Agentes antitumorais inibidores da angiogênese: modelos farmacofóricos para inibidores da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3

Angiogenesis inhibitors antitumor agents: pharmacophore models to <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 antagonists

Resumos

O câncer é, atualmente, uma das principais causas de morte no mundo. A angiogênese, formação de novos vasos capilares a partir de células endoteliais, é essencial para vários processos fisiopatológicos, tais como o desenvolvimento e a disseminação dos tumores. As integrinas são uma família de receptores de superfície que estão envolvidos na angiogênese, na qual a integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 exerce papel importante. Os antagonistas da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 têm efeitos diretos na prevenção do crescimento, angiogênese e metástase tumorais. A avaliação in vitro frente à integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 de coleções de ciclopeptídeos levou a compostos muito ativos e seletivos. Antagonistas não-peptídicos da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 também foram planejados e sintetizados. A partir da determinação da estrutura tridimensional da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 complexada com um inibidor, tornou-se possível o planejamento racional de ligantes com alta afinidade. Além disto, estes estudos permitiram a validação e o refinamento de modelo farmacofórico para os inibidores da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3.

Angiogênese; Terapia do câncer; Antagonistas da integrina <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3; Integrinas; Agentes antitumorais

Cancer is one of the leading causes of death. Angiogenesis, the growth of new blood vessels, is essential for tumor development and spreading. Integrins are a family of surface receptors that are involved in angiogenesis. The <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 integrin plays an important role in tumor angiogenesis. <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 inhibitors have direct effects to prevent tumor metastases, growth and angiogenesis. In vitro screening of cyclic peptide libraries led to highly active and <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3-selective compounds. Non-peptidic <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 antagonists were also designed and synthesized. The crystal structure of the <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 integrin in complex with RGD ligant allowed structure-based rational design of ligands and validation of pharmacophore model to <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 antagonists.

Angiogenesis; Cancer therapy; <FONT FACE=Symbol>anb</FONT>3 integrin antagonists; Integrins

REVISÃO

Agentes antitumorais inibidores da angiogênese - Modelos farmacofóricos para inibidores da integrina anb3

Angiogenesis inhibitors antitumor agents - Pharmacophore models to anb3 antagonists

Thais Horta Álvares da SilvaI, ^*; Anna Paola Butera^II; Daniel Henriques Soares Leal^I; Ricardo José Alves^I

^IDepartamento de Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais

IIDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais

RESUMO

O câncer é, atualmente, uma das principais causas de morte no mundo. A angiogênese, formação de novos vasos capilares a partir de células endoteliais, é essencial para vários processos fisiopatológicos, tais como o desenvolvimento e a disseminação dos tumores. As integrinas são uma família de receptores de superfície que estão envolvidos na angiogênese, na qual a integrina anb3 exerce papel importante. Os antagonistas da integrina anb3 têm efeitos diretos na prevenção do crescimento, angiogênese e metástase tumorais. A avaliação in vitro frente à integrina anb3 de coleções de ciclopeptídeos levou a compostos muito ativos e seletivos. Antagonistas não-peptídicos da integrina anb3 também foram planejados e sintetizados. A partir da determinação da estrutura tridimensional da integrina anb3 complexada com um inibidor, tornou-se possível o planejamento racional de ligantes com alta afinidade. Além disto, estes estudos permitiram a validação e o refinamento de modelo farmacofórico para os inibidores da integrina anb3.

Unitermos: Angiogênese. Terapia do câncer. Antagonistas da integrina anb3. Integrinas. Agentes antitumorais

ABSTRACT

Cancer is one of the leading causes of death. Angiogenesis, the growth of new blood vessels, is essential for tumor development and spreading. Integrins are a family of surface receptors that are involved in angiogenesis. The anb3 integrin plays an important role in tumor angiogenesis. anb3 inhibitors have direct effects to prevent tumor metastases, growth and angiogenesis. In vitro screening of cyclic peptide libraries led to highly active and anb3-selective compounds. Non-peptidic anb3 antagonists were also designed and synthesized. The crystal structure of the anb3 integrin in complex with RGD ligant allowed structure-based rational design of ligands and validation of pharmacophore model to anb3 antagonists.

Uniterms: Angiogenesis. Cancer therapy. anb3 integrin antagonists. Integrins.

O CÂNCER

O câncer é, atualmente, uma das principais causas de morte. Estima-se que mais de 126 mil pessoas no Brasil e cerca de 6 milhões de pessoas em todo o mundo morrem em decorrência da doença (Instituto Nacional do Câncer, 2003). Segundo o Instituto Nacional do Câncer – INCA (2006), deverão ocorrer mais de 472 mil casos novos de câncer em 2006 . O quadro atual é caracterizado pela existência de tratamentos de elevado custo e índice terapêutico relativamente reduzido. Há diversas classes farmacológicas disponíveis de agentes quimioterápicos para tratamento do câncer, mas nenhuma delas tem se mostrado capaz de erradicar as células cancerosas sem afetar tecidos normais (Salmon, Sartorelli, 2003). Qualquer que seja a causa, o câncer (ou neoplasia) é essencialmente uma doença de células, caracterizada por um desvio nos mecanismos de controle dos processos de proliferação e diferenciação celular. As lesões expansivas, denominadas tumores quando ocorrem em órgãos sólidos, à medida que se desenvolvem, podem comprimir ou invadir estruturas adjacentes normais.

