Parâmetros hematológicos de frangos de corte alimentados com ração contendo aflatoxina B1 e fumonisina B1

Hematological parameters of broiler chicks fed rations containing aflatoxin B1 and fumonisin B1

Resumos

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da aflatoxina B1 (AFB1) e da fumonisina B1 (FB1) sobre o hemograma e o leucograma de frangos alimentados com ração contendo as toxinas isoladamente e em associação, nos níveis de 0, 50 e 200mig de AFB1/kg, e/ou 0, 50 e 200mg de FB1/kg. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x3, com 9 tratamentos e 12 repetições, totalizando 108 aves. Os frangos foram alimentados com as rações contaminadas do 8° até o 41° dia de vida. As aves de todos os grupos alimentados com micotoxinas apresentaram redução (P<0,05) nos valores de hematócrito, hemoglobina e número de hemácias, caracterizando um quadro de anemia, sendo que os grupos mais afetados foram os que receberam as maiores concentrações das toxinas em associação. Observou-se um menor (P<0,05) número de leucócitos em todos os tratamentos, porém esta redução foi mais intensa nos grupos tratados com 200mig/kg de AFB1, com ou sem FB1. Conclui-se que a AFB1 e a FB1, isoladas ou em associação, nos níveis utilizados no estudo, podem afetar negativamente os parâmetros hematológicos de frangos de corte.

aflatoxina B1; fumonisina B1; hematologia aviária; frangos de corte

The aim of the present study was to evaluate the effects of dietary aflatoxin B1 (AFB1) and fumonisin B1 (FB1) on the hemogram and leucogram of broilers. The mycotoxins were added to rations, singly and in combination, at levels of 0, 50 and 200mug AFB1/kg, and/or 0, 50 and 200mg FB1/kg. A completely randomized 3 x 3 factorial design was used, with 9 treatments and 12 replications per treatment (total: 108 birds). Broilers were fed the contaminated rations from day-old 8 to 41. All the mycotoxin-treated groups had decreased (P<0.05) values of hematocrit, hemoglobin concentration and erythrocyte counts, which are common characteristics of anemia. The most affected birds were from groups receiving the highest levels of the combined mycotoxins. Lower (P<0.05) white blood cells counts were also noted in all groups fed mycotoxin-contaminated feeds, however, this reduction was more severe in broilers fed 200mug AFB1/kg, alone or in association with FB1. The conclusion is that both AFB1 and FB1, singly or in combination at the levels studied, can negatively affect the hematological parameters of broiler chicks.

AFB1; FB1; avian hematology; broilers

ARTIGOS CIENTÍFICOS

PRODUÇÃO ANIMAL

Parâmetros hematológicos de frangos de corte alimentados com ração contendo aflatoxina B₁ e fumonisina B₁

Hematological parameters of broiler chicks fed rations containing aflatoxin B₁ and fumonisin B₁

Eliana Neire Castiglioni Tessari^I; Carlos Augusto Fernandes Oliveira^II,1; Ana Lúcia Sicchiroli Paschoal Cardoso^I; David Randolph Ledoux^III; George Rottinghaus^IV

^IPesquisadora Científica, Instituto Biológico, Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio Avícola, Descalvado, SP, Brasil

^IIFaculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, USP. Av. Duque de Caxias Norte 225, 13635-900, Pirassununga, SP, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIICollege of Agriculture, Food and Natural Resources, University of Missouri, Columbia, MO, United States

^IVCollege of Veterinary Medicine, University of Missouri, Columbia, MO, USA

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da aflatoxina B₁ (AFB₁) e da fumonisina B₁ (FB₁) sobre o hemograma e o leucograma de frangos alimentados com ração contendo as toxinas isoladamente e em associação, nos níveis de 0, 50 e 200mg de AFB₁/kg, e/ou 0, 50 e 200mg de FB₁/kg. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x3, com 9 tratamentos e 12 repetições, totalizando 108 aves. Os frangos foram alimentados com as rações contaminadas do 8° até o 41° dia de vida. As aves de todos os grupos alimentados com micotoxinas apresentaram redução (P<0,05) nos valores de hematócrito, hemoglobina e número de hemácias, caracterizando um quadro de anemia, sendo que os grupos mais afetados foram os que receberam as maiores concentrações das toxinas em associação. Observou-se um menor (P<0,05) número de leucócitos em todos os tratamentos, porém esta redução foi mais intensa nos grupos tratados com 200mg/kg de AFB₁, com ou sem FB₁. Conclui-se que a AFB₁ e a FB₁, isoladas ou em associação, nos níveis utilizados no estudo, podem afetar negativamente os parâmetros hematológicos de frangos de corte.

