ISOLAMENTO DE PARVOVÍRUS SUÍNO DE TECIDOS FETAIS DE FÊMEAS SUÍNAS ACOMETIDAS POR DISTÚRBIOS REPRODUTIVOS NO ESTADO DE SÃO PAULORESUMO
A infecção pelo Parvovírus Suíno (PVS) é uma das principais causas de distúrbios reprodutivos em fêmeas suínas, representados por morte embrionária ou fetal, na ausência de quaisquer outros sinais clínicos. Neste trabalho são relatados os primeiros isolamentos de PVS realizados no estado de São Paulo, conduzidos através de infecção de cultura de células de linhagem de rim de suíno (SK-6) por suspensão de órgãos de fetos naturalmente infectados. Pulmão, rim e fígado de fetos foram macerados e ressuspendidos a 20% em solução salina fosfatada. Após três ciclos de congelamento e descongelamento, as suspensões foram centrifugadas a 2.000g por 20min e o sobrenadante recolhido para ser submetido à prova de Hemaglutinação (HA) com suspensão de hemácias de cobaias a 1%. Monocamadas de células, após serem infectadas pelas suspensões de órgãos, foram congeladas e descongeladas três vezes decorridas 72h pós-infecção e, a seguir, clarificadas por centrifugação a 800g por 10 min. Após uma alíquota do sobrenadante ser reservada para o teste de hemaglutinação, diversas passagens, usando a mesma metodologia, foram realizadas para cada amostra até que títulos apreciáveis em HA ( 32) fossem encontrados. A especificidade da reação de HA foi conferida pela prova de Inibição de Hemaglutinação (HI) com o uso de soro específico anti-PVS. O isolamento do PVS em rebanhos suínos confirma a presença desta importante virose no estado de São Paulo.
PALAVRAS-CHAVE:
Parvovírus suíno; parvovirose suína; isolamento; diagnóstico
ABSTRACT
Porcine Parvovirus infection is a common cause of porcine reproductive failure that is mainly represented by embryonic and fetal death, in the absence of any other clinicai signs. The present paper describes the first PPV isolation in the state of São Paulo, which was achieved through infection of culture cell lines of swine kidney (SK-6) by organ suspensions of naturally infected fetuses. Lung, liver and kidneys of PPV infected fetuses were ground and suspended as a 20% suspension in phosphate buffered saline. After these were frozen and thawed three times and cleared by centrifugation at 2,000g for 20 minutes, the Hemaglutination Activity (HA) using 1% suspension of guinea pig erytrocytes was measured and the cell lines was infected by the supematants. The infected cells were frozen and thawed three times, 72 hours post-infection and the supematants were cleared by centrifugatiori at 800g. After a sample had been taken for the HA test, several passages using the sarne method were made for each isolate until a consistent HA activity (titer 32) was detected in the cell culture supematant. Specificity of HA was proved by inhibition with PPV antiserum. The PPV isolation from pig herds confirms the presence of such vírus in the state of São Paulo.
KEY WORDS:
Porcine parvovirus; porcine parvovirosis; isolation; diagnostic
INTRODUÇÃO
O Parvovírus Sumo (PVS) é um vírus DNA relacionado a distúrbios reprodutivos em fêmeas sumas, eminentemente representados por morte embrionária e fetal sem causar, contudo, quaisquer outros sinais clmicos em animais adultos. A Parvovirose Suma desenvolvese geralmente quando fêmeas soronegativas são expostas, por via oronasal, ao PVS durante a primeira metade do período de gestação e seus fetos ou embriões são infectados transplacentariamente antes de se tomarem imunocompetentes (MENGELING, 1986). A infecção pelo PVS foi associada a falências reprodutivas primeiramente por CARTWRIGHT & HUCK (1967), quando o PVS foi primeiramente isolado.
