Comparação de métodos de isolamento de bactérias NAD-dependentes do trato respiratório superior de suínos sadios

Methods to isolate NAD-dependent bacteria from the upper respiratory tract of health pigs

Resumos

Secreções nasais, tonsilares e tecido tonsilar foram coletados de 67 leitões de 9 a 15 semanas de idade, provenientes de três rebanhos positivos para Actinobacillus pleuropneumoniae (App), e de 50 leitões provenientes de dois rebanhos negativos. Foram classificados como positivos aqueles rebanhos com isolamento prévio de sorotipos 3, 5 e 7 e rebanhos negativos aqueles submetidos a controle veterinário, sem notificação de sintomas clínicos, lesões de pleuropneumonia suína e sem isolamento do agente. O material coletado foi submetido a três diferentes métodos de cultivo: 1- semeadura direta em meio de cultivo sólido seletivo; 2- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em meio de cultivo sólido seletivo; 3- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em ágar sangue. Entre as amostras NAD-dependentes recuperadas 86 foram classificadas como App, 13 como grupo minor e 21 como grupo taxon (C, D, E e F). Dos rebanhos positivos foram recuperadas quatro amostras de App (sorotipos 3, 7 e 12) e 51 não sorotipificáveis. Dos rebanhos negativos foram recuperadas 31 amostras de App não sorotipificáveis, indicando que o App faz parte da flora normal do trato respiratório superior dos suínos. O melhor método de isolamento de amostras NAD-dependentes de leitões portadores foi da biópsia de tecido tonsilar semeado diretamente em meio sólido seletivo (PPLO ágar adicionado de 2mi g de cristal violeta, 10mi g NAD, 1mi g de lincomicina, 1,4mi g de bacitracina por ml).

Suíno; Actinobacillus pleuropneumoniae; pleuropneumonia

Nasal and tonsil secretions and tonsil tissue were collected from 67 piglets (9-to-15 weeks old) from three positive herds and from 50 piglets from two negative herds. Positive herds were those in which an Actinobacillus pleuropneumoniae (App) strain of serotype 3, 5 or 7 was isolated and negative ones those in which there was no notification of clinical symptoms or lesions of swine pleuropneumoniae, no App isolation and the herd was under veterinarian control. The collected material was submitted to three different bacterial culture methods: 1- direct streak on solid selective medium, 2- dilution in selective broth followed by subculture in solid selective medium, and 3- dilution in selective broth medium followed by subculture in blood agar. Among the NAD-dependent strains recovered 86 were App, 13 belonged to the minor group and 21 to the Taxon group (C, D, E e F). From the positive herds four serotyped strains of App (sorotypes 3, 7 and 12) and 51 nonsorotipable strains were recovered. From the negative herds 31 nonsorotipable strains of App were recovered, indicating that App is a resident in the upper respiratory tract of pigs. The best method for recovering NAD-dependent strains from carrier piglets was achieved by direct culturing of tonsil tissue in solid selective medium (PPLO agar containing 2mu g of crystal violet, 10mu g of NAD, 1mu g of lincomycin, 1,4mu g of bacitracin per ml).

Swine; Actinobacillus pleuropneumoniae; pleuropneumonia

Comparação de métodos de isolamento de bactérias NAD-dependentes do trato respiratório superior de suínos sadios

(Methods to isolate NAD–dependent bacteria from the upper respiratory tract of health pigs)

J.D. Kich^1,2, I.A. Piffer^3,5, D.E.S.N. Barcellos^2,4, A.L. Guidoni³, C.S. Klein³, M.B.B. Fávero³, R. Vizotto³

¹Centro de Ciências Rurais – URCAMP

Av. Tupi Silveira, 2099

96400-110 - Bagé, RS

²Universidade Federal do Rio Grande do Sul

³ Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves - EMBRAPA, Concórdia, SC

⁴FFFCMPA, RS

⁵ Bolsista do CNPq

Recebido para publicação em 2 de agosto de 1999.

