à hidrólise ácida na presença de fenol, segundo a proposta de Siu et al.¹⁷, estando os valores expressos em mg/100mg de peso úmido.

Para a obtenção do índice de hidratação e do peso seco, imediatamente após a retirada do músculo, o mesmo foi pesado em balança semi-analítica e em seguida colocado em uma estufa a 60ºC. Subseqüentemente, o músculo foi pesado a cada 1 hora até permanecer com peso constante (em mg). Assim, pela diferença entre o peso inicial (peso úmido) e o peso final, foi determinado tanto o índice de hidratação muscular (em %) como o peso seco (em mg).

A determinação das proteínas totais foi realizada com kit laboratorial da marca BioDiagnóstica^®, e do DNA pela metodologia proposta por Giles e Myers¹⁸. Assim, para a determinação do DNA muscular foi preparado inicialmente o homogenato composto por 100 mg de músculo e 1 ml de HclO₄, misturando-se em seguida o homogenato com solução de difenilamina e HclO₄, seguido de agitação e banho-maria a 30°C durante 12 horas; após esse período foi realizada leitura espectrofotométrica a 595 nm; os valores estão expressos em mg/100mg.

Os valores estão representados pelas médias ± erro padrão (média±ep). Na análise estatística foi utilizado o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, seguido da análise de variância ANOVA e teste de Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05).

RESULTADOS

Em relação às reservas glicogênicas (Gráfico 1), a imobilização não provocou alterações significativas nas primeira 24 horas, sendo observados os seguintes valores: C, 0,52±0,07 e Im1, 0,46±0,04 mg/100mg (p>0,05). Por outro lado, houve redução significativa progressiva no segundo e terceiro dias, de 53% no grupo imobilizado 2 dias (C, 0,52±0,07 e Im2, 0,24±0,06 mg/100mg, p<0,05) e 65% no grupo imobilizado 3 dias (C, 0,52±0,07 e Im3, 0,18±0,03 mg/100mg, p<0,05).

A avaliação do peso muscular revelou diferença significativa apenas no terceiro dia de desuso, quando foi observada redução de 28,57% (C, 35±2 e Im3, 25±1 mg, p<0,05 - Gráfico 2). O Gráfico 3 ilustra o índice de hidratação, observando-se aumento de 6,44% no segundo dia (C, 71,42±0,42 e Im2, 76,02±1%, p<0,05); de 8,58% no terceiro dia (C, 71,42±0,35 e Im3, 77,55±0,38%, p<0,05).

A avaliação das concentrações de DNA (Gráfico 4) mostra elevação de 43,18% (C, 0,044±0,0017 e Im1, 0,063±0,0061 mg/100mg, p<0,05) no primeiro dia; de 59,09% no segundo dia (C, 0,44±0,0017 e Im2, 0,070±0,0047 mg/100mg, p<0,05); e 75% no terceiro dia (C, 0,044±0,0017 e Im3, 0,077±0,011 mg/100mg, p<0,05).

Quanto ao conteúdo de proteínas totais, foi observada no primeiro dia elevação de 45,90% (C, 5,058±0,26 e Im1, 7,38±0,27 mg/100mg, p<0,05); de 32,25%, no segundo (C, 5,58±0,26 e Im2, 7,38±0,78 mg/100mg, p<0,05); e de 58,95% no terceiro dia (C, 5,058±0,26 e Im3, 8,04±0,7 mg/100mg, p<0,05), como mostra o Gráfico 5.

DISCUSSÃO

Desde a década de 1970, não se obtém um consenso frente às alterações histo-quimiofisiológicas induzidas pelo desuso muscular, sendo observados resultados contraditórios, que descrevem graus diferenciados de susceptibilidade à atrofia e relações funcionais diferenciadas de acordo com o tipo da fibra muscular e o local em que esta se encontra^19-22.