A Parvovirose Suína é a principal causa infecciosa da síndrome SMEDI (das iniciais, em Inglês, dos principais sintomas associados, Stillbirth, Mummification, Embryonic Death and lnfertility) (THOMSON & PROZESKY, 1994) anteriormente creditada apenas a um grupo de Enterovírus Suíno (DUNNE et al., 1965). Apresenta uma distribuição mundial, estando colocada ainda hoje como uma das principais causas infecciosas de problemas reprodutivos na espécie suína (THACKER & GONZALEZ, 1988; DEE, 1995).
No Brasil, estudos realizados em Minas Gerais demonstraram a existência de elevada taxa de sumos com anticorpos anti-PVS sugerindo uma ampla disseminação do vírus naquela região (GOUVEIA et al., 1984). Em Santa Catarina e Rio Grande do Sul, estudo com 198 soros provenientes de diversas granjas indicaram cerca de 80% de suínos positivos (MARTINS et al., 1984). Em plantéis sumos no estado de São Paulo, 96% dos animais testados apresentavam títulos de anticorpos anti-PVS, quando submetidos à técnica de Inibição de Hemaglutinação (BERSANO et al., 1993).
Em São Paulo, os primeiros isolamentos de Parvovírus Suíno foram realizados em 1994 (BERSANO et al., 1995). Neste trabalho, os autores observaram que os vírus isolados comportaram-se, nos testes de Hemaglutinação (HA) e Inibição de Hemaglutinação (HI), de maneira idêntica à cepa padrão NADL-2. Ao microscópio eletrônico foi possível visualizar partículas morfologicamente semelhantes ao PVS, medindo cerca de 20 nm. Em um criatório suíno no estado de São Paulo, onde ocorriam abortamentos em fases iniciais de gestação, CAPPELLARO et al. (1995) detectaram, por microscopia eletrônica, partículas morfologicamente idênticas ao PVS em órgãos de fetos abortados.
O diagnóstico direto da Parvovirose Suma é baseado na detecção e identificação de antígenos virais pelos técnicas de Hemaglutinação em suspensão· de órgãos fetais (HA) ou Imunofluorescência em cortes de tecidos fetais infectados pelo PVS (MENGELING, 1986).
O isolamento em cultura celular e posterior reação de hemaglutinação do·sobrenadante infeccioso também pode ser utilizado para a detecção e identificação do PVS em tecidos fetais. Em cultivos celulares, o efeito citopático conseqüente à infecção virai é pouco pronunciado. São formadas granulações citoplasmáticas e nucleares, arredondamento dos contornos celulares e lise celular, efeitos difíceis de serem diferenciados de uma degeneração ou envelhecimento das células (CARTWRIGHT et al., 1969). A replicação virai e a conseqüente produção de efeito citopático (ECP) são obtidos mais facilmente em células que estejam em franca atividade mitótica. Desta forma, as tentativas de isolamento do PVS são melhores sucedidas quando são infectadas monocamadas celulares incompletas ou quando os vírus são inoculados simultaneamente ao repique de células (MAYR et al., 1968; JOHNSON, 1973).
O teste de Inibição de Hemaglutinação (HI) é a técnica mais utilizada para a detecção de anticorpos específicos anti-PVS e é normalmente aplicado para verificação da exposição de um plantel sumo ao PVS ou para a detecção de anticorpos específicos em fetos infectados após o estabelecimento de imtinocompetência fetal. Esta técnica, entretanto, é incapaz de diferenciar uma resposta imune humoral, oriunda de infecção natural, de uma resposta vacinai (MENGELING, 1986).
Este trabalho teve o objetivo de relatar o envolvimento do Parvovírus Suíno em casos clínicos associados a distúrbios reprodutivos e ressaltar a importância da Parvovirose Suína para a suinicultura no Estado de São Paulo.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras clínicas
Durante o período de 1994 a maio de 1997, foram enviadas 24 amostras ao Laboratório de Doenças de Suínos "Washington Sugay" do Instituto Biológico de São Paulo para detecção e identificação de PVS pelos dos métodos de Hemaglutinação (HA) e isolamento em cultura celular. Estas amostras, suspensões de órgãos fetais provenientes de fêmeas com história clínica de distúrbios reprodutivos, estão caracterizadas a seguir.
