Transformação genética de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39

Genetic transformation of 'Valencia' sweet orange with the cecropin MB39 gene

NOTAS CIENTÍFICAS

Transformação genética de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39

Genetic transformation of 'Valencia' sweet orange with the cecropin MB39 gene

Luis Gustavo de Paoli^I, Raquel Luciana Boscariol Camargo^II; Ricardo Harakava^III; Beatriz Madalena Januzzi Mendes^II; Francisco de Assis Alves Mourão Filho^I

^IEscola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Av. Pádua Dias, nº 11, Caixa Postal 9, CEP 13418-900 Piracicaba, SP. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IICentro de Energia Nuclear na Agricultura, Av. Centenário, nº 303, Caixa Postal 96, CEP 13400-970 Piracicaba, SP. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIIInstituto Biológico, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, nº 1.252, CEP 04014-002 São Paulo, SP. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39 controlado pelo promotor do gene da fenilalanina-amônia-liase de citros, visando a expressão gênica específica nos vasos do xilema. A transformação genética foi realizada via Agrobacterium tumefaciens por meio do co-cultivo de segmentos de epicótilo. Onze plantas transgênicas foram identificadas por PCR, pela amplificação do fragmento esperado de 189 pb, as quais foram aclimatizadas em casa de vegetação. A integração do transgene foi confirmada em três plantas pela análise de transferência de Southern.

Termos para indexação:Agrobacterium tumefaciens, Citrus sinensis, CVC, peptídeo antibacteriano, xilema.

ABSTRACT

The objective of this work was to produce 'Valencia' sweet orange transgenic plants with the cecropin MB39 gene controlled by a phenylalanine ammonia-lyase gene promoter from citrus in order to direct gene expression in xylem vessels. The genetic transformation was mediated by Agrobacterium tumefaciens with the co-culture of epicotyl segments. Eleven transgenic plants were selected by PCR with the amplification of a 189 bp fragment, which were acclimatized to greenhouse. The integration of the transgene was confirmed in three plants by Southern blot analysis.

Index terms:Agrobacterium tumefaciens, Citrus sinensis, CVC, antibacterial peptide, xylem.

A transformação genética de plantas constitui instrumento biotecnológico essencial para o melhoramento, pela introdução de genes exógenos, manutenção das características originais da variedade e encurtamento do tempo para obtenção de uma nova cultivar (Brasileiro & Dusi, 1999). O sistema de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens Smith & Tows. Conn. tem sido eficiente na regeneração de plantas transgênicas de citros (Mendes et al., 2002; Petri & Burgos, 2005).

Na busca de resistência a patógenos de origem bacteriana, a expressão de genes de peptídeos antibacterianos é uma alternativa viável (Zasloff, 2002). A cecropina pertence a uma família de pequenos peptídeos, isolados da hemolinfa de Hyalophora cecropia L., que exibem atividade lítica e antibacteriana contra muitas bactérias (Steiner et al., 1988).

Em experimentos in vitro, as cecropinas A e B reduziram o crescimento de Xylella fastidiosa Wells et al. (Andersen et al., 2004; Ishida et al., 2004). Entretanto, em alguns casos, o peptídeo foi degradado rapidamente, com perda de atividade. Dessa forma, o uso de análogos do gene, com estrutura mais estável, é estratégia mais adequada.

Harakava (2000) utilizou gene análogo da cecropina B, cecropin MB39, para construção de um vetor para transformação de plantas. Este gene análogo foi sintetizado por reação em cadeira de polimerase (PCR), utilizando-se quatro oligonucleotídeos de 62 a 68 bases, contendo os códons correspondentes aos aminoácidos do peptídeo adicionado de seqüência sinalizadora para secreção.

O peptídeo cecropina MB39 apresenta, em relação à cecropina B, substituição de uma metionina por uma valina, tornando-o mais resistente à ação de proteases de diferentes espécies vegetais (Owens & Heutte, 1997). Em virtude da maior estabilidade desse peptídeo à ação de enzimas da planta, este vetor tornou-se bom candidato no desenvolvimento de plantas cítricas transgênicas resistentes a Xylella fastidiosa, causadora da doença clorose variegada dos citros (CVC). Por sua vez, o uso de promotores que confiram expressões dos genes em locais, tempo e intensidade específicos serão prérequisitos em gerações de transgênicos futuras (Harakava, 2000).

Uma alternativa ao desenvolvimento de plantas cítricas transgênicas resistentes à X. fastidiosa é a utilização de promotores cuja expressão de genes ocorre, preferencialmente, nos vasos do xilema, local de colonização desse patógeno. O parênquima do xilema mostra alta atividade da enzima fenilalanina-amônia-liase (PAL), a qual está envolvida na síntese de fenilpropanóides, precursores de lignina. O promotor do gene da PAL2, clonado de Citrus sinensis, variedade Madame Vinous, denominado CsPP, foi utilizado em plantas transgênicas de tabaco e citros, e demonstrou expressões do gene GUS no xilema e em células da epiderme de pecíolos (Azevedo et al., 2006).