Projeto financiado pela EMBRAPA/CNPSA

RESUMO

Secreções nasais, tonsilares e tecido tonsilar foram coletados de 67 leitões de 9 a 15 semanas de idade, provenientes de três rebanhos positivos para Actinobacillus pleuropneumoniae (App), e de 50 leitões provenientes de dois rebanhos negativos. Foram classificados como positivos aqueles rebanhos com isolamento prévio de sorotipos 3, 5 e 7 e rebanhos negativos aqueles submetidos a controle veterinário, sem notificação de sintomas clínicos, lesões de pleuropneumonia suína e sem isolamento do agente. O material coletado foi submetido a três diferentes métodos de cultivo: 1- semeadura direta em meio de cultivo sólido seletivo; 2- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em meio de cultivo sólido seletivo; 3- diluição em caldo seletivo seguido de subsemeadura em ágar sangue. Entre as amostras NAD-dependentes recuperadas 86 foram classificadas como App, 13 como grupo minor e 21 como grupo taxon (C, D, E e F). Dos rebanhos positivos foram recuperadas quatro amostras de App (sorotipos 3, 7 e 12) e 51 não sorotipificáveis. Dos rebanhos negativos foram recuperadas 31 amostras de App não sorotipificáveis, indicando que o App faz parte da flora normal do trato respiratório superior dos suínos. O melhor método de isolamento de amostras NAD-dependentes de leitões portadores foi da biópsia de tecido tonsilar semeado diretamente em meio sólido seletivo (PPLO ágar adicionado de 2mg de cristal violeta, 10mg NAD, 1mg de lincomicina, 1,4mg de bacitracina por ml).

Palavras-chave: Suíno, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia

ABSTRACT

Nasal and tonsil secretions and tonsil tissue were collected from 67 piglets (9-to-15 weeks old) from three positive herds and from 50 piglets from two negative herds. Positive herds were those in which an Actinobacillus pleuropneumoniae (App) strain of serotype 3, 5 or 7 was isolated and negative ones those in which there was no notification of clinical symptoms or lesions of swine pleuropneumoniae, no App isolation and the herd was under veterinarian control. The collected material was submitted to three different bacterial culture methods: 1- direct streak on solid selective medium, 2- dilution in selective broth followed by subculture in solid selective medium, and 3- dilution in selective broth medium followed by subculture in blood agar. Among the NAD-dependent strains recovered 86 were App, 13 belonged to the minor group and 21 to the Taxon group (C, D, E e F). From the positive herds four serotyped strains of App (sorotypes 3, 7 and 12) and 51 nonsorotipable strains were recovered. From the negative herds 31 nonsorotipable strains of App were recovered, indicating that App is a resident in the upper respiratory tract of pigs. The best method for recovering NAD-dependent strains from carrier piglets was achieved by direct culturing of tonsil tissue in solid selective medium (PPLO agar containing 2m g of crystal violet, 10mg of NAD, 1mg of lincomycin, 1,4mg of bacitracin per ml).

Keywords: Swine, Actinobacillus pleuropneumoniae, pleuropneumonia

INTRODUÇÃO

São reconhecidos sete membros fator-V nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) dependentes da família Pasteurellaceae isoladas do trato respiratórbio superior dos suínos: Actinobacillus pleuropneumoniae (App) agente da pleuropneumonia suína (PS), Haemophilus parasuis, agente da doença de Glasser e Haemophilus taxon minor group, e taxons C, D, E e F. A PS é uma doença infecto-contagiosa que na forma aguda apresenta lesões fibrino-necro-hemorrágicas no pulmão e pleurite e na forma crônica, nódulos encapsulados no parênquima pulmonar e aderências de pleura adjacentes às áreas necróticas (Mores et al., 1984).

Baseados nas características de polissacarídeos capsulares, foram descritos para o App 12 sorotipos para o biovar 1 (NAD-dependentes), sendo que o sorotipo 5 apresenta dois subtipos 5A e 5B (Nicolet, 1971; Gunnarsson et al., 1977; Kilian et al., 1978; Rosendal & Boyd, 1982; Nielsen & O‘Connor, 1983; Nielsen, 1985a,b; Nielsen, 1986a, b). No Brasil foram identificados os sorotipos 5, 3, 1, 4, 7 e 9 (Piffer et al., 1987; Saito et al., 1988; Piffer et al., 1997).

O App pode ser encontrado em suínos de todas as idades, tanto em animais doentes quanto em portadores assintomáticos, dos quais o agente é recuperado da cavidade nasal (Kume et al., 1984) e das tonsilas (Sidibé et al., 1993). Os portadores assintomáticos se constituem na forma mais importante de manutenção da infecção no rebanho e de transmissão da doença entre rebanhos, dado o trânsito e comércio de animais (Rosendal & Mitchell, 1983).