Os tumores benignos são essencialmente bem delimitados, crescem geralmente de forma esférica e não invadem os tecidos ao seu redor, enquanto os tumores malignos apresentam como sua mais importante propriedade a capacidade de invasão de tecidos vizinhos. Esse processo de invasão e alastramento, denominado metástase, pode avançar até atingir o sistema circulatório, permitindo que as células malignas ganhem vias de disseminação (por exemplo, vasos sangüíneos) e atinjam outros sítios, distantes do local original, e neles iniciem novas colônias de células neoplásicas. Nos estágios iniciais do desenvolvimento, normalmente quando o tumor tem menos de dois milímetros de diâmetro, a nutrição da massa tumoral faz-se essencialmente por difusão a partir dos tecidos vizinhos. Superando esse tamanho, os tumores passam a depender de vasos sangüíneos próprios para que não entrem em degeneração e necrose (Brasileiro Filho, Guimarães, Bogliolo, 2000; Bergers et al., 1999). Além disso, naturalmente, os novos vasos formados servem como vias de disseminação das células malignas para outros focos de colonização (Fidler, Ellis, 1994). A metástase tumoral envolve diferentes interações célula-célula e célula-matriz tais como a liberação de células tumorais a partir do tumor primário, migração no sistema linfático ou vasos sangüíneos, ancoramento no sistema capilar do órgão alvo e extravasamento.

A MATRIZ EXTRACELULAR E SUA IMPORTÂNCIA PARA A ANGIOGÊNESE

As matrizes extracelulares são constituídas por malha de diferentes combinações de colágenos, proteoglicanos, ácido hialurônico e várias glicoproteínas como a fibronectina e a laminina, que preenchem a maioria dos espaços intercelulares (Ruoslahti, Pierschbacher, 1987; Haubner, Finsinger, Kessler, 1997).

A adesão das células à vizinhança das matrizes extra-celulares determina o seu formato, mantém a função celular adequada e a integridade do tecido. A matriz extracelular também auxilia o ancoramento das células, sinaliza o tráfego celular e dirige a diferenciação celular. O controle do comportamento celular parece originar em resposta às interações célula-matriz. As proteínas adesivas da matriz não apenas promovem a adesão celular como também estimulam a migração celular. A matriz também pode exercer seu efeito na diferenciação celular agindo como fator indutor, fazendo com que as células capazes respondam à ativação por hormônios ou por outros fatores solúveis, ou a própria matriz pode fornecer um sinal indutivo (Ruoslahti, Pierschbacher, 1987).

A adesão celular exerce papel importante na transdução de sinal e, portanto, está envolvida na transferência de informação entre células. A ligação das células à matriz extracelular também sinaliza para dentro do citoplasma e leva a reorientação do citoesqueleto e a mudanças no comportamento celular como, por exemplo, no estímulo à proliferação celular (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997; Clark, Brugge, 1995). Existem quatro classes principais de receptores celulares envolvidos nas interações célula-célula e célula-matriz: caderinas, selectinas, superfamília de receptores de imunoglobulinas e integrinas (Ruoslahti, Pierschbacher, 1987; Haubner, Finsinger, Kessler, 1997).

A ANGIOGÊNESE

A formação de novos vasos capilares a partir de células endoteliais é essencial ao desenvolvimento de órgãos, cicatrização de ferimentos e nos processos inflamatórios. A angiogênese e a metástase tumoral são processos funcionalmente relacionados, pois ambos envolvem uma tríade de eventos fisiopatológicos: mobilidade celular, proteólise tecidual e proliferação celular (Liotta, Steeg, Steller-Stevenson, 1991). O processo de angiogênese envolve série de etapas (Figura 1). As células endoteliais do vaso-mãe são estimuladas pelas citocinas angiogênicas. A lâmina basal é degradada pela ação de proteases da matriz extracelular e liberadas pelo endotélio. As células endoteliais migram para o estroma perivascular, proliferam e iniciam o brotamento capilar. A direção da migração é apontada para a fonte dos estímulos angiogênicos. O broto formado expande e assume a forma tubular e uma nova lâmina basal se desenvolve. A proliferação endotelial permite a extensão dos túbulos microvasculares que se unem por anastomose e dão origem à cadeia circulatória funcional (Liotta, Steeg, Steller-Stevenson, 1991; Giannis, Rübsan, 1997).

Os eventos adesivos requeridos na angiogênese são rigorosamente regulados. Eles são limitados às células afetadas, ativados por um curto período de tempo (alguns dias) e, logo após, suprimidos completamente. No endotélio em "repouso" (sem atividade angiogênica), a integrina anb3 praticamente não é detectada. Na angiogênese induzida por citocinas ou por tumores, entretanto, sua expressão é intensamente estimulada (Brooks, 1996; Liekens, De Clercq, Neyts, 2001). A falta de interações célula-matriz específicas induz a sinal apoptótico nas células endoteliais envolvidas na angiogênese e, portanto, previne a neovascularização. Em vários modelos animais, foi demonstrado que antagonistas de integrina bloqueiam a angiogênese induzida por fatores de crescimento e tumores (Eliceiri, Cheresh, 2001; Brassard et al., 1999; Cheresh, 1998).

