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Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

Print version ISSN 1676-2444

J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.42 no.1 Rio de Janeiro Feb. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S1676-24442006000100006 

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

 

Infecção por Helicobacter pylori e câncer gástrico: freqüência de cepas patogênicas cagA e vacA em pacientes com câncer gástrico

 

Helicobacter pylori and gastric cancer: distribution of cagA and vacA genotypes in patients with gastric carcinoma

 

 

Cristiane Melissa ThomaziniI; Nídia Alice PinheiroII; Maria Inês PardiniII; Luís Eduardo NaresseIII; Maria Aparecida Marchesan RodriguesIV

IMestranda do Programa de Pós-Graduação em Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Universidade Estadual Paulista (Unesp)
IIPesquisadora científica do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro, Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp
IIIProfessor livre-docente do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp
IVProfessora titular do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

INTRODUÇÃO: Apesar da alta freqüência de infecção por Helicobacter pylori na população, somente uma minoria de indivíduos desenvolve câncer gástrico. É provável que a colonização da mucosa por cepas patogênicas, levando a maior agressão e inflamação da mucosa seja um dos elos da cadeia de eventos da oncogênese gástrica.
OBJETIVOS: Investigar a freqüência de cepas patogênicas cagA e vacA do H. pylori em pacientes com câncer gástrico.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudados retrospectivamente 42 pacientes com câncer gástrico. A infecção por H. pylori foi avaliada por exame histológico e pelo PCR para identificação dos genótipos cagA e vacA em amostras de material fixado em formalina e incluído em parafina.
RESULTADOS: A análise histológica permitiu a visualização direta do H. pylori em 85,7% dos casos, e o método de PCR para o gene urease C demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos. O gene cagA foi detectado em amostras de 23 pacientes (54,7%) com câncer gástrico. O alelo s1 do gene vacA foi identificado em amostras de 24 pacientes (57,1%) e o alelo m1, em amostras de 26 pacientes (61,9%). Os alelos s1 e m1 foram identificados simultaneamente em 24 pacientes (57,1%). O alelo s2 foi identificado em amostras de quatro pacientes (9,5%), e o alelo m2, em amostras de três pacientes (7,1%). A freqüência de infecção pelo Helicobacter pylori foi similar em ambos os tipos histológicos de câncer gástrico (intestinal e difuso).
CONCLUSÕES: Os resultados confirmam a relevância dos genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori para lesões orgânicas significativas tais como o câncer gástrico, sugerindo a participação dessa bactéria na cadeia de eventos da oncogênese gástrica.

Unitermos: Helicobacter pylori, Câncer gástrico, cagA, vacA.


ABSTRACT

BACKGROUND: The rates of Helicobacter pylori infection are very high worldwide, but only a minority of infected patients develop gastric carcinoma. This might be related, among several factors, to the colonization of the human stomach by pathogenic Helicobacter pylori strains.
OBJECTIVE: To investigate the distribution of cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori in paraffin-embedded gastric samples from patients with gastric cancer.
MATERIAL AND METHODS: Paraffin-embedded samples from 42 patients with gastric cancer were histologically examined and evaluated by PCR for H. pylori cagA and vacA (s and m regions) genotypes.
RESULTS: Histological analysis allowed direct visualization of H. pylori in 85.7% of cases and PCR for urease C gene detected H. pylori in 95% of cases. The presence of cagA gene was detected in 23 (54.7%) patients with gastric cancer. The s1 allele from vacA gene was found in samples from 24 (57.1%) patients and the m1 allele in 26 (61.9 %). The s1m1 genotype was detected in 24 (57.1%) patients with gastric cancer. The s2 allele was found in samples from four patients (9.5%) and the m2 allele in three (7.1%) patients. The distribution of H. pylori genotypes was similar in both intestinal and diffuse types of gastric carcinoma.
CONCLUSION: Our results confirm the relevance of the pathogenic cagA and vacA H. pylori genotypes for significant organic lesions, such as gastric cancer, suggesting a possible role for H. pylori in the pathogenesis of gastric carcinoma.

Key words: Helicobacter pylori, Gastric cancer, cagA, vacA.


 

 

Introdução

O câncer gástrico permanece entre os problemas mais sérios de saúde em vários países, incluindo o Brasil(12, 27). O diagnóstico geralmente é feito na fase avançada de progressão da doença, o que dificulta a eficácia dos procedimentos terapêuticos e o prognóstico dos pacientes(5). Torna-se, portanto, relevante a identificação de fatores que possam ser utilizados como biomarcadores de risco para essa doença.

