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Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia

Print version ISSN 0004-2730

Arq Bras Endocrinol Metab vol.46 no.2 São Paulo Apr. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S0004-27302002000200009 

artigo original


Desenvolvimento e Validação de Um Método Imunofluorométrico Para a Pesquisa de Anticorpos Antiperoxidase Tiroidiana no Soro

 

Teresa S. Kasamatsu
Rui M.B. Maciel
José Gilberto H. Vieira

Laboratório de Hormônios,
Disciplina de Endocrinologia,
Universidade Federal de São Paulo /
Escola Paulista de Medicina,

UNIFESP/PM, São Paulo, SP.

Recebido em 15/08/01
Revisado em 03/12/01
Aceito em 09/01/02

 

 

RESUMO

Desenvolvemos um ensaio onde TPO altamente purificada, obtida a partir de tecido humano, é adsorvida em poços de placas de microtitulação; após incubação com os soros a serem estudados, a revelação da presença de anticorpos específicos é feita com o emprego de anticorpo monoclonal anti-IgG humana marcado com európio. A sensibilidade do teste é da ordem de 0,6U/mL, e as características de reprodutibilidade bastante aceitáveis. Foram analisadas amostras de soro de 188 indivíduos normais de ambos os sexos (74 com >65 anos), de 54 pacientes com doença de Graves (DG) e de 13 com tiroidite de Hashimoto (TH). O método foi comparado, com base em 97 amostras, com um RIE comercial, encontrando-se alta concordância com índice kappa de 0,959. O estudo do valor de corte para definir a presença de anticorpos anti-TPO em níveis significativos baseou-se na curva ROC, e foi fixado em 10U/mL. A freqüência de anti-TPO positivo na população normal foi de 9,6% em indivíduos até 64 anos e de 16,5% nos com >65 anos; nos pacientes com DG 85,2% apresentaram anti-TPO positivo, sendo 100% nos pacientes com TH. O ensaio descrito mostrou-se sensível e específico e de fácil execução para a detecção de autoanticorpos contra a peroxidase tiroidiana presentes na maioria dos indivíduos com doença auto-imune tiroidiana. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/2:167-173)

Descritores: Anticorpos antitiroidianos; Anticorpos antiperoxidase tiroidiana; Anticorpos antitiroglobulina; Doenças auto-imunes da tiróide

 

ABSTRACT

Development and Validation of an Immunofluorometric Assay for Serum Thyroid Anti-Peroxydase Antibodies.
We developed an assay in which highly purified human TPO is adsorbed to microtiter plate wells; after incubation with the study serum samples, presence of specific antibodies is revealed by a monoclonal europium-labeled antibody against human IgG. The sensitivity of the test is 0.6U/mL, and the reproducibility quite acceptable. We analyzed serum samples from: 188 normal subjects of both sexes, 74 of whom >65 years of age; 54 patients with Graves' disease (GD) and 13 with Hashimoto thyroiditis (HT). Based on 97 routine samples, the method was compared to a commercial RIA, and a high concordance was found, with a kappa index of 0.959. The definition of a cut-off value for the presence of anti-TPO antibodies was based on a ROC curve and was set at 10U/mL. Positive anti-TPO values were found in 9.6% of the normal subjects up to 64 years of age, and in 16.5% of those >65 years. Patients with GD presented 85.2% of positivity, and those with HT showed 100% positivity. Thus, we described a sensitive and specific easy to perform assay, for detection of autoantibodies against thyroid peroxidase in patients with thyroid autoimmune diseases. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/2:167-173)

Keywords: Anti-thyroid antibodies; Anti-thyroperoxidase antibodies; Anti-thyroglobulin antibodies; Autoimune thyroid diseases

 

 

DESDE A PUBLICAÇÃO DE ROIT E COL. (1) relatando a presença de anticorpos circulantes contra antígenos tiroidianos em pacientes com doenças auto-imunes da tiróide, muita atenção tem sido dada ao tema, em função de sua potencial importância diagnóstica. Tal observação adquire valor na medida em que auto-anticorpos contra antígenos tiroidianos podem ser encontrados em cerca de 2% da população feminina caucasiana (2), e sua detecção pode ser útil como marcador da presença de doença auto-imune tiroidiana, corroborando o diagnóstico clínico. Os anticorpos contra antígenos tiroidianos inicialmente estudados eram de dois tipos: os dirigidos contra a tiroglobulina e os dirigidos contra o chamado antígeno microssomal. Estes últimos considerados ativos na patogênese da doença auto-imune tiroidiana em função de seu potencial em causar dano celular (3). Estudos bioquímicos, imunológicos e moleculares mostraram que o principal componente antigênico da fração microssomal tiroidiana é a enzima tiroperoxidase (TPO) (4-7), uma das enzimas responsáveis pela síntese dos hormônios tiroidianos.