A angiogênese não está envolvida apenas no desenvolvimento e disseminação dos tumores, mas também em vários processos fisiológicos e patológicos. Ela é essencial no desenvolvimento dos órgãos, na cura de ferimentos e em processos inflamatórios, sendo rigorosamente regulada pelo organismo (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997). A angiogênese também está envolvida em doenças como artrite reumatóide e retinopatia diabética (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997).

AS INTEGRINAS

As integrinas são uma família de macromoléculas mediadoras da adesão celular e reguladoras da angiogênese e da homeostasia vasculares. Fornecem interação física com a matriz extracelular necessária para a adesão, migração e posicionamento celulares e a indução de eventos sinalizadores essenciais para a sobrevivência, proliferação e diferenciação celular.

As integrinas são uma família de glicoproteínas transmembrana heterodiméricas, consistindo de duas sub-unidades a (150 a 180 KD) e b (~90 KD), associadas não-covalentemente. Atualmente, são conhecidos dezoito tipos de subunidades a e oito tipos de subunidades b que, combinadas, constituem pelo menos 24 integrinas já descritas (Xiong et al., 2001; Tucker, 2002). O contato entre as sub-unidades a e b envolve suas metades amino-terminais que, juntas, formam uma "cabeça" globular e as porções remanescentes formam duas caudas em formato cilíndrico que transpassam a membrana, plasmática. Ambas sub-unidades a e b apresentam um pequeno domínio transmembrana (20 a 30 resíduos) e uma região intracelular (20 a 50 resíduos) (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997). Existem duas séries principais de integrinas, aquelas onde a sub-unidade a contem uma região extra de ~180 aminoácidos, o domínio a-A, e aquelas que não têm (Figura 2). O domínio a-A é formado por um conjunto de aminoácidos próximos à função amino-terminal, capaz de se ligar a cátions bivalentes, como Ca²⁺ ou Mg²⁺ , representando o sítio de adesão dependente de íon metálico - MIDAS. A sub-unidade b também possui um domínio tipo-A, o domínio b A. Para integrinas com dois domínios A, o domínio a A é que participa da ligação com o ligante e pouco se sabe da função do domínio b A. Para as integrinas que possuem apenas o domínio b A, este é responsável pela ligação com o ligante (Xiong et al., 2001).

Como os outros receptores, as integrinas transmitem sinais para o interior da célula (chamada sinalização "de fora para dentro"), por meio dos domínios citoplasmáticos. Os domínios da subunidade b conectam-se a filamentos de actina do citoesqueleto por meio de proteínas intracelulares como talina, vinculina e a-actinina (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997). Nesse processo, regulam a organização do citoesqueleto, ativam cascatas de quinases sinalizadoras e modulam o ciclo celular. Algumas integrinas são expressas constitutivamente, ou seja, são produzidas normalmente pelo organismo em condições fisiológicas. Outras, entretanto, possuem regulação diferenciada e respondem a estados de ativação das células, por exemplo, por citocinas angiogênicas [VEGF (vascular endothelial growth factor), TGFb (tumor growth factor b) , bFGF (basic fibroblast growth factor)] (Xiong et al., 2001; Brooks, 1996; Seow, 2002). Esta regulação da atividade "de dentro para fora" protege o hospedeiro da adesão patológica mediada pela integrina. Tanto a sinalização "de fora para dentro" quanto a "de dentro para fora" estão associadas a alterações conformacionais distintas no segmento extracelular das integrinas. Estas mudanças variam com o tipo e natureza do ligante e são moduladas por cátions divalentes (Xiong et al., 2001).

A família das integrinas b 3 (CD61) consiste dos receptores: aIIbb3 (CD41/CD61), encontrado em plaquetas e megacariócitos, e anb3 (CD51/CD61), mais amplamente distribuído.

A integrina aIIbb3 possui afinidade maior pelo fibrinogênio e está envolvida nos mecanismos de hemostasia (Erb et al., 1997; Xue et al., 1997). O bloqueio da agregação plaquetária pelo antagonismo da integrina aIIbb3 constitui importante estratégia terapêutica (Xue et al., 1997). Além disso, a integrina aIIbb3 também é expressada em certos tipos de tumores (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997).

A integrina anb3

Durante o remodelamento vascular e a angiogênese, as células endoteliais aumentam a expressão de vários constituintes da sua superfície que potencializam a invasão e proliferação celular, dentre elas a integrina anb3 (Neri, Bicknell, 2005). Além de exercer um papel importante na angiogênese (Brooks, 1996), em diferentes níveis da metástase tumoral (Varner, Cheresh, 1996; Filardo et al., 1995; Connell, 2000), a integrina anb3 atua na fagocitose de células em apoptose, no remodelamento ósseo e na falência renal aguda. A integrina anb3, também conhecida por receptor de vitronectina, pode ser encontrada na maioria das células originárias do mesênquima (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997). Possui afinidade por inúmeras proteínas adesivas como vitronectina, fibronectina, fibrinogênio, laminina, colágeno e fator de von Willebrand, colágeno tipo I e osteopondina (Varner, Cheresh, 1996).