Os fatores etiológicos envolvidos na gênese do câncer gástrico não são inteiramente conhecidos. Estudos epidemiológicos demonstram a importância de fatores ambientais, notadamente alimentares, na patogenia do câncer gástrico(7, 11, 24). Um novo fator tem sido investigado na oncogênese gástrica: postula-se que a infecção pelo Helicobacter pylori levando à gastrite crônica, atrofia da mucosa e metaplasia intestinal tenha participação na cadeia de eventos da gênese do câncer gástrico(13, 18, 22). A Organização Mundial de Saúde classificou o H. pylori como agente carcinogênico do grupo I para a ocorrência de neoplasias gástricas(13). O H. pylori está presente em grande parcela da população mundial. No entanto, ínfimo número de pessoas desenvolve câncer gástrico. O risco é de cerca de 1% nos indivíduos infectados(11). Assim, as diferentes cepas da bactéria com padrões de virulência distintos devem atuar no hospedeiro, levando a diferentes graus de inflamação da mucosa gástrica. A virulência do H. pylori tem sido relacionada a diferentes fatores, incluindo a produção de urease, a presença de flagelos e a citotoxina vacuolizante(14, 21).

Em estudos recentes observamos que pacientes com infecção por Helicobacter pylori apresentaram danos no DNA das células epiteliais da mucosa gástrica, que se correlacionaram com a intensidade da resposta inflamatória na mucosa e com os genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori(15, 16). Esses resultados abrem a perspectiva de se investigar a possível correlação entre os diferentes genótipos da bactéria e as características clinicopatológicas do câncer gástrico.

A presente investigação visa avaliar a freqüência de infecção por Helicobacter pylori em amostras de mucosa gástrica, de material fixado em formalina e incluído em parafina, procedentes de pacientes com câncer gástrico e caracterizar, pela reação da polimerase em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos específicos, os genótipos patogênicos cagA e vacA da bactéria.

 

Material e métodos

Casuística

Quarenta e dois casos de câncer gástrico diagnosticados e arquivados no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista (Unesp), no período de 1998 a 2004, foram analisados neste estudo. As informações clínicas foram pesquisadas nos prontuários dos pacientes.

Seleção das amostras e estudo histopatológico

Amostras de tumor e respectivo tecido normal foram obtidas a partir de tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. Cortes histológicos de 5mm corados por hematoxilina-eosina foram submetidos a exame histopatológico para caracterização de tipo histológico, contaminação com tecido normal e estadiamento das neoplasias. Os tumores foram classificados em intestinal ou difuso, de acordo com a classificação de Lauren(17). Tumores com expressão morfológica combinada, intestinal e difusa, foram designados mistos. A gastrite foi classificada de acordo com a classificação de Sydney(9). A pesquisa de Helicobacter pylori foi feita pelo exame histológico, na mucosa gástrica adjacente à neoplasia, em cortes corados pelo método de Giemsa. A caracterização dos genótipos do Helicobacter pylori foi feita por PCR. O estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp.

Detecção dos genótipos do H. pylori por PCR

Amostras do tumor e da mucosa adjacente à neoplasia foram obtidas de cortes histológicos do material fixado em formalina, incluído em parafina. A extração do DNA genômico dos tumores e respectivos tecidos normais de cada paciente foi feita por tratamento com proteinase K e pelo Kit Wizard (Promega).

A integridade e a qualidade das amostras extraídas foram verificadas por PCR com oligonucleotídeos iniciadores para o gene constitutivo GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato). Foram investigadas seqüências específicas para o gene urease C, gene espécie-específico presente em todas as amostras de H. pylori, que codifica a enzima urease, bem como para o gene de virulência cagA do H. pylori. A composição de bases dos oligonucleotídeos iniciadores, o tamanho das seqüências, as referências e a temperatura de anelamento utilizadas são apresentados na Tabela 1.

 

 

A mistura de reação de PCR para detecção do gene GAPDH constou de: tampão de reação 10x [200mM Tris-HCl, 500mM KCl (pH 8.4)]; 1,5mM MgCl2; 0,4mM de cada dNTP(10mM); 1µl de Platinum Taq DNA Recombinante (5µl/µl) (Invitrogen Life Technologies); 5pmoles de cada oligonucleotídeo (sense e antisense); 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25µl. Para a detecção dos genes urease C e cagA foram utilizados: tampão de reação 10x [200mM Tris-HCl, 500mM KCl (pH 8.4)]; 3mM MgCl2(50mM); 0,2mM de cada dNTP(10mM), 1µl de Platinum Taq DNA Platinum (5µl/µl) (Invitrogen Life Technologies); 5pmoles de cada oligonucleotídeo (sense e antisense); 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25µl. A eletroforese do DNA amplificado foi realizada em gel de poliacrilamida 6% e corada pelo nitrato de prata.