O número de App é grande nas lesões agudas, sendo fácil o isolamento por meio da semeadura direta em placas de ágar sangue com estria perpendicular de colônia fornecedora de NAD (Biberstein et al., 1977). Nos casos crônicos o isolamento é geralmente negativo, e outras bactérias podem exercer um efeito inibidor sobre o crescimento do App. Melhores resultados de isolamento têm sido observados quando utilizadas técnicas de diluição e meios de cultivo seletivos, tanto de lesões crônicas como de secreções nasais ou do tecido tonsilar de animais infectados subclinicamente (Little & Harding, 1980; Pijoan et al., 1983; Kume et al., 1984; Sidibé et al., 1993).

O presente trabalho teve como objetivo testar diferentes formas de isolamento de amostras NAD-dependentes do trato superior de leitões sadios provenientes de rebanhos cronicamente infectados e rebanhos considerados livres dessa infecção.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 117 leitões entre 9 e 15 semanas de idade. Sessenta e sete leitões eram originados de três rebanhos onde já havia sido isolado o App, sem posterior repopulação do rebanho (positivos). Cinquenta leitões foram originados de dois rebanhos que estavam sob cuidados de um médico veterinário, sem diagnóstico ou suspeita de pleuropneumonia e sem registro de lesões suspeitas no abate.

De todos os leitões foram coletados, após anestesia dos animais, dois suabes nasais (local a), dois suabes tonsilares (local b) e um fragmento de tonsila (local c). A anestesia foi realizada com produto à base de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepan na dose de 0,4mg por quilograma de peso, por via intramuscular. Para a abordagem das tonsilas, o leitão foi suspenso e com auxílio de abridor de boca, abaixador de língua e iluminação de uma lanterna, as tonsilas foram localizadas no fundo da cavidade bucal. Após a realização dos suabes, foi introduzido o aparelho de biópsia e coletado 0,5cm³ do tecido tonsilar.

O material coletado foi submetido a três métodos de isolamento: 1) semeadura direta em meio de cultivo sólido descrito por Sidibé et al. (1993) e modificado com PPLO ágar contendo 2m g de cristal violeta/ml, 10mg NAD/ml, 1mg de lincomicina/ml e 1,4mg de bacitracina/ml (CVLB); 2) diluição em caldo BHI, adicionado de soro, extrato de levedura, NAD e antibióticos (Pijoan et al., 1983) em base 10 até 10^-5 e subsemeadura, no dia seguinte, no meio CVLB e 3) mesmas diluições anteriores com a subsemeadura em ágar sangue com estria de Staphylococcus aureus. Todos os cultivos foram incubados a 37^oC, numa atmosfera entre 5 a 10% de CO₂ por aproximadamente 18 horas.

Foram presuntivamente identificadas como NAD-dependentes aquelas colônias que apresentavam entre 1 e 2mm de diâmetro, com bordas regulares, translúcidas e iridiscentes. Colônias puntiformes também foram subcultivadas. A dependência do NAD foi determinada pela apresentação de satelitismo junto à estria do S. aureus, em placas de ágar sangue. As colônias NAD-dependentes foram submetidas à caracterização bioquímica e classificação das espécies, conforme métodos e tabelas descritas por Möller & Kilian (1990) e Gutierrez et al. (1993). As amostras caracterizadas como App foram submetidas à sorotipagem pelas técnicas de imunodifusão (Nicolet, 1971) e hemoaglutinação passiva (Mittal et al., 1983).

Os métodos e locais de isolamento foram comparados usando-se a análise de variância discreta do procedimento CATMOD do SAS (SAS, 1990).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A caracterização bioquímica das espécies NAD-dependentes da família Pasteurelaceae isoladas do sistema respiratório dos leitões é apresentada na Tab. 1. Das 120 amostras isoladas, 86 foram classificadas como App, 13 como grupo minor e 21 como pertencentes aos demais grupos taxon C, D, E e F, aqui agrupados como grupo taxon (Kilian et al., 1978; Möller & Killian, 1990; Gutierrez et al.,1993)

Entre as 86 amostras classificadas como App apenas 4/86 (4,65%) foram sorotipadas. Duas dessas amostras pertenciam ao sorotipo 3, uma ao sorotipo 7 e outra ao sorotipo 12. Esse é o primeiro registro de isolamento do sorotipo 12 no Brasil. As amostras sorotipadas foram isoladas em dois rebanhos positivos, enquanto que 31/82 (38%) das amostras não sorotipificáveis foram isoladas em rebanhos considerados negativos, indicando que o App é componente da flora normal do trato respiratório superior do suíno. Por conseguinte, esses dados não podem ser comparados diretamente com os resultados dos trabalhos que se referem ao isolamento de amostras de App de sorotipos conhecidos. Os sorotipos descritos na literatura, independente do grau de severidade, já foram relacionadas com patogenicidade. A patogenicidade dessas amostras não sorotipadas é desconhecida e necessita de estudos específicos.