Alguns estudos sugeriram que as alterações mais evidentes da atrofia ocorrem nos dias iniciais do desuso, indicando a possibilidade de haver certa temporização nas alterações da homeostasia das fibras musculares quando submetidas à imobilização^23,24. Nesse sentido, entende-se que os maiores comprometimentos homeostásicos ocorram na fase inicial do desuso, de modo que, à medida que a situação de desuso torna-se crônica, o declínio das funções metabólicas ocorre de forma mais rápida²⁵, como evidenciado em trabalho recente²⁶.

No presente estudo iniciou-se avaliando o conteúdo glicogênico muscular, uma vez que esta reserva é marcadora tanto das condições energéticas quanto da condição de performance do músculo esquelético²⁷. Ao avaliar as reservas de glicogênio, observa-se que, no primeiro dia de desuso, não houve alteração significativa; mas na progressão da análise, observou-se redução no conteúdo, que foi intensificada no segundo e terceiro dias.

O músculo sóleo é composto por 84% de fibras tipo I. Por essa razão, a redução no conteúdo glicogênico pode dever-se ao fato de os músculos vermelhos apresentarem uma maior população de receptores de insulina; dessa maneira, esse trabalho ratifica estudos que sugerem que, entre a terceira e oitava hora após a imobilização, já há significante redução na população dos receptores insulínicos, comprometendo a cascata sinalizadora da insulina, principalmente no que se refere às vias citosólicas ligadas à síntese de glicogênio, predispondo ao quadro de resistência à insulina e concomitante redução nas reservas glicogênicas^28-30.

Quanto ao comportamento do peso muscular, foi observado que somente no terceiro dia de imobilização o peso mostrou-se reduzido, fato que pode ter relações com a redução na síntese proteica simultânea à elevação na proteólise^26,31-33.

Optou-se por também avaliar o índice de hidratação, sendo verificado que no segundo e terceiro dia da imobilização a hidratação foi significativamente maior. Esse aumento da hidratação pode ser reflexo da liberação local de substâncias vasoativas na tentativa de melhorar a perfusão tecidual e assim modificar o padrão de oferecimento de substratos ou oxigênio³⁴. Assim, a redução no peso observado no terceiro dia de desuso é resultante de um processo de proteólise que ocorre simultaneamente à elevação no índice de hidratação.

Após evidenciar a perda de massa muscular, avaliou-se a concentração de DNA e proteína total, sendo observado que os músculos apresentaram elevação progressiva nas concentrações. Alguns pontos a esse respeito merecem destaque, como por exemplo o fato de que as medidas de proteína e DNA têm sido muito utilizadas em diferentes estudos para indicar tamanho e número de células em um tecido³⁵.

O desenvolvimento de hipotrofia observado nos resultados tem relação direta com o balanço entre a taxa de síntese e degradação das proteínas³⁶. Por outro lado, por haver elevação no índice de hidratação, é sugestivo o fato de neste estudo ter se verificado comprometimento de outros sistemas ativados, concomitante à elevação na permeabilidade capilar, como por exemplo a elevação no extravasamento de proteínas plasmáticas. Levanta-se aqui uma hipótese explicativa. De acordo com observações de Durigan³⁷, o modelo de órtese aqui utilizado geraria redução na deambulação logo no primeiro dia do desuso. Assim, sincronicamente à imobilização também ocorre edema leve, contribuindo ainda mais para a redução na movimentação exploratória. Possivelmente, os resultados da mensuração da concentração de DNA e proteínas totais podem representar um somatório do conteúdo pertencente às fibras musculares in situ e do proveniente de outros fatores decorrentes do maior índice de hidratação, como um possível infiltrado de células do sistema imunológico e/ou de outras estruturas.

CONCLUSÃO

Durante a imobilização, uma diversidade de fatores compromete a homeostasia do tecido muscular desencadeando hipotrofia. Tais fatores são ativados logo nos primeiros três dias do desuso.

Apresentação set. 2007

Aceito para publicação jun. 2008

Este estudo contou com apoio financeiro da Capes - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

Estudo desenvolvido no Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia da Unimep - Universidade Metodista de Piracicaba, Piracicaba, SP, Brasil

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Maio 2012
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  Jun 2008
• Recebido
  Set 2007