O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja 'Valência' (Citrus sinensis (L.) Osbeck), via Agrobacterium tumefaciens, com o gene cecropin MB39 controlado pelo promotor do gene PAL2 de citros (CsPP).

A estirpe de A. tumefaciens C58 foi utilizada. Essa estirpe contém o vetor binário CsPPCEC/2201 (Figura 1), derivado do vetor pCAMBIA 2201 (Harakava, 2000), o qual inclui o gene cecropin MB39, dirigido pelo promotor CsPP e o terminador NOS (nopalina sintase), o gene de seleção nptII e o gene repórter GUS, sob o controle do promotor constitutivo CaMV 35S. Os procedimentos para cultivo de A. tumefaciens, obtenção, seleção e preparo de explantes, e transformação genética de laranja 'Valência' incluíram protocolos anteriormente descritos (Mendes et al., 2002; Almeida et al., 2003).

Gemas adventícias regeneradas foram analisadas por PCR e microenxertadas em citrange 'Carrizo', e aclimatizadas em casa de vegetação. A eficiência de transformação foi calculada pelo número de plantas transgênicas obtidas a partir do número total de explantes (150) utilizados na transformação. A análise da PCR incluiu o uso de primers específicos para a detecção do gene cecropin MB39 (CEC-F: 5' - ATG GGT AAG AAG TCT CAT ATT - 3' e CEC-R: 5' - TCA ACC CAA AGC CTT AG - 3') (Harakava, 2000).

A amplificação do fragmento de 189 pb foi realizada utilizando-se 2 µL de DNA (50–100 ng) extraídos de folhas pelo método CTAB (Doyle & Doyle, 1990), 0,2 µL de dNTPs (10 mM), 0,8 µL de MgCl₂ (25 mM), 2 µL de tampão (10X), 0,3 µL de Taq polimerase (5 U µL^-1) e 0,3 µL dos primers (10 µM), em um volume de reação final de 20 µL. As reações foram realizadas em termociclador (PTC-100^tm, MJ Research, Inc.) com: 94ºC/2 min, 40 ciclos de 94ºC/15 s, 52ºC/30 s, 72ºC/30 s, e 72ºC/4 min. As análises de transferência de Southern foram feitas para confirmação da integração do gene nptII, utilizando-se aproximadamente 60 µg de DNA extraídos de folhas, pelo método CTAB (Doyle & Doyle, 1990), modificado por uma lavagem adicional com fenol e uma com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1).

O DNA foi digerido com a enzima de restrição HindIII, separado em gel de agarose (1%) por eletroforese e transferido para membrana de náilon (Hybond-N⁺, Amersham Biosciences). A sonda para o gene nptII foi preparada por PCR e os fragmentos amplificados foram purificados e submetidos à marcação com o auxílio do kit 'AlkPhos Direct Labelling Reagents' (Amersham Biosciences). As hibridizações foram realizadas a 60ºC e a reação de detecção foi feita com o kit CDP-Star Detection Reagent (Amersham Biosciences).

A transformação e regeneração de plantas de laranja 'Valência' com o vetor CsPPCEC/2201 foi realizada com sucesso. Diversas gemas foram formadas, porém poucas se desenvolveram o suficiente para a microenxertia. No total, 15 plantas foram analisadas por PCR, o que resultou em 11 plantas transgênicas, com eficiência de transformação de 7,3%. A aclimatização do material em casa de vegetação foi realizada para cinco dessas plantas (Figura 2 A). A análise de transferência de Southern com sonda específica para o gene nptII confirmou a integração de pelo menos uma cópia do gene em três plantas transgênicas (Figura 2 B).

Embora algumas espécies já tenham sido transformadas (Montanelli & Nascari, 1991; Jaynes et al., 1993), não há relatos sobre plantas cítricas transgênicas para o gene cecropin, em especial quando dirigido por um promotor específico para xilema. Além disso, a maioria das plantas cítricas transgênicas produzidas em outros trabalhos contém promotores constitutivos (Almeida et al., 2003). O uso de promotores que conferem expressão em tecidos ou células específicas evita uma expressão desnecessária do gene e reduz a possibilidade de interferência no desenvolvimento da planta. Além disso, essa expressão pode ser voltada aos tecidos colonizados pelo patógeno (Harakava, 2000). É o que ocorre no caso da bactéria X. fastidiosa, já que este patógeno coloniza os vasos do xilema.

As plantas obtidas neste trabalho serão submetidas a análises de transferência de Northern, a fim de verificar níveis de transcrição do gene e, então, poderem ser propagadas e submetidas à inoculação da bactéria X. fastidiosa, de modo a analisar a resistência a este patógeno.

Agradecimentos

À Fapesp e ao CNPq, pelo auxílio financeiro; à Capes, pela concessão de bolsa.

Recebido em 9 de agosto de 2007 e aprovado em 17 de outubro de 2007

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Dez 2007
• Data do Fascículo
  Nov 2007

Histórico

• Aceito
  17 Out 2007
• Recebido
  09 Ago 2007