Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais: uma abordagem multifatorial dos métodos

Antimicrobial activity of the essentials oils: a multifactor approach of the methods

DIVULGAÇÃO

Atividade antimicrobiana dos óleos essenciais: uma abordagem multifatorial dos métodos

Antimicrobial activity of the essentials oils: a multifactor approach of the methods

Paula F.C. Nascimento^I; Analuiza C. Nascimento^I; Carolina S. Rodrigues^I; Ângelo R. Antoniolli^II; Patrícia O. Santos^III; Antônio Márcio Barbosa Júnior^III; Rita C. Trindade^III,*

^IDepartamento de Odontologia, Hospital Universitário, Universidade Federal de Sergipe, 49060-100, Aracaju, SE, Brasil

^IIDepartamento de Fisiologia, Laboratório de Farmacologia, Universidade Federal de Sergipe, 49100-000 São Cristóvão, SE, Brasil

^IIIDepartamento de Morfologia, Laboratório de Microbiologia Aplicada, Universidade Federal de Sergipe, 49100-000, São Cristóvão, SE, Brasil

RESUMO

Os dados obtidos na literatura sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais são tratados do ponto de vista experimental, considerando-se uma possível aplicação clínica dos óleos. O presente estudo teve como objetivo analisar os fatores que influenciam na atividade antimicrobiana de óleos essenciais, in vitro, com base nos resultados descritos na literatura. Foi verificado que os testes e avaliações da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais podem ser dificultados pela volatilidade do óleo, sua insolubilidade em água e sua complexidade química. Tais dificuldades tornam os resultados disponíveis na literatura, difíceis de comparar. Por outro lado, os métodos usados diferem largamente e fatores importantes que influenciam os resultados são freqüentemente negligenciados. Assim, após breve levantamento, concluiu-se que alguns fatores devem ser levados em consideração, tais como: a técnica usada, o meio de cultura, densidade do inóculo, o óleo essencial e o emulsificador utilizado. Portanto, para a realização de testes que visam verificar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais, é necessário definir e adotar uma metodologia adequada e bem padronizada.

Unitermos: Óleo essencial, atividade antimicrobiana, métodos.

ABSTRACT

The given data of the literature on the antimicrobial activity of the essential oils are treated from the experimental point of view, and they consider a possible clinical application of the oils. The purpose of this study is to analyze the factors that can influence on antimicrobial activity of essential oils, in vitro, based on preview data from literature. We noticed that the tests and evaluations of the antimicrobial activity of the essential oils can be hindered by the volatility of the oil, its insolubility in water and its chemistry complexity. These details make the results obtained on literature difficult to compare. The used methods differ broadly and important factors that influence the results are frequently neglectful. After a bibliographical rising, we concluded that a large attention should be given to some factors when we work with essential oils: the used technique, the growth medium, the inoculums density, the tested essential oil and the used emulsifying. It’s necessary to define and follow a right and standard methodology to make antimicrobial activity testes of essential oils.

Keywords: Essential oil, antimicrobial activity, methods.

INTRODUÇÃO

Óleos e extratos de plantas há muito tempo têm servido de base para diversas aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de anti-sépticos tópicos. Tal realidade serviu de base para diversas investigações científicas, com vistas na confirmação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais (Almeida et al., 2006; Arruda et al., 2006; Nunes et al 2006; Benkeblia, 2004; Rehder et al., 2004; Claffey, 2003; Seymour, 2003; Arweiler et al., 2000; Fine et al., 2000; Pan et al., 2000).

Para tanto, tem se desenvolvido métodos de investigação in vitro que produzam resultados confiáveis e possam ser reproduzidos e validados. Contudo, essa tarefa tem sido dificultada pelas peculiaridades que os óleos apresentam, quais sejam: volatilidade, insolubilidade em água e complexidade, características que interferem significativamente nos resultados. Por isso, em testes de susceptibilidade microbiana, deve-se levar em consideração a técnica usada, o meio de cultura, o(s) microrganismo(s) e o óleo essencial testados. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo analisar os fatores que influenciam a atividade antimicrobiana de óleos essenciais, in vitro, com base nos resultados descritos na literatura.