A TPO é uma glicoproteína localizada na borda apical das células foliculares da tiróide, contém um sítio ativo heme, e está envolvida na biossíntese dos hormônios tiroidianos. Ela tem atividade catalítica, sendo responsável pela iodação e acoplamento dos resíduos de tirosina da molécula da tiroglobulina, dando origem aos hormônios tiroidianos (8). A clonagem da TPO humana revelou que a molécula corresponde a uma proteína de 933 aminoácidos, sendo que 845 resíduos correspondem à porção extracelular; foi identificada também uma segunda forma, TPO-2, onde ocorre uma deleção de 57 aminoácidos codificados no exon 10 (6).

Anticorpos contra TPO encontrados no soro de pacientes com doença tiroidiana auto-imune são policlonais, predominantemente das subclasses IgG1 e IgG4, e reconhecem epítopos conformacionais da molécula (9). A presença de anticorpos anti-TPO da subclasse IgG2 só foi descrita em alguns pacientes, e anticorpos IgG3 são praticamente indetectáveis (10). A imunoglobulina IgG1 está relacionada a propriedades citotóxicas e fixadoras de complemento, dados que sugerem que os anticorpos anti-TPO, além de serem um marcador da doença, podem estar envolvidos na própria indução da disfunção tiroidiana in vivo (11).

O desenvolvimento dos conhecimentos sobre a estrutura do "antígeno microssomal", bem como sobre o papel dos anticorpos endógenos a ele dirigidos, levaram ao desenvolvimento concomitante de melhores técnicas para a pesquisa de sua presença, e conseqüente uso como teste laboratorial auxiliar na definição da presença de doenças auto-imunes tiroidianas. Testes baseados em imunofluorescência e hemaglutinação passiva foram os primeiros a serem desenvolvidos, seguidos das técnicas de radioimunoensaio e de ensaios imunoenzimáticos (12,13). A melhor definição do antígeno a ser estudado mostrou que as limitações de sensibilidade e especificidade, encontradas nos primeiros métodos, muitas vezes eram dependentes da presença, nas preparações de microssoma tiroidiano, de outros antígenos, em especial tiroglobulina (14). O desenvolvimento de métodos mais sofisticados de purificação da enzima a partir de tiróide humana ou suína, e a disponibilidade de TPO recombinante, permitiram o desenvolvimento de ensaios mais específicos e de maior sensibilidade diagnóstica (15,16).

Neste trabalho descrevemos um método imunofluorométrico para a medida de anticorpos anti-TPO e sua comparação com um método comercial de referência. Adicionalmente comparamos os resultados obtidos com o ensaio para anticorpos anti-TPO com os obtidos com um ensaio para a pesquisa de anticorpos anti-tiroglobulina de mesmo desenho (17), objetivando o estudo comparativo das sensibilidades e especificidades diagnósticas dos dois testes.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Pacientes: incluiu 114 indivíduos adultos, normais, funcionários da UNIFESP ou doadores de sangue, sendo 40 do sexo masculino com média de idade de 29 anos (18 a 54 anos), e 74 do sexo feminino com média de idade de 33,4 anos (19 a 60 anos). Estudamos também 74 indivíduos seguidos no ambulatório de Geriatria da EPM/UNIFESP, todos com níveis de TSH normal, sendo 33 do sexo masculino, com média de idade de 78 anos (69 a 89 anos) e 46 do sexo feminino com média de idade de 76,6 anos (66 a 93 anos). Adicionalmente foram estudadas amostras de soro obtidas de 54 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de doença de Graves, sendo 12 do sexo masculino e 42 do sexo feminino, além de 13 pacientes do sexo feminino com diagnóstico clínico e laboratorial de tiroidite de Hashimoto. Estes pacientes são seguidos no Ambulatório de Doenças Tiroidianas da Disciplina de Endocrinologia da EPM/UNIFESP.

Amostras de Soro para Comparação de Métodos: Foram empregadas 97 amostras de soro (anônimas) da rotina diagnóstica do Laboratório Fleury, São Paulo, que tinham sido analisadas naquele laboratório quanto ao nível de anticorpos anti-TPO por método de radioimunoensaio (Dynotest, Bramhs GMBH, Berlim, Alemanha).

Ensaio para anticorpos anti-Tiroglobulina (anti-Tg): empregamos método imunofluorométrico por nós descrito anteriormente (17), que emprega tiroglobulina humana purificada em nosso laboratório a partir de tecido humano. A tiroglobulina purificada é adsorvida em placas de microtitulação Maxisorp (Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca), o soro é diluído 1/100 antes da dosagem, sendo o padrão de referência o 65/93 fornecido pelo National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Potters Bar, UK. A incubação do soro diluído com a tiroglobulina adsorvida é feita por 2 horas, seguida de lavagem e adição de solução contendo monoclonal anti-IgG humana marcado com európio. O monoclonal H1P1 foi produzido no Laboratório Fleury e apresenta reatividade cruzada com todas as subclasses de IgG humana. A marcação com európio utiliza reagentes fornecidos por Wallac Oy, Turku, Finlândia.