Tecidos fetais como fígado, rins ou pulmões foram triturados com grau, pistilo e areia estéril e ressuspendidas a 20% (p/v) em salina fosfatada acrescida de antibióticos (1000 UI/mL penicilina, 1mg/mL estreptomicina, 500 UI/mL micostatina). Após três ciclos de congelamento (em nitrogênio líquido) e descongelamento (temperatura ambiente), as suspensões foram centrifugadas a 2.000g por 10 minutos e o sobrenadante foi recuperado e estocado a-20 ºC até o momento do uso (Isolamento em células SK-6, reação de Hemaglutinação).
Processamento das amostras
As suspensões de órgãos fetais foram submetidas à reação de HA para em seguida infectar cultura celular (células SK-6). Os sobrenadantes infecciosos obtidos a partir do cultivo de células foram repassados neste sistema biológico até cinco vezes, submetidos à reação de HA e em seguida testados na presença de soro específico anti-PVS, através da técnica de HI.
Infecção de cultura celular
O isolamento ou cultivo do PVS foi realizado em células de linhagem de rim de suíno (SK-6) de acordo com o método descrito por PIRTLE (1974). Para o crescimento e manutenção das células foi utilizado meio de cultura EAGLE/MEM acrescido de soro fetal bovino a uma concentração final de 10% sem adição de antibióticos.
Para a infecção, monocamadas de células com 50 a 70% de confluência, cultivadas em frascos plásticos de 25cm2 , foram lavadas duas vêzes com salina fosfatada pH 7,4 para a retirada de quantidades residuais de soro fetal bovino presentes no meio de manutenção e infectadas com 5 mL de inóculo (cultivas celulares infectados ou suspensão deórgãos fetais). Após adsorção por um período de 90 minutos as monocamada foram lavadas duas vêzes novamente e a seguir foram adicionados 6 mL de meio de cultura EAGLE/MEM acrescido de soro fetal bovino a uma concentração final de 2% e antibióticos (200 UI/mL penicilina, 0,2 mg/mL estreptomicina, 100 UI/mL micostatina).
Ao ser observada completa confluência dos tapetes celulares, estes foram submetidos a três ciclos de congelamento e descongelamento e em seguida ressuspendidos em seu próprio meio de cultura. Depois de centrifugados para que ocorresse a sedimentação de restos celulares, o sobrenadante infeccioso obtido foi recolhido e estocado a -20 ºC.
A monitoração do crescimento virai do PVS em cultivo celular através de visualização de efeito citopático não é um método adequado pois as alterações citopatogênicas provocadas pelo vírus podem ser confundidas muitas vêzes com o envelhecimento celular (CARTWRIGHT et al., 1969). Por isso, neste trabalho a reação de Hemaglutinação (HA) foi utilizada como método de verificação do crescimento virai.
Para a obtenção de títulos hemaglutinantes apreciáveis, as amostras de campo foram inoculadas em sucessivas passagens (até 5), já que após a primeira inoculação algumas amostras sequer eram detectadas por HA.
Reações de hemaglutinação (ha) e inibição da hemaglutinação (hi)
As reações de Hemaglutinação e Inibição da Hemaglutinação foram realizadas conforme o descrito por JOO et al. (1976a, 1976b), em microplacas de fundo em "V", em salina fosfatada (PBS) pH 7,4 e solução de hemácias de cobaias a 1,0%.
Sangue de cobaias foi colhido em solução de Alsever estéril e estocado sob refrigeração por 3 dias até o momento do uso. O preparo das soluções de hemácias para as provas de HA e HI foi realizado através de três lavagens sucessivas em salina fosfatada (PBS) e ressuspensão das hemácias lavadas no mesmo tampão a uma concentração final de 1,0%.