Testes de susceptibilidade in vitro

O ressurgimento do interesse nas terapias naturais e o crescimento da demanda de consumo por produtos naturais efetivos e seguros requerem mais dados sobre os óleos e extratos de plantas (De-Souza et al., 2006; Oliveira et al., 2006a; Oliveira et al., 2006b; Lis-Bachin; Deans, 1997;). Vários estudos têm apontado algumas propriedades terapêuticas dos óleos, destacando as seguintes: antiviral, antiespasmódica, analgésica, antimicrobiana, cicatrizante, expectorante, relaxante, anti-séptica das vias respiratórias, larvicida, vermífuga e antiinflamatória (Oyedji; Afolayan, 2006; Lima et al., 2006; Costa et al., 2005; Halcon; Milkus, 2004).

Nos ensaios sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais in vitro é possível verificar uma variedade de metodologias propostas, o que torna a comparação entre esses estudos problemática (Hammer et al., 1999).

Os métodos comumente usados são o de difusão em disco, difusão utilizando cavidades feitas no ágar, diluição em ágar e diluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima - CIM (Nostro et al., 2004; Cimanga et al., 2002; Shafi et al., 2002; Canillac; Mourey, 2001; Takaisi-Kikuni et al., 2000). Os resultados obtidos por cada um desses métodos podem diferir devido a fatores como as variações entre os testes, a exemplo do crescimento microbiano, exposição de microrganismos ao óleo, a solubilidade do óleo ou de seus componentes e o uso e quantidade de emulsificador (Opalchenova; Obreshkova, 2003; Hood et al., 2003; Lambert et al., 2001; Hammer et al., 1999).

Os testes de avaliação antimicrobiana são padronizados pela NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e desenvolvidos para analisar agentes antimicrobianos convencionais como os antibióticos. Nos testes de atividade antimicrobiana de óleos essenciais, a metodologia proposta pelo NCCLS não pode ser seguida à risca, devido às propriedades químicas que estes apresentam. Dessa forma, feitas modificações esses métodos podem ser usados em algumas situações. Na maioria dos estudos, as zonas de inibição formadas pelos óleos são comparadas com aquelas obtidas pelos antibióticos, no entanto, é importante destacar que esses resultados não devem ser simplesmente comparados, pois as particularidades apresentadas pelos óleos, bem como, outras variáveis (técnica usada, o meio de crescimento, o microrganismo teste) devem ser levadas em consideração (Duarte et al., 2005; Nostro et al., 2004; Saeed; Sabir, 2004; Christophe t al., 2000).

As substâncias normalmente testadas pelos métodos propostos pelo NCCLS têm natureza hidrófila e os testes são padronizados para esta condição. Nos ensaios com óleos essenciais, deve-se considerar que os óleos são voláteis, insolúveis em água, viscosos e complexos. Além disso, podem formar uma suspensão turva que impede a determinação visual da eficácia antimicrobiana do óleo, devido à interferência da dissolução insuficiente dos componentes testados, sendo assim, a falta de padronização dos testes de susceptibilidade antimicrobiana tem sido um dos empecilhos encontrados para a realização desse tipo de estudo (Hood et al., 2003).

Outro problema observado é quando se utiliza a técnica de difusão em ágar, pois a difusão irregular dos componentes lipófilos dos óleos resulta em concentrações desiguais do óleo no ágar causando a formação de regiões com atividade antimicrobiana variável e, finalmente, a determinação de um número de bactérias viáveis remanescentes, após a adição do óleo. Desta forma, acredita-se que os métodos disponíveis não favorecem a padronização e a conseqüente reprodução de resultados que efetivamente expressem a realidade, sendo, por isso, incapazes de comparar diretamente a verdadeira atividade dos óleos (Setzer et al., 2004; Sokmen et al., 2004; Hood et al., 2003).