Aquelas integrinas que estão envolvidas na migração celular são altamente expressadas nas células tumorais, como a integrina anb3, que é responsável pela ligação das proteínas com a matriz extra-celular (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997; Taraboletti, Margosio, 2001). Em particular, a integrina anb3 é freqüentemente expressada em osteossarcomas, neuroblastomas, carcinomas de pulmão, mama, próstata e bexiga, glioblastomas e melanomas invasivos. Evidências clínicas e pré-clínicas indicam que as integrinas vasculares podem ser alvos terapêuticos válidos e que a inibição da função da integrina anb3 suprime eficientemente a angiogênese e inibe a progressão do tumor (Alghisi, Ruegg, 2006).

A estrutura tridimensional do segmento extra-celular da integrina anb3 foi determina por Xiong e colaboradores (Xiong et al., 2001), que, posteriormente, também determinaram a estrutura do seu complexo com um ligante ciclopeptídico (Xiong et al., 2002). Os segmentos NH₂-terminais das unidades anb3 formam uma "cabeça" ovóide da qual emergem duas "caudas" quase paralelas (Figuras 2B e 3A). A cabeça consiste de uma hélice b de sete lâminas da sub-unidade av e dos domínios bA e híbrido tipo imunoglobulina da sub-unidade b3. A cauda av é composta por três domínios sandwich de folhas b: um domínio "coxa" e dois domínios muito similares que formam o módulo "perna". A cauda b3 consiste de um domínio PSI (domínio para plexinas, semaforinas e integrinas), quatro domínios EGF (fator de crescimento epidérmico) e um domínio cauda-b (bTD). As caudas a e b dobram-se para trás em um ângulo de 135°, formando uma estrutura em forma de V, com um joelho entre o domínio "coxa" e o módulo "perna" da av. Dois sítios de ligação com íon metálico são encontrados na hélice b da sub-unidade av. No domínio bA da sub-unidade b3 encontra-se um sítio de adesão dependente de íon metálico (MIDAS), que participa da interação com o ligante.

A interação dos ligantes desencadeia rearranjos nas estruturas terciárias e quaternárias nas integrinas, necessários à sinalização celular. Os ligantes complexam-se na interface principal entre as sub-unidades av e b3 e fazem contatos extensivos com ambas. Os rearranjos terciários ocorrem no bA, o domínio de ligação da sub-unidade b3. No complexo, bA adquire dois cátions, um dos quais faz contato direto com o ligante e outro que estabiliza a superfície de ligação com o ligante (Figura 3B). O MIDAS não é ocupado pelo íon metálico na conformação inativa da integrina. Durante a interação com o ligante, o Glu²²⁰ move-se para fora da região MIDAS, permitindo a coordenação de um cátion divalente nesta posição. Adicionalmente um outro sítio de coordenação de íon metálico é criado a 6 Å do MIDAS, o sítio de ligação de metal associado ao ligante (LIMBS), que complexa o outro oxigênio carboxílico do Glu²²⁰, prevenindo que este resíduo reocupe a posição no MIDAS. Adjacente ao MIDAS existe um outro sítio de ligação a metal (ADMIDAS), que sofre rearranjos conformacionais mínimos durante a interação com o ligante (Meyer et al., 2006). A interação com o ligante induz a pequenas mudanças na orientação relativa entre as sub-unidades av e b3.

Os mecanismos propostos para ativação das integrinas são ainda controversos, mas parecem envolver duas diferentes conformações do receptor: uma em que os domínios citoplasmático e transmembrânico das subunidades a e b estão alinhados e próximos um ao outro e os segmentos extracelulares estão dobrados em forma de "V" com um "joelho" entre os módulos "coxa" e "perna" (proposta como a conformação inativa) e outra em que os domínios citoplasmático e transmembrânico alinham-se separados um do outro e os segmentos extracelulares assumem uma conformação mais vertical (considerada como a conformação ativa) (Figura 4) (Li et al., 2005; Xiong et al., 2001; Rüegg, Mariotti, 2003). O estado de repouso inativo das integrinas, em que apresentam baixa afinidade por ligantes, é ativado de dentro da célula por meio das regiões citoplasmáticas e transmembrana (sinalização de "dentro para fora"). A ativação pode ser induzida pela ligação da talina à região citoplasmática da sub-unidade b e resulta em uma certa separação dos domínios citoplasmáticos e levantamento e alinhamento das regiões extra-celulares (Figura 4). O movimento das hélices do domínio bA leva ao reposicionamento dos íons metálicos, causando aumento de afinidade pelos ligantes extra-celulares. Após a interação com ligantes extracelulares, ocorrem mudanças na mobilidade lateral das integrinas na membrana plasmática, introduzindo agrupamento de integrinas. Estes agrupamentos parecem ser importantes para desencadear a ativação de diferentes cascatas de sinalização citoplasmáticas (sinalização de "fora para dentro") (Meyer et al., 2006).

