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Ciência Rural

Print version ISSN 0103-8478

Abstract

SOUZA, Karina Koerich de et al. Otimização da técnica da PCR para a detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae. Cienc. Rural [online]. 2008, vol.38, n.8, pp. 2239-2244. ISSN 0103-8478.  http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782008000800023.

A utilização de métodos moleculares baseados em PCR é fundamental na detecção do Actinobacillus pleuropneumoniae, sendo capaz de identificar a infecção antes do estabelecimento da doença no rebanho. Estes métodos apresentam maior sensibilidade quando comparados com métodos tradicionais de isolamento bacteriano, mas podem sofrer influência de substâncias que reduzem a especificidade do teste e proporcionam o aparecimento de amplificações inespecíficas. No intuito de reduzir as amplificações inespecíficas, observadas quando aplicada a PCR para o gene cpx em amostras de tecido tonsilar, procedeu-se a otimização da técnica, na qual foram analisados o efeito do pré-cultivo bacteriano e as diferentes temperaturas de anelamento dos iniciadores e foi introduzido, no protocolo, um anticorpo que se liga na enzima Taq DNA Polimerase, aumentando a especificidade do teste. Paralelamente, foi realizado um experimento para verificar o efeito inibidor do tecido tonsilar sobre os resultados da PCR. Para isso, porções de tonsila de animais negativos para A. pleuropneumoniae foram contaminadas artificialmente com a amostra referência do sorotipo 5B. A adição do anticorpo para a enzima Taq DNA Polimerase e o aumento da temperatura de anelamento dos iniciadores para 57°C diminuiu o aparecimento de amplificações inespecíficas. Os resultados obtidos no experimento demonstraram que o tecido tonsilar possui efeito inibidor nas amplificações da PCR. Além disso, a amplificação depende de, no mínimo, 675 UFC presentes na alíquota da amostra usada na PCR (equivalente a 1,35 x 105 UFC mL-1), assim, amostras de fragmentos de tecido de infecções iniciais e/ou com poucas células podem apresentar resultados falsos negativos.

Keywords : PCR; gene cpx; tonsila; Actinobacillus pleuropneumoniae; pleuropneumonia suína.

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