Reação de hemaglutinação
As amostras foram diluídas em PBS, na base 2, perfazendo um volume final de 50 mL para cada diluição, sobre as quais adicionou-se igual volume de solução de eritrócitos de cobaias a 1,0%. A leitura das placas foi feita após incubação por duas horas em temperatura ambiente.
Reação de inibição da hemaglutinação
Soro específico anti-PVS foi diluído em PBS, na base 2, de forma a completar um volume final de 50mL para cada diluição, sobre as quais adicionou-se 25mL de amostra viral positiva em HA, diluída de forma a conter 4 UHA/25ul de solução. Após incubação por uma hora a 4ºC foi adicionado 50 mL de solução de hemácias de cobaias a 1,0%. A leitura das placas foi feita após incubação por duas horas em temperatura ambiente.
RESULTADOS
Detecção e identificação pelas reações de ha e isolamento em cultivo celular
Das 24 amostras enviadas ao Laboratório de Doenças de Suínos "Washington Sugay'' do Instituto Biológico de São Paulo para a detecção e identificação do PVS através dos métodos de HA e isolamento em cultura celular, nove permitiram o isolamento do PVS. As Tabelas abaixo ilustram a identificação das amostras, os quadros clínicos associados e os resultados fornecidos pelas técnicas de HA e isolamento virai
Isolamento do PVS a partir de diferentes tipos de amostra
A Figura 1 ilustra as relações percentuais existentes entre os tipos de amostras (feto mumificado, natimorto, abortado e leitões recém-nascidos) no total dos casos em que o isolamento viral foi bem sucedido (9 amostras). Neste caso foi notável a predominância das amostras oriundas de fetos abortados em relação às outras categorias (6 em um totai de 9). Na Figura 2 são mostradas as relações percentuais entre os tipos de amostras no total das amostras analisadas (24 amostras).
Amostras clínicas associadas a distúrbios reprodutivos em fêmeas suínas recebidas pelo Laboratório de Doenças de Suínos "Washington Sugay" do Instituto Biológico de São Paulo durante o período de 1994 a 1997 e positivas ao isolamento do PVS.
Amostras clínicas associadas a distúrbios reprodutivos em fêmeas suínas recebidas pelo Laboratório de Doenças de Suínos "Washington Sugay" do Instituto Biológico de São Paulo durante o período de 1994 a 1997 e negativas ao isolamento do PVS.
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Os resultados fornecidos pela técnica de HA utilizada neste laboratório para a detecção do PVS em suspensão de órgãos de fetos naturalmente infectados apresentaram títulos muito baixos, de forma que não foi possível aferir a especificidade da técnica pela reação de Hl. Estas observações contrastam com os resultados demonstrados por JOO etal. (1976b), quando os autores verificaram títulos hemaglutinantes acima de 16.536, no mesmo tipo de amostra.
O isolamento virai em cultura de células de linhagens só permitiu a detecção do PVS em títulos apreciáveis após pelo menos duas passagens. O isolamento do vírus a partir de tecidos fetais infectados não é um método eficiente para o diagnóstico da enfermidade a ele relacionada, uma vez que se pode levar até 30 dias para obter concentrações virais detectáveis (JOO et al., 1976a). A neutralização viral por anticorpos oriundos de uma resposta imune humoral fetal e a inativação do vírus após a morte fetal podem prejudicar o isolamento do PVS a partir de amostras clínicas (MENGELING, 1975). Outro fator de grande importância associado ao sucesso do isolamento relaciona-se à sensibilidade altamente variável que diferentes linhagens de células apresentam à infecção viral (EDWARDS et al., 1986; PYE etal., 1990; MIRANDA et al., 1992). Embora estes autores pudessem demonstrar a permissividade de certas linhagens celulares de origem suína à replicação do PVS, em geral esta categoria de células possui baixa sensibilidade à infecção pelo PVS (JOO & JOHNSON, 1976; PIRTLE, 1974).