As integrinas sinalizam série de eventos, entretanto, não possuem atividade enzimática intrínseca. A transdução do sinal pela interação do ligante depende, portanto, do recrutamento de moléculas sinalizadoras cruciais, em particular, quinases de proteínas, quinases de lipídeos, GTPases e fosfatases. Vários caminhos sinalizadores ativados por integrinas também são ativados por receptores de fatores de crescimento (Rüegg, Mariotti, 2003).

A SEQUÊNCIA RGD

As proteínas adesivas, embora estruturalmente diferentes, requerem seqüências de reconhecimento aproximadamente semelhantes para se ligarem às integrinas. Essas proteínas possuem em comum um resíduo de ácido aspártico ou de ácido glutâmico exposto, geralmente, em dobras estendidas e flexíveis. Das seqüências de aminoácidos que contêm ácido aspártico capazes de se ligarem às integrinas, a mais freqüente e mais estudada delas é a seqüência arginina-glicina-ácido aspártico (Arg-Gly-Asp ou RGD) (Figura 5), também conhecida como "sítio universal de reconhecimento celular" (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997; Arnaout, Goodman, 2002; Xiong et al., 2002).

Várias proteínas adesivas, como laminina, fibronectina, vitronectina, fibrinogênio e colágeno, contêm a seqüência RGD e podem ter sua interação com as integrinas inibida por antagonistas desses ligantes (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997; Ruoslahti, Pierschbacher, 1987; Sasaki, Timpl, 2001), denominados genericamente antagonistas da seqüência RGD ou, também, antagonistas de integrinas. A seletividade destas proteínas adesivas às várias integrinas é bastante diversa. Este fato pode ser explicado pela existência de sítios de ligação adicionais e pelas diferentes conformações que a seqüência RGD pode apresentar nas diferentes estruturas protéicas (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997; Brooks, 1996).

OS ANTAGONISTAS DE INTEGRINAS

A seqüência RGD é a base para o desenvolvimento de antagonistas de integrinas. Até meados da década de 1990, as buscas por análogos da seqüência RGD foram direcionadas para antagonistas da integrina aIIbb3 potentes, seletivos e com elevada biodisponibilidade oral. Foram obtidos antagonistas não-peptídicos valiosos, contribuindo para o tratamento de doenças tromboembólicas. Com o progresso dessas pesquisas e as descobertas sobre a importância da angiogênese para o crescimento e a metástase tumoral, grandes esforços passaram a ser feitos também na obtenção de antagonistas seletivos da integrina anb3 (Giannis, Rübsam, 1997). Já foram descritos vários inibidores desta integrina com efeitos diretos na prevenção da metástase, crescimento e angiogênese tumoral. Dois se encontram em triagem clínica para o câncer, o anticorpo monoclonal humanizado para anb3 (Vitaxin^TM, desenvolvido pelo Scripps Research Institute) (Eskens et al., 2003; Raguse et al., 2003) e o peptideomimético da seqüência RGD sintético, ciclo(L-arginil-glicil-L-aspartil-D-fenilalanil-N-metil-L-valil), (cilengitida, 8, na Figura 6, desenvolvido pela Merck KGaA). (Tucker, 2002; Liekens, De Clercq, Neyts, 2001; Burke, Denardo, 2001)

Diversos ciclopeptídeos baseados na seqüência RGD foram sintetizados e suas atividades in vitro frente às integrinas anb3 e aIIbb3 foram avaliadas: 1 (Aumailley et al., 1991; Dechansreiter et al., 1999; Pfaff et al., 1994), 2 e 3 (Peishoff et al., 1992), 4 (Pfaff et al., 1994), 5 e 6 (Bach et al., 1996), 7 (Burgess, Lim, Mousa, 1996), 8 (Dechansreiter et al., 1999), 9 (Casiraghi et al., 2005) e 10 (Belvesi et al., 2006) (Figura 6). A obtenção destes peptídeos cíclicos forneceu grandes contribuições para a investigação da seletividade dos antagonistas de integrinas. A ciclização é uma das formas de se conferir restrições conformacionais e, se a estrutura com conformação restrita é semelhante à conformação bioativa (capaz de interagir com o receptor), ocorre aumento da afinidade e da seletividade (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997).

Estudos de relação estrutura-atividade (SAR) levaram à definição do farmacóforo dos antagonistas da seqüência RGD: a carboxila do resíduo de ácido aspártico e a amidina do resíduo de arginina, posicionados a uma distância adequada (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997). A distância entre os grupos amidino e carboxilato nestas moléculas foi estimada com o uso de técnicas experimentais, como RMN e difração por raios X, e por modelagem molecular usando, por exemplo, simulações com dinâmica molecular. Nos peptídeos cíclicos, de modo geral, a seqüência RGD assume conformações preferencialmente em dobras mais fechadas nos antagonistas seletivos para a integrina anb3. Os carbonos b dos resíduos de Arg e Asp mostraram-se mais próximos nos antagonistas seletivos para a integrina anb3 do que nos antagonistas da integrina aIIbb3, nos quais a seqüência RGD assumiu conformações consideravelmente menos dobradas ou, mesmo, completamente distendidas.