Visando melhorar a qualidade dos procedimentos com óleos essenciais, tornou-se comum a utilização de solventes, detergentes, ou agentes emulsificadores, a exemplo de Tween 20, Tween 80, DMSO (dimetil sulfóxido) e etanol, para facilitar a dispersão dos mesmos através do meio de cultura (Groppo et al., 2002; Baydar et al., 2004; Bruni et al., 2004). As propriedades físicas e químicas desses agentes são importantes para auxiliar na visualização da atividade antimicrobiana dos óleos, no entanto, deve-se levar em consideração que ao se introduzir um agente emulsificador, este está sujeito a possíveis interações com a substância em teste, bem como, possuir atividade antimicrobiana. Esses efeitos podem ser acentuados ou minimizados a depender do modo de preparo da solução óleo-agente emulsificador. Por isso, preconiza-se uma relação adequada entre óleo e emulsificador (Hammer et al., 1999; Janssen et al., 1987).

A interferência do agente emulsificador na susceptibilidade da bactéria ao óleo essencial pode ser explicada pela possível influência que este exerce sobre o crescimento bacteriano e/ou sobre a permeabilidade da membrana celular. Os emulsificadores podem agir antagonica ou sinergicamente aos componentes ativos do óleo. Altas concentrações de Tween, por exemplo, podem aumentar a atividade antibacteriana produzindo resultados falso-positivos ou reduzir a bio-atividade do óleo, esse último efeito é, possivelmente, causado pela formação de micelas que dificultariam o contato direto do óleo com os microrganismos (Takarada et al., 2004; Cox et al., 2000). Para minimizar esses efeitos, alguns autores propuseram que os emulsificadores Tween 20, Tween 80 e outros, sejam utilizados em concentrações que variem entre 0.5 a 20% em solução com óleo. Para o Tween 80 especificamente, preconiza-se a concentração específica de 0,02% a fim de padronizar o método de diluição em caldo para a determinação da concentração inibitória mínima - CIM, estando os valores desta relacionados ao agente emulsificador usado (Hood et al., 2003).

Outros fatores podem interferir nos valores da CIM obtidos através de métodos de difusão e diluição: condições de cultivo (tempo de incubação, temperatura, taxa oxigênio), meio de cultura, concentração das substâncias testadas, dispersão e emulsificação dos agentes utilizados na emulsão óleo-água (Rios; Recio, 2005; Hammer et al., 1999).

Existe um interesse em aumentar o conhecimento sobre as concentrações inibitórias dos óleos essenciais, em busca do equilíbrio entre a aceitabilidade e a eficácia da ação antimicrobiana. A CIM pode ser definida em estudos in vitro e in vivo. Os métodos disponíveis podem ser divididos em grupos: difusão, diluição, impedância e densidade ótica (Tassou et al., 2000). Desses, a diluição mostrou ser o que melhor disponibiliza dados quantitativos, enquanto a difusão em placa de Petri se constitui em um método qualitativo, por isso, esses métodos (diluição e difusão) não são necessariamente comparáveis. Os resultados obtidos por cada um desses métodos podem diferir devido a fatores intrínsecos aos testes.

Na técnica de difusão em disco e em ágar a vantagem é limitada à geração de dados preliminares fornecendo, somente, dados qualitativos, devido a natureza hidrófoba da maioria dos óleos essenciais de plantas, uma vez que essa característica impede a difusão uniforme destas substâncias através do meio contendo ágar (Lambert et al., 2001).

Variação dos microrganismos e óleos essenciais testados

Estudos da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, em sua maioria, não fornecem detalhes sobre a quantidade, o tipo de microrganismo utilizado e o espectro desta atividade, dificultando sua reprodutibilidade e a comparação dos dados. Além disso, a escolha dos microrganismos testados apresenta uma tendência de se utilizar linhagens de diferentes gêneros, o que resulta em uma variação significativa entre o diâmetro dos halos de inibição, tornando difícil a comparação. Por isso, sugere-se que o teste da ação antimicrobiana dos óleos essenciais seja realizado com isolados múltiplos para cada espécie testada (Hammer et al., 2003; Chang et al., 2001; Karaman et al., 2001; Hammer et al., 1999).