Palavras-chave: aflatoxina B₁, fumonisina B₁, hematologia aviária, frangos de corte.

ABSTRACT

The aim of the present study was to evaluate the effects of dietary aflatoxin B₁ (AFB₁) and fumonisin B₁ (FB₁) on the hemogram and leucogram of broilers. The mycotoxins were added to rations, singly and in combination, at levels of 0, 50 and 200mg AFB₁/kg, and/or 0, 50 and 200mg FB₁/kg. A completely randomized 3 x 3 factorial design was used, with 9 treatments and 12 replications per treatment (total: 108 birds). Broilers were fed the contaminated rations from day-old 8 to 41. All the mycotoxin-treated groups had decreased (P<0.05) values of hematocrit, hemoglobin concentration and erythrocyte counts, which are common characteristics of anemia. The most affected birds were from groups receiving the highest levels of the combined mycotoxins. Lower (P<0.05) white blood cells counts were also noted in all groups fed mycotoxin-contaminated feeds, however, this reduction was more severe in broilers fed 200mg AFB₁/kg, alone or in association with FB₁. The conclusion is that both AFB₁ and FB₁, singly or in combination at the levels studied, can negatively affect the hematological parameters of broiler chicks.

Key words: AFB₁, FB₁, avian hematology, broilers.

INTRODUÇÃO

As micotoxinas são substâncias originadas a partir do metabolismo secundário de fungos de diversos gêneros, os quais se desenvolvem em cereais e derivados amplamente utilizados na alimentação animal (COULOMBE, 1991). As micotoxinas de ocorrência freqüente em nossas condições incluem as aflatoxinas e as fumonisinas.

As aflatoxinas são produzidas por fungos do gênero Aspergillus, espécies A. flavus, A. parasiticus e A. nomius (MOSS, 1998). São conhecidos, atualmente, pelo menos 17 compostos similares designados pelo termo aflatoxina, porém, os principais tipos de interesse médico-sanitário são identificados como B₁, B₂, G₁ e G₂, sendo que a aflatoxina B₁ (AFB₁), além de ser a mais freqüentemente encontrada em cereais, é a que apresenta maior poder toxígeno (COULOMBE, 1991). Um dos principais mecanismos de toxicidade da AFB₁ é a inibição da síntese protéica (SANTIN, 2000). Em frangos de corte, a AFB₁ causa depleção linfocítica na medula folicular da bursa de Fabricius (ESPADA et al., 1992) e diminuição das contagens de heterófilos e monócitos (CHANG & HAMILTON, 1979).

As fumonisinas são produzidas por fungos do gênero Fusarium, principalmente da espécie F. moniliforme (verticillioides) (AH-SEO & WON LEE, 1999). Mais de 16 diferentes tipos de fumonisinas já foram isolados, porém a forma predominante produzida pelo F. moniliforme (verticillioides) é a fumonisina B₁ (FB₁), a qual também apresenta maior toxicidade (LEESON et al., 1995). As fumonisinas têm sido associadas com doenças como a leucoencefalomalácia eqüina (LEME) (MEIRELES et al., 1994) e o edema pulmonar suíno (DILKIN et al., 2004). Em aves, níveis de FB₁ acima de 150mg/kg causam diarréia, diminuição do consumo de alimentos e do ganho de peso, aumento do peso do fígado e rins e necrose hepática (NORRED & VOSS, 1994).

A ocorrência simultânea de duas ou mais micotoxinas na ração pode determinar a associação dos seus efeitos tóxicos individuais, tal como observado por WEIBKING et al. (1994) e KUBENA et al. (1995) em frangos e perus alimentados simultaneamente com AFB₁ e FB₁. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os parâmetros hematológicos (hemograma, leucograma e contagem diferencial de leucócitos) de frangos alimentados com rações contaminadas com AFB₁ e/ou FB₁.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 108 pintos de um dia de idade, com peso médio de 46g, machos, vacinados no incubatório contra doença de Marek e provenientes de matrizes comerciais de frangos de corte com 53 semanas de idade (linhagem comercial Hybro-PG). As rações experimentais foram formuladas de acordo com os níveis nutricionais recomendados pelo NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1994). As aves foram mantidas em um único boxe do 1° ao 7° dia de idade, recebendo água e ração ad libitum. No 8° dia, as aves foram distribuídas aleatoriamente em 9 boxes experimentais, com 12 aves em cada. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 9 tratamentos em arranjo fatorial 3 x 3, correspondendo a três níveis de incorporação de AFB₁/kg e três níveis de incorporação de FB₁/kg, conforme a tabela 1. Cada ave foi considerada uma unidade experimental (repetição). Todas as aves receberam as rações experimentais formuladas do 8° ao 41° dia de vida. Aos 14 dias de idade, as aves foram vacinadas contra a doença de Newcastle, pela via ocular, utilizando-se vacina industrializada (liofilizada) com vírus vivo, tipo B₁ - LaSota^a.