Culturas primárias de células de origem suína, es pecialmente aquelas provenientes de tiróide e rim. são suscetíveis à infecção virai. Um inconveniente da utilização deste sistema para o isolamento virai é a presença do PVS oriundo de fetos persistentemente infectados, o que acarretaria resultados falsos positivos. Foi sugerida a possibilidade de eliminação do PVS por leitões que tenham sido infectados intrauterinamente antes de desenvolverem imunocompetência mas que foram capazes de sobreviver a infecção. Tal condição foi descrita como imunotolerância fetal ao PVS (JOHNSON & COLLINGS, 1971; JOHNSON et al., 1976).
A imunotolerância ao PVS é um fenômeno que pode ocorrer quando houver uma infecção não letal no feto, antes do 56° dia de gestação levando ao nascimento de indivíduos que podem permitir a replicação e eliminar continuamente o vírus, a despeito de exibirem resultados negativos em provas sorológicas de pesquisa de anticorpos específicos anti-PVS. Nestas condições, é possível o isolamento do vírus a partir de órgãos como rins, testículos e fluido seminal em animais com idades de até 8 meses (JOHNSON & COLLINGS, 1971).
Os abortamentos não estão incluídos entre os sintomas reprodutivos mais freqüentementes observados nas infecções associadas ao PVS, pois as células endometriais raramente são afetadas pela infecção. A ausência de injúria uterina não induz à liberação de prostaglandinas, não ocorrendo a luteólise e a gestação prossegue normalmente (CUTLER et al., 1983).
Partículas virais provenientes de fetos mumificados e natimortos têm uma viabilidade inferior àquelas de fetos abortados. Se a infectividade do PVS decresce à medida que a gestação prossegue após a morte fetal, raramente partículas virais podem ser recuperadas de tecidos fetais mumificados. O ciclo replicativo do PVS isolado a partir deste tipo de tecido é mais lento e, conseqüentemente, a detecção e identificação de sua infecção em cultura celular pode levar vários dias, já que diversas passagens em células podem ser necessárias (MENGELING et al., 1975).
Dentre as amostras positivas ao isolamento (Fig. 1) foi verificada uma predominância daquelas originárias de fetos abortados. É pouco provável que as amostras isoladas neste experimento estejam, em maior frequência, associadas a abortamentos e que possuam, portanto, uma patogenicidade diferente daquelas prevalecentes em outros países.
Neste trabalho, a predominância de isolamentos bem sucedidos a partir de amostras de fetos abortados em relação aos isolamentos a partir de fetos mumificados ou natimortos foi possivelmente devido à baixa infectividade das partículas virais potencialmente presentes nestes dois últimos tipos de amostra, o que permite concluir que a detecção do PVS por isolamento virai a partir de tecidos fetais mumificados possa estar sendo sub-diagnosticada.
Dados referentes à prevalência de anticorpos anti-PVS nos plantéis suínos nos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e São Paulo são indicativos da presença do vírus nestas populações. O presente estudo vem confirmar a presença do Parvovírus Suíno em criatórios de suínos no Estado de São Paulo bem como ratificar a sua importância como agente causador de distúrbios reprodutivos em fêmeas suínas e de severos prejuízos econômicos à suinocultura industrial.
Assim, face à prevalência da Parvovirose Suína no Brasil e as deficiências das técnicas de HNHI e isolamento virai para o diagnóstico direto desta importante virose, conclui-se que métodos de detecção e identificação do PVS com menores limiares de detecção, facilidade de execução e confiabilidade devem ser adotados para o diagnóstico da infecção pelo Parvovírus Suíno.
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
10 Fev 2025 -
Data do Fascículo
Jul-Dec 1998
Histórico
-
Recebido
26 Mar 1998