Outro fator importante a ser considerado na validação do efeito antimicrobiano do óleo é o conhecimento das particularidades de cada microrganismo, bem como do óleo a ser analisado. Em experimentos com fungos, por exemplo, deve-se levar em conta o tempo de incubação, uma vez que este acontece em torno de dois a quinze dias, o que pode interferir no diâmetro do halo de inibição de alguns óleos, devido à decomposição ou evaporação destes durante o período de teste (Malele et al, 2003; Basim; Basim, 2003; Janssen et al., 1987).

Em relação às particularidades do óleo, algumas pesquisas a respeito de sua composição mostram que mesmo variações genéticas intraespecíficas da espécie vegetal podem alterar o teor do princípio ativo presente no óleo. Ademais, outros fatores, como clima, solo, época e forma de plantio, adubação, uso de agrotóxicos, irrigação, tempo e condições ambientais, proveniência do material da planta (fresco ou seco), técnica de extração, fonte botânica, tratos culturais e colheita e padrões de variação geográfica (latitudes e longitudes) afetam a composição química dos óleos, podendo provocar alterações na atividade antimicrobiana (Sefidkon et al., 2007; Apel et al., 2006; Asekun et al., 2006; Carvalho-Filho et al., 2006; Oliveira et al., 2005; Potzernheim et al., 2006; Telci et al., 2006; Franco et al., 2005; Viljoen et al., 2005; Bassole et al., 2003; Opalchenova; Obreshkova, 2003; Azevedo et al., 2002; Rasooli; Mirmostafa, 2002; Lambert et al., 2001).

Vários estudos têm confirmado a influência dos fatores supracitados como determinantes na ação antimicrobiana dos óleos essenciais, a exemplo de Celiktas et al. (2007) que relacionou o aumento da atividade antimicrobiana do óleo essencial de Rosmarinus officinalis em amostras coletadas na primavera; Moon et al. (2006), verificaram variação significante no tamanho dos halos de inibição quando testaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de diferentes amostras de Lavandula angustifolia frente aos mesmos microrganismos.

A atividade antimicrobiana de um mesmo óleo pode ser, às vezes, bem diferente. Para uma espécie em particular, por exemplo, os valores de CIM determinados para óleos essenciais de quimiotipos de Thymus vulgaris diferem quando se usam outras linhagens de um mesmo microrganismo (Janssen et al., 1987). Tavares et al. (2005) analisou a composição do óleo essencial de três quimiotipos de Lippia alba e encontrou variação qualitativa e quantitativa entre os constituintes químicos.

O volume e a concentração dos óleos são parâmetros que também devem ser observados na avaliação do efeito antimicrobiano, pois podem afetar os resultados do sistema-teste. Por isso, nos estudos em que se utilizam cavidades no meio de cultivo, é necessário que estas contenham um volume mínimo de óleo que possibilite a visualização da inibição. Existe ainda um volume ótimo, a partir do qual não se observa um aumento do diâmetro do halo de inibição. Entretanto, a significância destes volumes na descrição da atividade antimicrobiana de um óleo essencial não é conhecida. Quando cilindros e discos de diâmetros similares são usados para o mesmo óleo, diâmetros de inibição iguais são encontrados. Isto é relevante porque a aplicação de volumes difere largamente (Janssen et al., 1987).

CONCLUSÃO

Existem vários métodos descritos na literatura, propostos para mensurar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. Entretanto, as pesquisas sobre essa atividade têm sido dificultadas pela ausência de métodos padronizados, o que dificulta a comparação entre os estudos além de inviabilizar sua reprodutibilidade. Os métodos diferem largamente e fatores importantes que influenciam os resultados são freqüentemente negligenciados. Importa, portanto, mencionar o número da linhagem do microrganismo testado, o tempo de exposição do microrganismo ao óleo, a utilização de controles positivos e negativos, o uso e a quantidade de emulsificador, a composição do óleo e a descrição precisa das condições em que foi obtido. Sem padronização é praticamente impossível elucidar a verdadeira bio-atividade, o potencial terapêutico e a utilidade clínica dos óleos essenciais, bem como fazer uma comparação direta entre eles.

Recebido em 23/06/06. Aceito em 20/12/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Mar 2007

Histórico

• Aceito
  20 Dez 2006
• Recebido
  23 Jun 2006