Diagnóstico sorológico de infecções por dengue e febre amarela em casos suspeitos no Estado do Pará, Brasil, 1999

Serological diagnosis of dengue and yellow fever infections in suspected cases from Pará State, Brazil, 1999

ARTIGO

Diagnóstico sorológico de infecções por dengue e febre amarela em casos suspeitos no Estado do Pará, Brasil, 1999

Serological diagnosis of dengue and yellow fever infections in suspected cases from Pará State, Brazil, 1999

Tais Pinheiro de Araújo^I,II; Sueli Guerreiro Rodrigues^I; Maria Irene Weyl de A. Costa^II; Pedro Fernando da Costa Vasconcelos^I; Amélia P.A. Travassos da Rosa^III

^ICentro Colaborador da Organização Mundial de Saúde em Arboviroses e Laboratório de Referência Nacional de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas, Belém, PA, Brasil

^IIÁrea de Saúde do Centro de Ensino Superior do Pará, Belém, PA, Brasil

^IIIDepartment of Pathology, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, USA

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

De junho a dezembro de 1999, foram coletadas 785 amostras de soro de pacientes com suspeita clínica de dengue e/ou febre amarela. Os pacientes foram atendidos nas unidades de saúde distribuídas pelas seis mesorregiões do Estado do Pará, Brasil. As amostras de soro foram testadas pelo método de inibição da hemaglutinação para detecção de anticorpos para Flavivirus e pelo ensaio imunoenzimático para detecção de imunoglobulina M para dengue e febre amarela. Das amostras coletadas, 563 (71,7%) foram positivas pelo IH, e dentre estas 150 (26,6%) foram positivas pelo ELISA-IgM. O vírus dengue foi responsável pela maioria das infecções recentes em todas as mesorregiões e os casos de febre amarela detectados neste estudo foram restritos às mesorregiões Marajó e Sudeste.

Palavras-chaves: Flavivirus. Dengue. Febre amarela. Diagnóstico sorológico. Pará. Brasil.

ABSTRACT

From June to December 1999, 785 serum samples were obtained from patients clinically suspected of having dengue or yellow fever. The patients were referred by public health centers distributed within the six mesoregions of Pará State, Brazil. Serum samples were tested for Flavivirus antibodies by hemagglutination inhibition test and for dengue and yellow fever viruses by enzyme-linked immunosorbent assay for IgM detection. Of the sera collected, 563 (71.7%) were positive by HI test and out of these 150 (26.6%) were positive by ELISA-IgM. Dengue virus was responsible for most of the recent infections in all regions; yellow fever cases detected in the current study were restricted to the Marajó and Southeast regions.

Key-words:Flavivirus. Dengue fever. Yellow fever. Serological diagnostic. Pará State. Brazil.