Ensaio para anticorpos anti-TPO: a técnica desenvolvida foi semelhante à descrita para a pesquisa de anticorpos anti-tiroglobulina. Numa primeira etapa tiroperoxidase humana altamente purificada e obtida a partir de tecido tiroidiano, fornecida por Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA, foi diluída em tampão carbonato-bicarbonato 0,06M, pH 9,6, e 0,2mL da solução, contendo 100ng do antígeno, foram pipetadas em cada poço da placa de microtitulação (NuncPolysorp). Após incubação de 16 a 18 horas a 4°C as placas foram lavadas e tratadas com solução contendo 0,5% de albumina bovina e 0, 05% de gamaglobulina bovina. O padrão de referência empregado foi o 66/387 fornecido pelo NIBSC, diluído para obtermos os pontos 3,9; 15,6; 62,5; 250, e 1000U/mL; amostras e controles são diluídos 1/100 em tampão Tris-HCl, e 0,1mL pipetados nos respectivos poços, acrescidos de 0,1mL de tampão contendo 1% de soro de camundongo. Após incubação de 2 horas a temperatura ambiente sob contínua agitação, as placas são lavadas e adiciona-se 0,2mL de diluição (1/3000 em relação à solução obtida na marcação) da anti-IgG humana marcada com európio em tampão Tris-HCl, com 0,5% de albumina bovina, 0,05% de gama globulina bovina e 1% de soro de camundongo. Após nova incubação, agora de 1 hora à temperatura ambiente e sob agitação, as placas são lavadas, adiciona-se 0,2mL de solução de leitura (Wallac), e procede-se à leitura da fluorescência em fluorômetro tempo-sincronizado (Wallac).

Métodos Estatísticos: com a finalidade de definir o valor de corte para positividade do teste, empregamos a curva ROC (Receiver Operation Characteristic Curve); no estudo dos grupos dois a dois empregamos o teste de Mann-Whitney para comparar as medianas; para comparação entre métodos empregamos a medida de concordância Kappa. Foi considerado como nível de rejeição da hipótese de nulidade o valor de 0,05 (5%).

 

RESULTADOS

Características do ensaio imunofluorométrico para detecção de anticorpos anti-TPO: o coeficiente de variação intra-ensaio, baseado no perfil de imprecisão, foi inferior a 7% entre os valores de 4 e 1000U/mL. O coeficiente de variação inter-ensaio foi de 22% para uma amostra com valor médio de 55U/mL, bem como para uma amostra com valor médio de 250U/mL (n = 8). A sensibilidade do método foi definida como a menor quantidade de anticorpos que pode ser diferenciada do ponto zero com erro inferior a 5%, e é da ordem de 0,6U/mL.

Resultados da comparação entre os métodos de radioimunoensaio (Dynotest) e imunofluorométrico para anticorpos anti-TPO: a comparação entre os dois métodos, baseado na determinação de 97 amostras em paralelo, mostrou concordância k = 0,959 (Kappa), sendo encontrada discordância em apenas dois casos, um onde o método em estudo era positivo e o radioimunoensaio negativo e outro com situação inversa.

Resultados da pesquisa dos anticorpos anti-TPO e anti-Tg nas populações estudadas e definição dos limites de normalidade com base em curvas ROC: a curva ROC foi utilizada para a definição do limite de normalidade para a pesquisa de anticorpos anti-Tg e anti-TPO. A construção das curvas baseou-se na especificidade diagnóstica (falso positivos) e sensibilidade diagnóstica (verdadeiros positivos). Para a definição foram considerados o grupo de indivíduos normais e o de indivíduos com doenças auto-imunes tiroidianas. As curvas estão representadas nas figuras 1 e 2, e a área sob a curva foi de 0,899 para os anticorpos anti-TPO e 0,684 para os anticorpos anti-Tg. O ponto de corte com melhor equilíbrio entre sensibilidade e especificidade diagnósticas foi de 10U/mL para a pesquisa de anticorpos anti-TPO e de 40U/mL para a pesquisa de anticorpos anti-Tg. Considerando estes limites de corte, no grupo de normais (n = 193), em 153 amostras (79,3%) os dois testes foram negativos, em 13 (6,7%) os dois foram positivos, em 18 (9,3%) apenas o teste anti-Tg foi positivo e em 9 amostras (4,7%) apenas o teste anti-TPO foi positivo. Nas 54 amostras de pacientes com doença de Graves, em 8 (14,8%) ambos os testes foram negativos, em 27 (50%) ambos foram positivos e em 19 (35,2%) apenas o teste anti-TPO foi positivo; neste grupo não foi observado nenhum caso de positividade somente para anti-Tg. Nas amostras de pacientes com tiroidite de Hashimoto (n = 13), 9 (69,2%) apresentaram positividade em ambos os testes, e em 4 (30,8%) apenas o teste anti-TPO foi positivo; também não foi observado nenhum caso de positividade somente para anti-Tg. Na tabela 1 estão representados os valores das medianas, médias e desvios padrões para os três grupos estudados; o estudo estatístico mostrou que o grupo normal apresenta valores significativamente mais baixos que os dois grupos de pacientes com doenças auto-imunes tiroidianas, para ambos os métodos (p < 0,05). Já o estudo dos valores obtidos nos dois grupos de patologias mostrou que não são diferentes nem quanto aos valores de anti-Tg (p = 0,212), nem para os valores de anti-TPO (p = 0,849).