As informações advindas dos estudos conformacionais de peptídeos auxiliaram o planejamento de novos protótipos não-peptídicos. Os oligopeptídeos estão sujeitos à ação enzimática das proteases e, em geral, apresentam baixa biodisponibilidade oral. Na busca pela melhoria de propriedades farmacocinéticas, como a estabilidade in vivo, o uso de peptideomiméticos tem sido cada vez mais pesquisado. Mais recentemente, inibidores da integrina anb3 não-peptídicos têm sido descritos. Estas substâncias possuem um grupo suporte central como, por exemplo, anéis aromáticos, heteromáticos e heterociclos, no qual estão ligados apêndices carregando grupos carboxilato e guanidino ou isósteros (Figura 7). Dentre os sistemas cíclicos que têm sido utilizados como suporte destacam-se o 1,4-benzodiazepínico [11 (Keenan et al., 1997) e 12 (Miller et al., 2000)], o nitrofenílico e o fenílico contendo sulfonamidas na posição a à carboxila [13 (Nicolaou et al., 1998), 14 (Ishikawa et al., 2006), 15 (Kubota et al., 2006) e 16 (Burnett et al., 2005)], o isoxazolínico [17 (Pitts et al., 2000)], o indazólico 1,5-dissubstituído [18 (Batt et al., 2000)], o benzotiofênico [19 (Marugán et al., 2005)], o benzoxazólico [20 (Marugán et al., 2005)], o indólico [21 (Marugán et al., 2005), 22 (Marugán et al., 2005) e 23 (Leonard et al., 2005)], o 4-oxoquinolínico [24 (Onthank et al., 2005)] e o piperazínico [25 (Iwama et al., 2004)]. Apesar de os valores de IC₅₀ e K_i não serem comparáveis, quando se analisam estes para cada uma das substâncias apresentadas na Figura 7, percebe-se a seletividade para a interação com a integrina anb3 em relação à aIIbb3 que, em casos como 11 e 25, chega a ser da ordem de dez mil vezes maior.

Nos estudos conformacionais realizados por Aumailley e colaboradores (1991), Peishoff e colaboradores (1992), Burgess e colaboradores (1996) e Bach e colaboradores (1996), para os ciclopeptídeos 1, 3, 5, 6 e 7 (Tabela I) foram avaliadas a distância entre os carbonos b dos aminoácidos arginina e ácido aspártico- Cb (Arg)-Cb(Asp). Para os peptídeos 3 e 5, antagonistas preferenciais da integrina aIIbb3, foram encontradas as distâncias de 9,8 e 8,6 Å, respectivamente, enquanto que para os peptídeos 1, 6 e 7, que são antagonistas preferenciais da integrina anb3, os valores apresentados para a mesma distância mostraram-se consideravelmente menores (6,6, 5,8 e 6,4 Å, respectivamente). De acordo com estes estudos supôs-se que a distância entre os grupos farmacofóricos das moléculas seria menor para os antagonistas preferenciais da integrina anb3 do que para aqueles que inibem preferencialmente a integrina aIIbb3, considerando que os carbonos b, a partir dos quais foram feitas as medidas, estejam ligados às porções rígidas destes peptídeos (Aumailley et al., 1991; Peishoff et al., 1992; Burgess, Lim, Mousa, 1996; Bach et al., 1996; Katada et al., 1997).

Para o peptídeo 26, antagonista da integrina aIIbb3, foi relatada a distância estimada entre os carbonos do grupo carboxilato e guanidino entre 12-13 Å (Katada et al., 1997) (Tabela I). Distâncias semelhantes foram relacionadas com a atividade inibitória da agregação plaquetária revelada pelos compostos 27, 28, 29 e 30 (Sugihara et al., 1998) (Tabela I).

Na cilengitida (8) observou-se, por RMN e por estudos teóricos usando métodos de geometria de distância e de dinâmica molecular, uma conformação menos dobrada, em que a distância entre os carbonos b variou entre 8,0 e 8,5 Å (Dechansreiter et al., 1999). Essa conformação menos dobrada do que havia sido suposto para os inibidores da integrina anb3, provavelmente, está mais próxima da conformação ativa e, portanto, justificaria o aumento da atividade. A cilengitida é o ligante presente no complexo com a integrina anb3, cuja estrutura foi determinada por Xiong e colaboradores (2002). Na estrutura cristalográfica do complexo a distância Cb (Arg)-Cb (Asp) da cilengitida é de 8,8 Å e entre os carbonos dos grupos carboxilato e guanidino é de 13,7 Å.

MODELOS FARMACOFÓRICOS PARA OS ANTAGONISTAS DA INTEGRINA anb3

Quando a estrutura cristalográfica de um alvo molecular é obtida, um dos estudos importantes é a realização de experimentos de modelagem molecular para obter um modelo de como a proteína e moléculas de interesse interagem. Estes modelos ajudam no reconhecimento das interações com resíduos do alvo molecular e permitem identificar regiões específicas das moléculas ligantes adequadas à modificações que irão permitir melhor ajuste ao sítio ativo. O objetivo principal da modelagem molecular é suprir conhecimento e percepção para o desenvolvimento mais racional e, portanto, mais rápido de fármacos mais potentes e seletivos.