Os vírus dengue (DEN) e febre amarela (FA) são membros do gênero Flavivirus, família Flaviviridae¹⁸. Ambos são importantes arbovírus que causam doença no homem. A introdução do DEN no Estado do Pará ocorreu em 1995, na região sudeste do Estado, nos municípios de Redenção e Rondon do Pará. Os primeiros casos autóctones de dengue no município de Belém, capital do Estado, foram registrados em outubro de 1996, pela detecção de anticorpos IgM para DEN, e em novembro foi isolado e identificado o sorotipo DEN-1¹². Em outubro de 1997 isolou-se o sorotipo DEN-2, que passou a circular simultaneamente com o DEN-1¹³. Casos humanos de febre amarela no Brasil, sobretudo na Amazônia brasileira, são registrados a cada ano em áreas enzoóticas ou epizoóticas, por transmissão silvestre, ocorrendo esporadicamente ou em surtos^{16 17}. A febre amarela silvestre tem sido transmitida pelo mosquito Haemagogus janthinomys, principal vetor no Brasil, e o número de casos tem aumentado nas últimas duas décadas por causa do crescente contacto humano com áreas de floresta^{3 16 17}. A sorologia é essencial no diagnóstico das infecções por Flavivirus e na diferenciação entre infecções primária e secundária. A relação antigênica entre os Flavivirus pode ser demonstrada em ensaios tais como inibição da hemaglutinação (IH) e o ensaio imunoenzimático para detecção de IgM (ELISA-IgM), usando anticorpos policlonal e monoclonal²⁰. Tradicionalmente, o IH tem sido usado para classificar as respostas imunológicas em primárias (aumento gradual de anticorpos a um título moderado) ou secundárias (aumento rápido a títulos elevados), decorrentes de infecções primárias ou secundárias por Flavivirus, respectivamente, visto que detecta imunoglobulinas totais, principalmente IgG, as quais perduram por um longo período de tempo, constituindo um teste ideal para estudos soro-epidemiológicos. Por outro lado, o teste de ELISA-IgM é muito útil no diagnóstico rápido das infecções correntes e/ou recentes por esses agentes, pois usualmente esta imunoglobulina surge na primeira semana após o início dos sintomas, alcança um pico na segunda semana e perdura por 2 a 3 meses. O presente estudo teve como objetivo esclarecer o diagnóstico de casos suspeitos de dengue e/ou febre amarela, decorrentes de demanda passiva ao Instituto Evandro Chagas (IEC), nas mesorregiões que constituem o Estado do Pará.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras. Foram incluídas no estudo um total de 785 amostras de soro decorrentes de demanda espontânea ao IEC, no período de junho a dezembro de 1999, para esclarecimento diagnóstico, sendo dengue a principal suspeita clínica. Os pacientes foram atendidos em unidades de saúde distribuídas pelo Estado do Pará, e também no ambulatório da Seção de Arbovírus do IEC, Belém, PA. Todos os pacientes possuíam fichas clínico-epidemiológicas, porém nem sempre devidamente preenchidas.

Áreas estudadas. Diversos municípios das 6 mesorregiões que compõe o Estado do Pará, localizado na região norte do Brasil, com área de 1.253.164,5 km² e população de 6.188.685 habitantes (4.115.774 na área urbana). As amostras apresentaram a seguinte distribuição segundo as mesorregiões: Baixo Amazonas 29 (3,7%), Marajó 9 (1,1%), Metropolitana 257 (32,7%), Nordeste 126 (16,1%), Sudeste 347 (44,2%) e Sudoeste 17 (2,2%).

Testes sorológicos. Os testes sorológicos empregados foram o IH, utilizando a técnica de Clarke e Casals, modificada por Shope¹⁴, e o ELISA-IgM, técnica descrita por Kuno et al⁷.

No teste de IH os soros foram testados para 8 Flavivirus (grupo B dos arbovírus) causadores de doença humana no Brasil, quais sejam: FA (amostras vacinal e silvestre), Ilhéus (ILH), São Luís (SLE), DEN (sorotipos 1 a 4) e Rocio (ROC); cujos antígenos e respectivos soros homólogos foram preparados no IEC, de acordo com procedimentos padrões^{2 10 14}. As respostas sorológicas foram classificadas como primária ou secundária para Flavivirus, de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS)¹⁹ e Organização Panamericana de Saúde⁸. No ELISA-IgM os soros foram testados contra DEN e FA.

RESULTADOS

Amostras e sorologia. Durante os 7 meses do estudo foram testadas 785 amostras de soro pela técnica de IH. Desse total, 563 (71,7%) reagiram com um ou mais Flavivirus e 222 (28,3%) apresentaram sorologia negativa (Tabela 1). Foi possível identificar 89 (15,8%) respostas primárias, com reação monotípica para FA (68), SLE (9), ILH (6) e DEN (6), e 97 (17,2%) respostas secundárias. As demais amostras ficaram sem interpretação por não se enquadrarem nos critérios de classificação da OMS¹⁹. O teste de ELISA-IgM foi aplicado aos 563 soros positivos por IH e detectou-se 144 (96%) infecções correntes e/ou recentes por DEN e 6 (4%) por FA.

Mesorregiões. Os soros oriundos das várias mesorregiões apresentaram anticorpos inibidores da hemaglutinação, alcançando percentuais de positividade de 79% (203) e 88,9% (8) nas mesorregiões Metropolitana e Marajó, respectivamente (Tabela 1). Pelo ELISA-IgM foram encontrados índices de positividade de 45,8% (93) para DEN na mesorregião Metropolitana, e 37,5% (3) para FA no Marajó, e na mesorregião Sudeste o percentual de positividade foi de 10,9% (27) para DEN e 1,2% (3) para FA (Tabela 2).