 

 

 

 

Distribuição de anticorpos anti-tiroidianos com a idade: separando os indivíduos normais em dois grupos, um até 64 anos de idade e outro com 65 anos ou mais, observamos que a freqüência de anti-TPO foi de 9,6% no primeiro grupo e de 16,5% no segundo grupo (p < 0,05). Já a freqüência de anticorpos anti-Tg foi de 8,8% e 25,3%, respectivamente (p < 0,05).

 

DISCUSSÃO

O método aqui descrito apresenta níveis de sensibilidade analítica e características de precisão semelhantes aos dos melhores métodos descritos na literatura (16,18). Além disso, sua comparação com método comercial considerado de referência mostrou alta correlação de resultados, sendo que apenas dois soros (2,1%) apresentaram resultados discordantes. A definição dos valores de corte para os dois métodos estudados baseou-se no uso da curva ROC, método que permite maior equilíbrio entre sensibilidade e especificidade diagnósticas (19,20). Analisando a população normal como um todo, com a aplicação dos valores calculados (10U/L para anti-TPO e 40U/L para anti-Tg) encontramos uma incidência de testes considerados positivos em 11,3% para anti-TPO e 16% para anti-Tg. Estes valores são superiores quando comparados a outros publicados com o emprego de métodos de radioimunoensaio e imunoenzimaensaio, que mostraram valores entre 7 e 8,5% para anti-TPO e 3,4% para anti-Tg (18,21,22). A explicação para esta diferença pode residir não só na população estudada, que, no nosso caso, incluiu uma porcentagem significativa de pacientes idosos, como nas diferenças metodológicas relativas à sensibilidade analítica dos métodos e definição de valor de corte. De fato, a maioria dos soros considerados positivos na nossa população normal apresentava valores pouco elevados. Quanto ao encontro de maior incidência de soros positivos em população geriátrica, este foi um achado esperado, desde que é conhecida a maior prevalência de resultados positivos nessa população (23).

Quando analisamos os resultados encontrados na população com doenças auto-imunes da tiróide, encontramos, com a aplicação dos limites definidos pela curva ROC, para anticorpos anti-Tg, 50% de positividade em pacientes com doença de Graves, e 69% em pacientes com tiroidite de Hashimoto. Já os resultados com o teste para anticorpos anti-TPO foram de 85 e 100%, respectivamente, dados semelhantes aos recentemente descritos na literatura (16,18,24). Esta diferença significativa em termos de sensibilidade e especificidade diagnósticas entre os dois testes vem de encontro a dados já publicados (25), mas contradiz conclusão de trabalho anterior de nosso grupo (26). Tal discrepância pode ser imputada ao uso, naquela ocasião, de ensaio baseado em hemaglutinação para a pesquisa de anticorpos anti-microssomais; o emprego de ensaio mais sensível e específico, como o empregado no presente trabalho, modificou as conclusões. Acreditamos que os dados aqui apresentados, associados aos já publicados na literatura, são conclusivos quanto à não necessidade de pesquisa dos dois anticorpos anti-tiróide, bastando a pesquisa de anticorpos anti-TPO desde que realizada utilizando técnica de alta sensibilidade e especificidade.

Em conclusão, neste trabalho apresentamos os dados obtidos no desenvolvimento e caracterização de método sensível e específico para a pesquisa de anticorpos anti-TPO, de fácil execução, com a utilização de quantidades mínimas de antígeno altamente purificado. Empregamos a curva ROC para definir o limite de corte, e a aplicação do teste em população normal e portadora de doenças auto-imunes da tiróide mostrou alta especificidade e sensibilidade diagnóstica. Como já descrito na literatura encontramos incidência maior de anticorpos antitiroidianos em população geriátrica, e comprovamos que a adição de pesquisa de anticorpos anti-tiroglobulina não traz nenhum ganho em termos de sensibilidade diagnóstica.

 

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Endereço para correspondência:

Teresa Sayoko Kasamatsu
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