A estrutura tridimensional do complexo entre a integrina anb3 e a cilengitida (8), obtida por difração de raios X, revelou que o ciclopentapeptídeo se insere em uma fenda entre os domínios hélice b da sub-unidade av e bA da sub-unidade b3 (Xiong et al., 2002) (Figuras 3B e ⁸). A seqüência Arg-Gly-Asp, ou RGD, faz o principal contato com a integrina e cada resíduo participa extensivamente da interação, que oclui cerca de 45% da área total do ciclopentapeptídeo. As cadeias laterais da Arg e Asp apontam para direções opostas, interagindo exclusivamente com os domínios hélice b e bA, respectivamente. Os cinco átomos Ca do ciclopentapeptídeo formam um pentágono levemente distorcido. O grupo guanidino da cadeia lateral do resíduo Arg do ciclopentapeptídeo está preso por uma ponte salina bidentada com Asp²¹⁸ e por uma ponte salina adicional com Asp¹⁵⁰. Estes contatos levam a maior parte da porção superior da cadeia lateral da Arg a ficar exposta ao solvente. Os contatos entre o Asp do ciclopeptídeo ligante e o subdomínio b A envolvem principalmente o grupo carboxilato da cadeia lateral em uma rede extensiva de interações polares. Um dos oxigênios do carboxilato faz contacto com o íon metálico do MIDAS em bA. O segundo oxigênio forma ligações de hidrogênio com os grupos amida da cadeia principal dos resíduos Tyr¹²² e Asn²¹⁵ e também faz contato com a cadeia lateral de Arg²¹⁴. A porção hidrofóbica da cadeia lateral do Asp faz contatos com o carbono b do Asn²¹⁵. Diferentemente do resíduo Arg , a cadeia lateral do Asp está completamente envolvida pelo complexo. O resíduo de glicina, que completa a seqüência de ligação RGD, estende-se na interface das sub-unidades av e b3. Este resíduo faz vários contatos com ambas as sub-unidades, sendo o principal aquele com o oxigênio carbonílico do Arg²¹⁶. Os dois resíduos restantes do ciclopentapeptídeo ligante estão apontados para fora da interface a-b e não são importantes para a interação do ligante com a integrina (Xiong et al., 2002).

Partindo da estrutura cristalina do segmento extracelular da integrina anb3 ligada ao ciclopentapeptideo cilengitida (8) (Xiong et al., 2002), o grupo de Kessler (Marinelli et al., 2003) gerou modelos estruturais para a interação de ligantes conhecidos por meio de superposições moleculares. Os resultados obtidos permitiram a validação e refinamento de um modelo farmacofórico anteriormente postulado por eles (Marinelli et al., 2003). O modelo de farmacóforo foi calculado como a média entre as distâncias entre os grupos nas conformações bioativas das moléculas estudadas (Figura 9). As seguintes interações foram hipotetizadas para governar o processo de reconhecimento ligante-receptor: (i) coordenação de um íon Ca²⁺ do sítio de ligação de metais a um dos oxigênios do grupo carboxilato do ligante; (ii) uma ponte salina entre (a)-Asp²¹⁸ ou (a)-Asp¹⁵⁰ e o grupo guanidino (ou isóstero) do ligante; (iii) uma interação no formato T entre a cadeia lateral do (b)-Tyr¹²² e um anel aromático do ligante; (iv) uma ligação de hidrogênio doada por um H-N do ligante ao oxigênio carbonílico da cadeia principal do (b)-Arg²¹⁶ e (v) uma ligação de hidrogênio entre um grupo carbonila do ligante e o grupo guanidino da (b)-Arg²¹⁴. A importância dos grupos carboxilato, guanidino ou isósteros e de uma cadeia lateral contendo um anel aromático capaz de interagir por empilhamentos pi-pi, dos inibidores da integrina anb3, também foi considerada por Feuston e colaboradores (2002) em um estudo de superposição molecular por método computacional.

Uma nova estratégia de definição de farmacóforo e de superposição de ligantes flexíveis a proteínas flexíveis foi desenvolvida a partir de antagonistas seletivos da integrina avb3 por Moitessier e colaboradores (2004). Antagonistas peptídicos, pseudopeptídicos e não-peptídicos foram utilizados na construção do farmacóforo. Três grupos farmacofóricos foram considerados: um grupo carboxilato, um grupo guanidino ou isóstero e um grupo hidrofóbico. Campos estéricos foram gerados por busca conformacional sistemática para cada grupo farmacofórico. O alinhamento e a superposição das regiões acessíveis para cada grupo levou à determinação dos volumes superpostos (Figura 10), que constituíram o modelo farmacofórico. O modelo farmacofórico foi superposto, manualmente e por busca usando o programa Autodock, à estrutura cristalina da integrina anb3, em três modos de complexação possíveis. Os complexos construídos foram submetidos à simulação por dinâmica molecular (DM). O modelo de complexação obtido foi comparado com a estrutura cristalina da porção extra-celular da integrina anb3. A boa concordância entre ambas estruturas validou o farmacóforo proposto. Para desenvolver o screening virtual, as moléculas dos possíveis inibidores devem ser orientadas no sítio ativo segundo o modelo farmacofórico proposto e os complexos obtidos submetidos à simulação por DM, em que são considerados o efeito do solvente e a flexibilidade do receptor.