Para a amplificação do gene vacA e de seus alelos s1/s2 e m1/m2 foram utilizados 1µl de DNA e oligonucleotídeos específicos para cada região (Tabela 1). Na reação de PCR para os alelos m1 e m2 utilizou-se solução contendo: 1.5µl de AmpliTaq Gold (5µl/ml Applied Biosystems); tampão 10x para PCR [100mMTris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 3mM de MgCl2 0.01% de gelatina](Applied Biosystems); 0,4mM de oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense; 1µl de DNA molde (concentrado); 0,4mM de dNTPs e água q.s.p. 25ml. Na reação de PCR para a região s do gene vacA utilizou-se solução contendo: 1µl de Accu Primer (Invitrogen Life Technologies); tampão 10x para PCR [100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 0,4mM de dNTPs]; 3mM de MgCl2; 0,4mM de oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense; 1µl de DNA molde (concentrado) e água q.s.p. 25ml. As reações foram realizadas em termociclador do tipo MJ Research, (Waretown, MA, USA). A visualização do produto de PCR foi realizada em gel de poliacrilamida 6% não-desnaturante, corado com nitrato de prata(26). Como controles positivos e negativos para vacA (s1/s2 e m1/m2), cagA e urease C, foram utilizadas amostras previamente genotipadas como positivas ou negativas e submetidas a seqüenciamento, em seqüenciador automático ABI Prism 377 (Applied Biosystems) e comparadas às seqüências depositadas nos bancos de dados genômicos públicos.

 

Resultados

Os atributos demográficos e anatomopatológicos são apresentados na Tabela 2. A idade dos pacientes variou de 27 a 78 anos, sendo a média 62,2 anos. Vinte e quatro pacientes eram do sexo masculino (58%) e 18, do sexo feminino (42%). O exame anatomopatológico demonstrou que o tumor estava localizado no antro gástrico em 26 casos (61,9%). Tumores em localização proximal, situados no corpo ou na cárdia foram observados em 16 casos (38,1%). O tipo histológico mais freqüente foi o adenocarcinoma intestinal, identificado em 34 casos (80,9%). O tipo difuso foi observado em seis casos (14,2%). Neoplasias com fenótipo morfológico misto, constituídas por áreas de padrão intestinal e áreas de padrão difuso foram identificadas em dois casos (4,7%).

 

 

A análise histológica da mucosa gástrica adjacente às neoplasias demonstrou em todos os casos a presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário com neutrófilos, cuja intensidade variou de leve a grave, no cório da mucosa. Metaplasia intestinal foi observada em 22 casos (52,3%). A pesquisa de Helicobacter pylori pelo método de Giemsa foi positiva em 36 casos (85,7%). A freqüência de infecção por Helicobacter pylori foi similar em ambos os tipos histológicos de câncer gástrico (intestinal e difuso).

Distribuição dos genótipos do H. pylori por PCR

A Tabela 3 demonstra a distribuição dos genes urease C, cagA e de genótipos do vacA em amostras da mucosa gástrica de 42 pacientes com câncer gástrico.

 

 

O gene urease C, espécie-específico para o H. pylori, foi identificado em amostras obtidas de 40 pacientes (95%) com câncer gástrico. O gene cagA foi detectado em amostras de 23 pacientes (54,7%) com câncer gástrico. O alelo s1 do gene vacA foi identificado em amostras de 24 pacientes (57,1%), e o alelo s2 foi identificado em amostras obtidas de seis pacientes (14,2%) com câncer gástrico. Três amostras apresentaram simultaneamente os alelos s1/s2. O alelo m1 foi detectado em amostras de 26 pacientes (61,9%). O alelo m2 foi encontrado em três amostras (7,1%). Duas amostras apresentaram os dois alelos m1/m2. A combinação alélica s1 e m1 foi identificada em 24 pacientes (57,1%) com câncer gástrico.

 

Discussão

No presente estudo descrevemos a análise de cepas do H. pylori por PCR na mucosa gástrica de 42 pacientes com câncer gástrico. A investigação foi retrospectiva, em amostras de tecido fixado em formalina e incluído em parafina. Tal abordagem foi oportuna, porque permitiu detectar a presença de DNA do H. pylori e estimar a possível relação de cepas patogênicas dessa bactéria com parâmetros clinicopatológicos do câncer gástrico.