Foram encontradas 14 amostras de App urease negativas, nenhuma sorotipificável. Embora o App seja classificado como urease positivo, Blanchard et al. (1993) e Piffer et al. (1997) registraram o isolamento de amostras de App sorotipificáveis não produtoras de urease

O App é considerado CAMP teste positivo (Biberstein et al., 1977), porém entre as amostras avaliadas por Gutierrez et al. (1993), 19,5% foram negativas, e das avaliadas por Piffer et al. (1997), 52,2% foram positivas. Por definição, o grupo minor (Biberstein et al., 1977) é CAMP teste negativo, porém, quando uma amostra padrão do grupo minor foi cultivada em meio de cultivo enriquecido (Rapp et al., 1985), apresentou reação fraca ao teste de CAMP. As diferenças de resultados a princípio podem ser explicadas pelo enriquecimento do meio de cultivo utilizado e também pela dificuldade prática de diferenciação de uma reação fraca de uma negativa.

Os resultados da fermentação de glicose (Tab. 1) concordam com as observações de Sirois & Higgins (1991), Möller & Kilian (1990) e Piffer et al. (1997) que constataram 100% de positividade para essa fermentação, porém diferem das de Gutierrez et al. (1993) que encontraram apenas 12,5% de amostras que fermentavam esse açúcar. Discrepâncias similares foram observadas com a lactose, rafinose, manitol, ribose, xilose, arabinose e trealose, demonstrando a complexidade em se usar esse critério na classificação das espécies desse gênero bacteriano. Isso levou ao estabelecimento da técnica de PCR (arbitrary primed polymerase chain reaction) para a identificação dessas amostras (Hennessy et al., 1993).

Na Tab. 2 estão sumariados os resultados de isolamento de amostras NAD-dependentes por método bacteriológico e local de isolamento. Na análise global desses resultados observa-se que a eficiência dos métodos de isolamento de amostras bacterianas NAD-dependentes dependeu do local de isolamento. Quando se utilizaram suabes de secreções nasais (local a) e tonsilares (local b) não houve diferenças entre os métodos de isolamento adotados. Porém, com a utilização de tecido tonsilar (local c), o método 1 foi significativamente superior aos métodos 2 e 3 (Tab. 2).

Quando analisadas as amostras classificadas como App separadamente (Fig. 1), observa-se uma distribuição similar àquela das amostras NAD-dependentes. O método de isolamento variou de acordo com o local examinado, e nesse caso também o tecido tonsilar semeado diretamente em meio seletivo sólido, enriquecido com NAD, possibilitou o isolamento de maior número de amostras.

O método 1 foi superior aos demais quando examinado o tecido tonsilar, e é mais simples no que diz respeito a processamento laboratorial, porém com coleta de material mais complexa. Não sendo possível a coleta do tecido tonsilar, a melhor alternativa seria coletar a secreção com suabe da superfície tonsilar (local b) e utilizar a diluição em LB e subcultivo posterior em CVLB (método 2). Observa-se que são os subcultivos que diferenciam os métodos 2 e 3 (no meio CVLB e no ágar sangue com estria de S. aureus fornecedora de NAD, respectivamente), e que o método 2 apresenta maior número de leitões com resultado positivo (P=0,054). Uma explicação poderia ser a limitação de NAD que é disponível em uma pequena superfície perto da estria da colônia fornecedora no método 3. No caso do cultivo em CVLB, essa disponibilidade abrange toda da superfície da placa.

CONCLUSÕES

O método mais eficaz de isolamento de amostras NAD-dependentes do trato respiratório superior de suínos portadores sadios foi o da biópsia de tecido tonsilar semeado diretamente em meio sólido seletivo. Amostras de App fazem parte da flora normal do trato respiratório superior dos suínos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Ago 2000
• Data do Fascículo
  Fev 2000

Histórico

• Recebido
  02 Ago 1999