Relação entre toxicidade de proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a receptores intestinais de lepidópteros-praga

O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de novas proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA) do intestino de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens. Proteínas expressas pelos genes vip3Aa42 e vip3Aa43 mostraram-se tóxicas a S. frugiperda (CL₅₀ de 78,2 e 113 ng cm^-2, respectivamente) e A. gemmatalis(CL₅₀ de 239,2 e 57,5 ng cm^-2, respectivamente), e pouco tóxicas a H. virescens (CL₅₀>5.000 ng cm^-2). Os ensaios de ligação às VMMA mostraram que as proteínas unem-se de forma efetiva aos receptores nas vesículas das espécies avaliadas, mas essa capacidade de ligação somente é efetiva na ativação da toxicidade para as populações avaliadas de S. frugiperda e A. gemmatalis.

Termos para indexação:
Anticarsia gemmatalis; Heliothis virescens; Spodoptera frugiperda; manejo de resistência; proteína Cry; vesículas de membrana

Autoria

Suzana Cristina Marucci

Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Rodovia Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, Zona Rural, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: suzy_marucci@yahoo.com.br, camila_sfigueiredo@hotmail.com, elianea@fcav.unesp.br, mvictor@fcav.unesp.br, janete@fcav.unesp.brUniversidade Estadual PaulistaBrazilJaboticabal, SP, BrazilUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Rodovia Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, Zona Rural, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: suzy_marucci@yahoo.com.br, camila_sfigueiredo@hotmail.com, elianea@fcav.unesp.br, mvictor@fcav.unesp.br, janete@fcav.unesp.br

Camila Soares Figueiredo

Renata Izabel Dozzi Tezza

Universidade Estadual Paulista (Unesp), Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: renata25@fcav.unesp.brUniversidade Estadual PaulistaBrazilJaboticabal, SP, BrazilUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica, CEP 14884-900 Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: renata25@fcav.unesp.br

Eliane Cristina da Cunha Alves

Manoel Victor Franco Lemos

Janete Apparecida Desidério

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Tabelas (2)

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Figura 1:
Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas totais dos lisados proteicos de clones de Escherichia coliBL21(DE3), transformados com os genes vip3Aa42 e vip3Aa43. Os genes foram clonados em vetor de expressão pET Sumo, e a expressão foi induzida. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), em kDa; 1, gene vip3Aa42 não induzido; 2, gene vip3Aa42 induzido; 3, gene vip3Aa43 não induzido; e 4, gene vip3Aa43 induzido. As proteínas recombinantes possuem massa de 101,5 kDa (setas), da qual 88,5 kDa das proteínas Vip3Aa e 13 kDa referentes à fusão, na região N-terminal, de uma cauda com 6 histidinas e uma proteína Sumo, presentes no vetor pET Sumo.

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Figura 2:
Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas Vip3Aa42 (A) e Vip3Aa43 (B) ativadas. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific), em kDa; 1, proteína purificada; 2, proteína ativada com tripsina pancreática bovina (Sigma- Aldrich); 3, proteína ativada com suco intestinal de Spodoptera frugiperda; 4, proteína ativada com suco intestinal de Anticarsia gemmatalis; e 5, proteína ativada com suco intestinal de Heliothis virescens.

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Figura 3:
Ensaio de ligação e competição homóloga das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43 às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMAs) de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.Aa42, ligação da proteína Vip3Aa42, marcada com biotina, à VMMA; Aa43, ligação da proteína Vip3Aa43, marcada com biotina, à VMMA. Competição homóloga: 500X, 1.000X e 2.000X de proteína não marcada em excesso.

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Tabela 1:
Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento dos genes vip3Aa das linhagens de Bacillus thuringiensis var.tolworthi HD125 e Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1.

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Tabela 2:
Concentração letal (CL₅₀ e CL₉₀)⁽¹⁾ das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43, em neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.

Figura 1: Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas totais dos lisados proteicos de clones de Escherichia coliBL21(DE3), transformados com os genes vip3Aa42 e vip3Aa43. Os genes foram clonados em vetor de expressão pET Sumo, e a expressão foi induzida. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), em kDa; 1, gene vip3Aa42 não induzido; 2, gene vip3Aa42 induzido; 3, gene vip3Aa43 não induzido; e 4, gene vip3Aa43 induzido. As proteínas recombinantes possuem massa de 101,5 kDa (setas), da qual 88,5 kDa das proteínas Vip3Aa e 13 kDa referentes à fusão, na região N-terminal, de uma cauda com 6 histidinas e uma proteína Sumo, presentes no vetor pET Sumo.

Figura 2: Análise de SDS-PAGE 12% das proteínas Vip3Aa42 (A) e Vip3Aa43 (B) ativadas. M, marcador de massa molecular Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific), em kDa; 1, proteína purificada; 2, proteína ativada com tripsina pancreática bovina (Sigma- Aldrich); 3, proteína ativada com suco intestinal de Spodoptera frugiperda; 4, proteína ativada com suco intestinal de Anticarsia gemmatalis; e 5, proteína ativada com suco intestinal de Heliothis virescens.

Figura 3: Ensaio de ligação e competição homóloga das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43 às vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMAs) de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.Aa42, ligação da proteína Vip3Aa42, marcada com biotina, à VMMA; Aa43, ligação da proteína Vip3Aa43, marcada com biotina, à VMMA. Competição homóloga: 500X, 1.000X e 2.000X de proteína não marcada em excesso.

Tabela 1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento dos genes vip3Aa das linhagens de Bacillus thuringiensis var.tolworthi HD125 e Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1.

⁽¹⁾
Iniciadores Vip5 e Vip6, obtidos de Loguercio et al. (2002)LOGUERCIO, L.L.; BARRETO, M.L.; ROCHA, T.L.; SANTOS, C.G.; TEIXEIRA, F.F.; PAIVA, E. Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.269-277, 2002. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01694.x.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002... ; e iniciadores A1-A6, obtidos no presente trabalho.
⁽²⁾
Códons ATG e TTA sublinhados representam o códon de início e o códon de terminação, respectivamente; d, direto; r, reverso.

Tabela 2: Concentração letal (CL₅₀ e CL₉₀)⁽¹⁾ das proteínas Vip3Aa42 e Vip3Aa43, em neonatas de Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Heliothis virescens.

⁽¹⁾
Valores entre parênteses representam o intervalo de confiança, com 95% de probabilidade. EP, erro-padrão da média.

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Relação entre toxicidade de proteínas Vip3Aa e sua capacidade de ligação a receptores intestinais de lepidópteros-praga

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[TFN1] ⁽¹⁾
Iniciadores Vip5 e Vip6, obtidos de Loguercio et al. (2002)LOGUERCIO, L.L.; BARRETO, M.L.; ROCHA, T.L.; SANTOS, C.G.; TEIXEIRA, F.F.; PAIVA, E. Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.269-277, 2002. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01694.x.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002... ; e iniciadores A1-A6, obtidos no presente trabalho.

[TFN2] ⁽²⁾
Códons ATG e TTA sublinhados representam o códon de início e o códon de terminação, respectivamente; d, direto; r, reverso.