A AFB₁ e a FB₁ utilizadas no experimento foram produzidas no Veterinary Medical Diagnostic Laboratory da Universidade de Missouri, em Columbia, Estados Unidos, a partir do cultivo de cepas toxigênicas de Aspergillus flavus e Fusarium moniliforme (verticillioides), de acordo com OGIDO et al. (2004). A AFB₁ foi produzida em meio de arroz (SHOTWELL et al., 1966) e extraída do meio de cultura utilizando-se clorofórmio. O extrato foi submetido à evaporação completa do solvente e imediatamente ressuspendido em óleo de milho esterilizado, formando uma suspensão contendo aproximadamente 0,75mg de AFB₁/mL e 0,03mg de aflatoxina B₂/mL. A FB₁ foi preparada e mantida em material de cultivo à base de milho, homogeneizado e esterilizado, conforme os procedimentos descritos por WEIBKING et al. (1993). A concentração de FB₁ no material de cultivo foi 6.500mg/kg. Neste material, foi também constatada a presença de fumonisina B₂, na concentração de 2.100 mg/kg.

A adição de volumes convenientes da suspensão de AFB₁ (7-30mL/100kg de ração) e do material de cultivo contendo FB₁ (0,7-3,0kg/100kg de ração) foi realizada em um misturador horizontal/helicoidal (Marconi^â), em 5 diferentes batidas de ração, no decorrer do período experimental, totalizando 550kg de ração. A confirmação dos níveis de AFB₁ nas rações experimentais foi efetuada através de cromatografia de camada delgada, utilizando-se o método descrito por SOARES & RODRIGUEZ-AMAYA (1989). Para a confirmação dos níveis de FB₁, utilizou-se a técnica de SHEPHARD et al. (1990), com quantificação através de cromatografia líquida de alta eficiência. Após a análise das rações das 5 batidas, os níveis de AFB₁ nos tratamentos que continham 50 e 200mg/kg foram 46,51+5,47mg/kg e 187,68+50,28mg/kg, respectivamente. Para a FB₁, os níveis encontrados nos tratamentos contendo 50 e 200mg/kg foram 57,27+1,81mg/kg e 201,00+25,40mg/kg, respectivamente. As rações de cada batida também foram analisadas para a detecção da possível presença de ocratoxina A e zearalenona (SOARES & RODRIGUEZ-AMAYA, 1989), sendo que nenhuma delas foi detectada nas amostras. Os limites de quantificação do método de análise para ocratoxina A e zearalenona foram 5,0mg/kg e 55,0mg/kg, respectivamente.

Aos 41 dias de idade das aves, amostras do sangue de 4 aves por tratamento foram colocadas em tubos contendo anticoagulante (ácido etilenodiaminotetraacético), na proporção de 0,1mL para 1,0mL de sangue, para a realização das análises hematológicas. Os exames da fração celular sanguínea consistiram de: determinação do hematócrito e da hemoglobina, contagem de hemácias, contagem total e diferencial de leucócitos e de trombócitos, interpretação do leucograma e observação da morfologia celular. A determinação do hematócrito foi realizada através do método do microhematócrito, utilizando-se tubo capilar centrifugado a 1.200g por 5 minutos, sendo o resultado expresso em porcentagem. A concentração de hemoglobina (g/dL) foi medida através da técnica de cianometahemoglobina, utilizando-se reagentes do fabricante BIOCLIN, conforme instruções de uso. Para a contagem de hemáceas e leucócitos, utilizou-se uma amostra de sangue e solução de Natt e Herrick’s^b, em uma diluição de 1:200, realizando-se a contagem (N/mL) em câmara de Neubauer. A partir dos dados obtidos no hemograma, foram calculados os seguintes índices hematimétricos de Wintrobe: hemoglobina corpuscular média (HCM), expressa em picogramas (pg); concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), expressa em g/dL; volume corpuscular médio (VCM), expresso em fentolitros (fL).

