Perfil fenotípico de linfócitos periféricos de bovinos de raças européias

Phenotypic profile of peripheral blood lymphocytes from European bovines

immunophenotyping; flow cytometry; vaccine; bovine babesiosis

imunofenotipagem; citometria de fluxo; vacina; babesiose bovina

COMUNICAÇÃO

Perfil fenotípico de linfócitos periféricos de bovinos de raças européias

Phenotypic profile of peripheral blood lymphocytes from European bovines

J.F.F. Bittar^I; M.F.B. Ribeiro^II; A.P.V. Marciano^III; J.H.P. Salcedo^IV; O.A. Martins-Filho^V

^IInstituto de Estudos Avançados em Veterinária da Universidade de Uberaba, Avenida Nenê Sabino, 1801, 38050-501 – Uberaba, MG

^IIDepartamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG, Belo Horizonte

^IIIBolsista de iniciação científica – CNPq - Centro de Pesquisa René Rachou

^IVDepartamento de Biotecnologia Aplicado à Agropecuária – UFV, Viçosa

^VLaboratório de Doenças de Chagas - Centro de Pesquisa René Rachou – Fundação Oswaldo Cruz

Palavras - chave: imunofenotipagem, citometria de fluxo, vacina, babesiose bovina

ABSTRACT

The phenotypic profile of bovine lymphocytes was evaluated in 18 bovines (Bos taurus) from three different breeds, being nine Holstein, six Hereford, and three Brown Swiss. All animals were free from ticks and hemoparasites, as determined after jugular vein blood sampling. The immunophenotypes of peripheral lymphocytes were evaluated by flow cytometry. Peripheral lymphocytes were exposed to bovine fluorescein-labeled monoclonal antibodies including anti-CD4, anti-CD8, and anti-purified bovine CD21 specificities. After lysing the erythrocytes with a commercial lysing solution (FACS^TM ), the lymphocytes were washed, fixed, and evaluated by flow cytometry. Significant differences in the phenotypic profiles of peripheral lymphocytes among all breeds were found. Holstein animals showed a lower percentage of total T lymphocytes (CD4 and CD8) and higher percentage of B lymphocytes (CD21). In addition, the lymphocytes from Holstein animals showed a lower T/B ratio than the lymphocytes from Hereford animals. These results suggest the existence of different phenotypic profiles of peripheral lymphocytes from European breeds of cattle. Such differences may be related to the different pattern of immune response described for these breeds in the literature and may account to varying disease resistance among breeds.

Keywords: immunophenotyping, flow cytometry, vaccine, bovine babesiosis

A babesiose bovina constitui um dos principais problemas sanitários dos rebanhos bovinos de carne e leite dos países de clima tropical e subtropical. Trabalhos foram desenvolvidos visando controlar a enfermidade por meio de métodos mais eficazes como a vacinação com subunidades do hemoparasito, com parasitos atenuados, com proteínas recombinantes ou com peptídeos sintéticos (Timms, 1989; Callow, Mellors, 1966; Taylor 1989; Reduker et al., 1989; Dalrymple, 1993; Palmer, McElwain, 1995). Entretanto, a produção de vacina para a babesiose bovina, encontra entraves referentes às dificuldades de testá-la experimentalmente. As babesias são espécies específicas e não se multiplicam dentro de hemácias de outros animais como camundongos, ratos ou outros animais de laboratório. Essa dificuldade faz com que as pesquisas necessitem de bovinos livres de hemoparasitoses e áreas livres de carrapatos, uma vez que esse ectoparasito é o principal vetor da doença.

Outro empecilho para o desenvolvimento de vacinas refere-se aos exames realizados para avaliar o grau de proteção imunológica que normalmente considera a resposta imune humoral. Segundo Wright et al. (1983) e Goodger et al. (1986), a imunidade protetora não está diretamente relacionada aos níveis de anticorpos porque os anticorpos totais são produzidos contra antígenos do parasita e contra antígenos do hospedeiro como resultado de resposta inflamatória. Portanto, para a avaliação da eficácia da vacina para a babesiose deveriam ser utilizados testes para a análise das respostas humoral e celular.

Outra dificuldade refere-se à origem dos bovinos. Os de origem européia (Bos taurus) são geneticamente mais susceptíveis à babesiose quando comparados aos de origem indiana (Bos indicus) (Francis, Little, 1964; Francis, 1996; Johnston et al., 1978; Bock et al., 1999), porém, em relação ao Bos taurus não há citações de qual raça seria mais susceptível.

