Abstract

MARINHO, Vera Lúcia A. et al. RT-PCR-ELISA para a detecção do Apple stem grooving virus em macieira. Fitopatol. bras. [online]. 2003, vol.28, n.4, pp. 374-379. ISSN 0100-4158.  http://dx.doi.org/10.1590/S0100-41582003000400005.

Um método foi desenvolvido para a detecção do Apple stem grooving virus (ASGV), baseado na transcrição reversa do RNA viral e na polimerização em cadeia do DNA (RT-PCR), usando os oligonucleotídeos iniciadores ASGV4F-ASGV4R, localizados na região do gene da RNA polimerase, sendo os produtos de amplificação detectados por hibridização "sandwich", em placas de poliestireno, através de reação colorimétrica. A RT-PCR foi realizada com a "Titan™ RT-PCR System", complexo enzimático formado pela AMV, responsável pela transcrição do RNA viral em cDNA e as DNA polimerases PWO e Taq, usadas para a etapa de PCR, utilizando-se para isso extrato bruto de folhas e casca do caule de macieira (Malus domestica). A detecção dos produtos de amplificação RT-PCR foi realizada hibridizando esses produtos com uma sonda de captura marcada com biotina, ligada à placa de ELISA previamente sensibilizada com estreptavidina, e uma sonda de revelação marcada com digoxigenina. O complexo foi detectado utilizando-se um conjugado fosfatase alcalina marcada com anti-DIG. Foi avaliada a sensibilidade desse método utilizando-se uma série de diluições de vírus purificado, tendo sido possível detectar até 400 fg de vírus. A especificidade do método foi demonstrada usando-se os oligonucleotídeos iniciadores ASGV4F-ASGV4R e macieiras de diferentes origens infetadas com ASGV. Não foram reveladas colorimetricamente as amplificações observadas em gel de agarose, quando essas mesmas plantas foram testadas utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para o ASGV escolhidos na região que codifica para capa protéica e amplificações provenientes de material infetado com o Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) e Apple stem pitting virus (ASPV). Esta técnica combina o desempenho da PCR, a especificidade da hibridização molecular e as facilidades do teste de ELISA.

Keywords : colorimetric detection of ASGV; Prunus armeniaca.