Para a contagem diferencial leucocitária, preparou-se um esfregaço sanguíneo em lâminas de vidro corado com hematoxilina-eosina. As lâminas foram lavadas com água destilada, secadas ao ar livre e os esfregaços foram observados ao microscópio ótico com objetiva de imersão. A contagem leucocitária foi classificatória para linfócitos, heterófilos, eosinófilos, monócitos e basófilos, calculando-se a proporção de cada tipo em cem células contadas. Adicionalmente, realizou-se a contagem de trombócitos.

Os resultados das análises foram submetidos à análise fatorial (3x3), de acordo com os procedimentos estabelecidos no General Linear Model do SASÒ (SAS INSTITUTE, 1992). As médias dos tratamentos que foram estatisticamente diferentes na análise de variância foram analisadas pelo teste de LSD (Least Significant Difference) de Fisher, adotando-se, como nível de rejeição, a = 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foram observadas alterações no estado geral das aves durante o período de intoxicação. Os efeitos dos diferentes níveis de AFB₁ e FB₁, isoladas e associadas na ração, sobre os parâmetros do hemograma dos frangos aos 41 dias de idade, encontram-se na tabela 2. As aves do grupo controle apresentaram todos os valores dentro das faixas de normalidade, de acordo com os dados reportados por NORIEGA (2000) e CARDOSO & TESSARI (2003). As aves de todos os grupos alimentados com micotoxinas apresentaram redução (P<0,05) nos valores de hematócrito, hemoglobina e número de hemácias, com exceção do grupo que recebeu somente 50mg/kg de FB₁, que apresentou número de hemácias semelhante ao controle. Os índices hematimétricos HCM e VCM apresentaram um aumento significativo (P<0,05) nas aves dos tratamentos de associação 200mg/kg de AFB₁ + 50mg/kg de FB₁ (T8) e 200mg/kg de AFB₁ + 200mg/kg de FB₁ (T9), sendo que o VCM também foi maior nos tratamentos 50mg/kg de AFB₁ + 200mg/kg de FB₁ (T6) e 200mg/kg de AFB₁ (T7), quando comparado com os valores obtidos das aves do grupo controle. O CHCM apresentou-se reduzido (P<0,05) em todos os tratamentos, com exceção dos grupos alimentados com 50mg/kg de FB₁ (T2) e 50mg/kg de AFB₁ + 50mg/kg de FB₁ (T5). Estes resultados indicam um quadro de anemia decorrente da intoxicação por AFB₁ e FB₁, conforme reportado por outros autores (TUNG et al., 1975; JAVED et al., 1995).

O número de hemácias foi acentuadamente reduzido nos grupos que receberam os maiores níveis de micotoxinas, principalmente dos tratamentos de associação 200mg/kg de AFB₁ + 50mg/kg de FB₁ (T8) e 200mg/kg de AFB₁ + 200mg/kg de FB₁ (T9), os quais apresentaram menor número de hemácias (P<0,05) quando comparados aos demais tratamentos. Coerentemente, os valores do hematócrito e de concentração de hemoglobina também diminuíram, sendo que os grupos que receberam 200mg/kg de AFB₁ (T7) e 200mg/kg de AFB₁ + 200mg/kg de FB₁ (T9) apresentaram o menor valor (P<0,05). TUNG et al. (1975) alimentaram frangos com 5,0 e 10,0mg/g de aflatoxina e observaram que os efeitos sobre os parâmetros hematológicos foram mais pronunciados quanto maior o nível de aflatoxina, similarmente aos resultados do presente estudo.

Com relação aos efeitos isolados da FB₁ sobre o hemograma de frangos, JAVED et al. (1995) também observaram diminuição do número de hemácias e da concentração de hemoglobina em pintinhos alimentados com FB₁, em níveis de 125 e 274mg/kg de ração, no período de 1 a 14 dias de idade. Entretanto, WEIBKING et al. (1993) obtiveram resultados conflitantes, uma vez que não constataram diferenças significativas na contagem de hemácias, concentração de hemoglobina, hematócrito e VCM de frangos de corte alimentados com ração contendo 450 e 525mg/kg de FB₁. Resultados discordantes também foram relatados por KUBENA et al. (1997), os quais avaliaram os efeitos da administração de 300mg de FB₁/kg de ração em perus fêmeas, observando um aumento do número de hemácias. O mecanismo de toxicidade específico pelo qual a FB₁ afeta os parâmetros hematológicos não está completamente esclarecido, porém, as discrepâncias encontradas nos resultados de diferentes trabalhos sobre os efeitos das fumonisinas em aves podem estar relacionadas à presença de outros metabólitos de Fusarium no material usado nos experimentos (LEESON et al., 1995).