Ishikawa e colaboradores (Ishikawa et al, 2006) sintetizaram e testaram série de antagonistas duais das integrinas anb3/aIIbb3, dentre os quais o mais ativo foi o composto 14 (Figura 7). Com os dados obtidos estabeleceu-se uma série de relações estrutura-atividade. Para confirmação destes estudos de relação estrutura-atividade foram realizadas simulações por superposição molecular com a estrutura cristalográfica da integrina anb3, baseados na estrutura do receptor complexado com a cilengitida. Para tal, cada ligante foi posicionado manualmente no sítio ativo e minimizado. As principais interações encontradas foram uma ligação de hidrogênio do NH amino terminal do ligante com o Asp²¹⁸ da cadeia av, a coordenação do grupo carboxila com o metal do MIDAS, uma ligação de hidrogênio do NH da sulfonamida com o grupo carbonila da cadeia principal da Tyr¹²² da cadeia b3, o empilhamento dos anéis aromáticos da sulfonamida e da Tyr¹²² da cadeia b3 e uma ligação de hidrogênio da carbonila da amida central com a Arg²¹⁴ da cadeia b3. Os dados obtidos com a superposição molecular permitiram confirmar a importância da acidez da sulfonamida para a atividade, porque a acidez está relacionada com a polarização do NH da sulfonamida, que é um fator importante para a formação de uma ligação de hidrogênio com o receptor.

Belvesi e colaboradores (2006), usando como protótipos o cRGDF–V (1) e a cilengitida (8), sintetizaram série de ciclopeptídeos, que foram submetidos a ensaios de ligação com as integrinas anb3, avb5 e a5b1 e de agregação plaquetária. Nos compostos sintetizados os aminoácidos D-Phe-Val dos protótipos foram substituídos por 5,6 e 5,7-biciclolactamas estereoisoméricas de forma a restringir a seqüência RGD em diferentes conformações e, possivelmente, conduzir a aumento da atividade e seletividade para o antagonismo da integrina anb3. A determinação estrutural dos ciclopeptídeos, realizada por combinação de espectroscopia de RMN e cálculos de dinâmica molecular e mecânica molecular, revelou forte dependência entre a conformação e o tamanho do anel lactâmico. Na coleção de compostos sintetizados, o ciclopeptídeo 10 mostrou a maior afinidade no ensaio de inibição da ligação da equistatina, um potente antagonista peptídico, à integrina anb3, com um IC₅₀ de 3,8 ± 0,9 nM, o que é quase 50 e 5 vezes maior que, respectivamente, a dos protótipos cRGDFV (1) e da cilengitida (8), usados como referência. O composto 10 apresentou a geometria da seqüência RGD levemente dobrada ou quase estendida. O anel 5,7-trans-3R-lactâmico parece forçar o ciclopeptídeo 10 a assumir conformações preferenciais muito similares à apresentada pela cilengitida (8) ligada no complexo integrina anb3. Para os confôrmeros encontrados na simulação de dinâmica molecular, a distância média dos Cb (Arg)-Cb(Asp) foi de 8,5 Å, semelhante à distância apresentada pela cilengitida (8,9 Å). Ao contrário do que havia sido postulado anteriormente (Haubner, Finsinger, Kessler, 1997), a inibição da integrina anb3 não requer uma dobra muito forte da seqüência RGD.

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Desde que o médico Judah Folkman postulou, no início da década de 1970, que substâncias inibidoras de angiogênese teriam uma utilização potencial na terapia do câncer (Giannis, Rübsam, 1997), muito progresso tem sido verificado nesta área (Alghishi, Ruegg, 2006; Akalu, Cretu, Brooks, 2005; Meyer et al., 2006). As integrinas foram reconhecidas como mediadores e reguladoras da angiogênese induzida por tumores. Várias rotas sinalizadoras dependentes de integrinas, que contribuem para angiogênese, foram decifradas e antagonistas de integrina com propriedades antiangiogênicas foram obtidos. A eficácia potencial de antagonistas de integrinas para suprimir a angiogênese em tumores e a progressão de câncer tem sido verificada em testes clínicos. A determinação da estrutura cristalina do segmento extracelular da integrina anb3 ligada ao ciclopentapeptideo cilengitida (Xiong et al, 2002) foi um marco importante para o estudo, por modelagem molecular, de antagonistas da integrina anb3, permitindo o planejamento racional de novas moléculas com alta afinidade. Apesar deste progresso, várias questões ainda se mantêm em aberto e novas estão surgindo. Será de grande importância elucidar o mecanismo exato pelo qual os inibidores da integrina anb3 inibem a angiogênese e obter informações sobre qual é a melhor forma de usar estes inibidores na clínica. Outros usos terapêuticos para os inibidores da integrina anb3 devem ser mais bem investigados, visto que a angiogênese tem também sua função desregulada em outras doenças como a artrite reumatóide e a retinoplastia diabética.

Recebido para publicação em 01 de setembro de 2006.

Aceito para publicação em 01 de março de 2007.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Mar 2007

Histórico

• Aceito
  01 Mar 2007
• Recebido
  01 Set 2006