Apesar de os testes vacinais serem feitos com bovinos puros e de uma mesma raça, os animais não são isogênicos e com isso as respostas não são uniformes. Provavelmente isso se deve à característica polimórfica dos genes que codificam as moléculas do major histocompatibility complex (MHC), os quais são de fundamental importância na apresentação de antígenos, na comunicação bioquímica entre as células do sistema imune e no reconhecimento de antígenos próprios e não próprios (Klein et al., 1993; Hughes, Yager, 1998; Freitas, 2001).

O presente trabalho objetivou avaliar o perfil fenotípico de linfócitos de bovinos de origem européia (Bos taurus) das raças Holandesa, Hereford e Pardo-Suíça, com o intuito de avaliar a existência de variações de CD4, CD8 e CD21.

Foram utilizados 18 animais, Bos taurus, com idades acima de cinco meses, livres de carrapatos e hemoparasitoses, sendo nove da raça Holandesa, seis da Hereford e três da Pardo-Suíça. Os animais recém-nascidos, após a ingestão do colostro, foram mantidos em isolamento. Amostras de sangue em EDTA foram colhidas por punção da veia jugular e mantidas à temperatura ambiente (TA) até a realização da imunofenotipagem. Os ensaios de citometria de fluxo para a imunofenotipagem dos linfócitos periféricos foram realizados conforme o protocolo desenvolvido especificamente para este estudo: em tubos de 5ml contendo 15ml de anticorpos monoclonais anti-CD4, anti-CD8 bovino marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e anticorpo anti-CD21 bovino purificado foram adicionados 30ml de sangue colhido em EDTA. Após incubação por 20 minutos à temperatura ambiente, acrescentaram-se 50ml do anticorpo secundário marcado com FITC ao tubo contendo anti-CD21 purificado. Após incubação, todas as preparações celulares foram submetidas à lise de eritrócitos, acrescentando-se 2ml de solução de lise¹. Os leucócitos totais foram lavados em PBS, fixados com 200ml de solução fixadora (paraformaldeído 1% em tampão cacodilato de sódio 10g/l, pH 7,2) e analisados no citômetro de fluxo² (Fig 1). Foram feitas análise de variância e comparação de médias pelo teste t de Student.

Os animais apresentaram diferentes perfis fenotípicos de linfócitos circulantes, de acordo com a raça (Tab.1) a qual pertenciam. Observou-se diferença entre as raças Holandesa e Hereford quanto à porcentagem de linfócitos T CD4⁺ e CD8⁺, entretanto, o mesmo não ocorreu quanto à porcentagem de linfócitos B CD21⁺. Os da raça Holandesa apresentaram menor porcentagem de linfócitos T totais (CD4⁺ e CD8⁺) e maior porcentagem de linfócitos B (CD21⁺) em relação aos da raça Hereford, bem como menor razão T/B (Fig. 2). Não foi observada diferença entre as raças quanto à razão TCD4⁺ e TCD8⁺ (Fig. 2).

Estes dados sugerem que o perfil fenotípico do sangue periférico dos bovinos europeus pode influenciar o padrão de imunidade clínica apresentado por eles. Assim, baixos níveis de linfócitos T (CD4 e CD8) e elevados níveis de linfócitos B em animais da raça Holandesa podem estar associados à sua susceptibilidade para infecções por Babesia, enquanto que elevados níveis de linfócitos T e baixos níveis de linfócitos B podem estar associados à maior resistência para infecções parasitárias. A elevada razão T/B pode estar associada à resistência dos animais Hereford à infecções por Babesia. Portanto, a existência de um perfil fenotípico diferencial de linfócitos circulantes em animais das raças Holandesa, Pardo-Suíça e Hereford deve ser considerada nos estudos da imunidade celular desencadeada por doenças infecto-parasitárias em bovinos, uma vez que essas diferenças podem ser relevantes para o padrão de resposta imune apresentado por esses animais.

Recebido para publicação em 12 de novembro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 3 de setembro de 2003

E-mail: [e-mail]

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1

FACS

^TM Lysing Solution

2

FACScalibur – BECTON DICKINSON

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jun 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Recebido
  12 Nov 2002
• Aceito
  03 Set 2003