A tabela 3 apresenta os efeitos dos diferentes níveis de AFB₁ e FB₁, isoladas e associadas na ração, sobre os parâmetros do leucograma dos frangos aos 41 dias de idade. O número de leucócitos, trombócitos, linfócitos, heterófilos e monócitos obtidos nas aves do grupo controle foram considerados normais, de acordo com NORIEGA (2000) e CARDOSO & TESSARI (2003). Observou-se uma redução (P<0,05) no número de leucócitos em todos os tratamentos, quando comparado ao grupo controle, sendo que a redução foi mais intensa nos grupos tratados com 200mg/kg de AFB₁, com ou sem associação com FB₁ (T7, T8 e T9). O mesmo foi observado com relação ao número de linfócitos, heterófilos e monócitos, sendo que os tratamentos de associação 200mg/kg de AFB₁ + 50mg/kg de FB₁ (T8) e 200mg/kg de AFB₁ + 200mg/kg de FB₁ (T9) apresentaram número de linfócitos e heterófilos ainda menor. Estes resultados indicam um quadro de comprometimento da resposta imunológica mediada por células, típico da exposição de frangos às aflatoxinas em baixas concentrações na ração (ESPADA et al., 1992). O número de trombócitos não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos. Com relação ao número relativo dos tipos celulares, houve um aumento (P<0,05) no percentual de linfócitos das aves que receberam as micotoxinas, isoladamente ou em associação, com exceção do grupo alimentado com 50mg/kg de FB₁ (T2). Este aumento no percentual de linfócitos pode estar relacionado à diminuição da atividade de células fagocitárias causada pela AFB₁ (CHANG & HAMILTON, 1979), uma vez que todos os grupos alimentados com ração contendo as micotoxinas apresentaram uma redução (P<0,05) no percentual de heterófilos, apesar de não ter havido diferença no percentual de monócitos (P>0,05).

A diminuição do número de leucócitos observada no presente estudo é coerente com os dados descritos por JAVED et al. (1995), porém contrária aos resultados obtidos por TUNG et al. (1975). Estes autores observaram um aumento no número de leucócitos circulantes de frangos de corte tratados com 5 e 10µg/g de AFB₁ adicionada à ração, o que parece incoerente à luz dos conhecimentos quanto aos efeitos das aflatoxinas sobre os órgãos hematopoiéticos das aves, sobretudo sobre a bursa de Fabricius (ESPADA et al., 1992), principalmente ao se levar em consideração que os autores utilizaram concentrações 25-50 vezes acima do maior nível utilizado no presente estudo (200mg/kg de AFB₁). Com relação ao efeito isolado das fumonisinas, BERMUDEZ et al. (1996) também observaram resultados diferentes em perus alimentados com ração contendo 75mg de FB₁/kg, demonstrando um aumento no número total de leucócitos e no número absoluto de linfócitos e heterófilos. Os autores concluíram que os perus são relativamente resistentes à FB₁, quando comparados com frangos de corte.

CONCLUSÕES

Os resultados demonstraram que a AFB₁ e a FB₁, isoladas ou associadas, acarretam um quadro caracterizado por anemia hemolítica, leucopenia, linfopenia e heterofilia em frangos de corte. Desse modo, observa-se que o limite máximo de aflatoxinas em rações (50mg/kg) adotado pela legislação brasileira (BRASIL, 1988) não pode ser considerado seguro na criação de frangos de corte, uma vez que este nível acarretou alterações em alguns parâmetros hematológicos, sendo, portanto, potencialmente capaz de afetar o desempenho das aves. Os efeitos tóxicos foram mais intensos com a associação entre a AFB₁ e a FB₁, o que demonstra a necessidade da adoção de limites de tolerância para fumonisinas em rações para frangos de corte.

FONTES DE AQUISIÇÃO

^a new vac-ls, Ford Dodge Saúde Animal Ltda – R. Luiz Fernando Rodriguez, 1701, Campinas, SP.

^b IMBRALAB Química e Farmacêutica Ltda – R. Ataulfo Alves, 396, Ribeirão Preto, SP.

Recebido para publicação 20.06.05

Aprovado em 04.01.06

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Set 2006
• Data do Fascículo
  Jun 2006

Histórico

• Aceito
  04 Jan 2006
• Recebido
  20 Jun 2005