A detecção do H. pylori foi avaliada por dois métodos: pela análise histológica, que permitiu a visualização direta da bactéria em 85,7% dos casos e pelo PCR, para o gene urease C, que demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos. O método de visualização direta ao microscópio é eficiente e de baixo custo, entretanto requer habilidade diagnóstica do analista para identificar a bactéria(10). Já o método de PCR, apesar do custo, apresenta maior sensibilidade, como pode ser documentado por nossos resultados, visto que foi capaz de identificar o genótipo do H. pylori em cinco amostras que haviam sido negativas ao exame histológico.

O gene cagA, que é marcador da ilha de patogenicidade cagPAI, codificadora de componentes do sistema de secreção da bactéria(4, 19) foi identificado em 54,7% dos casos de câncer gástrico analisados no presente estudo. Esses dados estão de acordo com investigações prévias, que demonstraram que pacientes infectados por cepas de H. pylori que expressam o gene cagA têm maior probabilidade de desenvolver câncer gástrico do que aqueles infectados por cepas que não expressam cagA(3, 20). No Brasil, estudo de casos controle desenvolvido em Belo Horizonte, Minas Gerais, demonstrou que o status cagA tem alto impacto no risco para desenvolvimento de câncer gástrico distal(23).

Os alelos s1 e m1 do gene vacA, que codifica a produção da citotoxina vacuolizante(25, 28), foram detectados em 57,1% e 61,9% dos casos, respectivamente, na presente investigação. A citotoxina vacA é considerada importante fator de virulência, visto que contribui para a produção, pela urease, de alcalóides que podem induzir danos no DNA das células epiteliais(14, 25, 28). Em estudo recente observamos que a colonização da mucosa gástrica por cepas cagA/vacA s1 m1 do H. pylori associou-se a resposta inflamatória mais intensa e maiores níveis de danos no DNA das células epiteliais(16). Esses dados referendam a correlação dos genótipos patogênicos cagA e vacA do H. pylori com a agressão crônica à mucosa expressa em nível morfológico por infiltrado inflamatório rico em enzimas e radicais livres capazes de lesar as células epiteliais. A reparação inadequada de lesões no DNA das células pode levar a mutações e instabilidade genômica, constituindo a etapa de iniciação do processo de carcinogênese.

Com relação à combinação dos diferentes alelos do Helicobacter pylori, verificamos que cepas cagA + s1m1 foram encontradas em maior número de casos de câncer gástrico. Na literatura observamos que cepas cagA + s1/m1 são mais virulentas(2). Bactérias com o genótipo m1 estão relacionadas com maior liberação de citotoxinas(1). Dessa forma, a presença de cepas cagA + s1/m1 pode estar relacionada a maior agressão e inflamação na mucosa, contribuindo para a gênese do câncer gástrico.

Não encontramos diferenças quanto à distribuição dos genótipos cagA e vacA do H. pylori em relação ao sexo e à idade dos pacientes, bem como quanto aos tipos histológicos intestinal ou difuso do câncer gástrico. Apesar de a presente casuística ser pequena, nossos resultados estão de acordo com os relatados pelos estudos de Queiroz, que também não observaram correlação dos genótipos da bactéria com atributos demográficos e com parâmetros histopatológicos do câncer gástrico(23).

Em síntese, a presença de infecção por Helicobacter pylori, avaliada em nosso estudo pela análise histológica, permitiu a visualização direta da bactéria em 85,7% dos casos, e pelo PCR, para o gene urease C, demonstrou a presença de DNA da bactéria em 95% dos casos, sendo a combinação alélica mais freqüente cagA + vacA s1/m1. Esses resultados destacam a alta prevalência de infecção por Helicobacter pylori no estômago de pacientes com câncer gástrico atendidos na região de Botucatu, São Paulo, e confirmam a relevância do genótipo cagA m1/s1 na patogênese do câncer gástrico.

 

Agradecimentos

À Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp), processo 940/04, pelo auxílio à pesquisa.

 

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Endereço para correspondência:
Maria Aparecida Marchesan Rodrigues
Departamento de Patologia
Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp
Distr. Rubião Júnior s/n
CEP 18618-000 – Botucatu-SP
e-mail: mariar@fmb.unesp.br

Primeira submissão em 29/09/05
Última submissão em 21/12/05
Aceito para publicação em 11/01/06
Publicado em 20/02/06
Apoio financeiro: Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (Fundunesp).