A análise dos resultados de ELISA-IgM, em relação ao total de soro de cada mesorregião, revelou positividade para DEN de 3,4% (1) no Baixo Amazonas; 36,2% (93) na Metropolitana; 18,3% (23) no Nordeste e 7,8% (27) no Sudeste. Quanto a FA, 33,3% (3) dos soros do Marajó apresentaram-se positivos, assim como 0,9% (3) da mesorregião Sudeste (Figura 1).

O declínio da positividade para DEN observada entre os resultados dos testes de IH e ELISA-IgM alcançou 93,3% no Baixo Amazonas, 100% no Marajó, 54,2% na Metropolitana, 70,1% no Nordeste e 89,1% no Sudeste. Enquanto para FA o declínio foi de 62,5% no Marajó, 98,8% no Sudeste e de 100% nas demais mesorregiões (Figura 1).

Positividade para DEN e FA por Sexo e Faixa Etária. A positividade para DEN pelo teste de ELISA-IgM foi de 40,3% (58/144) em indivíduos do sexo masculino e de 59,7% (86/144) no sexo feminino (Tabela 3). A análise estatística destes resultados pelo teste de qui-quadrado, com correção de Yates, foi de x²=10,13; p=0,0014. Dos casos de infecção corrente e/ou recente pelo vírus da FA, 66,7% (4/6) ocorreram em pessoas do sexo masculino (x²=0,33; p=0,5637).

De acordo com a faixa etária, encontramos que para DEN o grupo 16-30 anos apresentou positividade de 36,1% (52) do total de 144 pacientes com anticorpos IgM, seguido pelo grupo de 31-45 anos com 28,5% (41) (Tabela 3). No que tange a FA, houve uma positividade de 66,6% (4) na faixa etária de 16-30 anos e 16,7% (1) em cada das faixas etárias de 31-45 e £ 15 anos.

Presença de anticorpos x tempo de doença. As fichas epidemiológicas de 46,5% dos pacientes não continham informação de tempo de doença, sendo classificado como ignorado (Tabela 4). Dentre os pacientes com anticorpos inibidores da hemaglutinação 108 (19,2%) e 207 (36,8%) estavam com £ 5 e ³ 6 dias de doença, respectivamente. Detectou-se anticorpos IgM anti-DEN em 90 (62,4%) e anti-FA em 2 (33,3%) dos pacientes com ³ 6 dias de doença. Anticorpos IgM anti-DEN também foram detectados em 27 (18,8%) dos pacientes com £ 5 dias de doença (Tabela 4).

DISCUSSÃO

A positividade de anticorpos inibidores da hemaglutinação para Flavivirus foi superior a 50% em todas as mesorregiões do Pará (Tabela 1), provavelmente decorrente da ampla circulação do vírus DEN e, também, como conseqüência de resposta vacinal contra o vírus FA. O Estado do Pará pertence a área endêmica de febre amarela silvestre, onde a vacinação anti-amarílica é amplamente administrada. Além disso, a partir de 1998, esta cobertura vacinal foi intensificada em todo o território nacional devido ao risco de reurbanização da FA frente ao aumento da atividade viral em zona endêmica, dispersão e densidade do vetor urbano (Aedes aegypti), bem como a crescente mobilidade da população humana¹⁵. Ademais, a Amazônia brasileira possui condições climáticas favoráveis a par de elevada densidade e diversidade de artrópodes hematófagos e animais silvestres, que constituem os elementos básicos para a manutenção dos arbovírus⁹. A detecção de reações monotípicas por IH, nas diversas mesorregiões, para SLE (9) e ILH (6), Flavivirus encefalitogênicos para o homem, sugere a circulação desses vírus.

Foi confirmado um maior número de infecções pelo DEN nas mesorregiões Metropolitana, Nordeste e Sudeste (Tabela 2), que correspondem a zona mais populosa e desenvolvida do Estado. Nestas mesorregiões, provavelmente, a dispersão do vírus foi favorecida pela maior mobilidade de suas populações, bem como pelo desenvolvimento e proliferação do mosquito Aedes aegypti decorrente de fatores tais como, reurbanização sem infra-estrutura básica de saneamento, coleta inadequada do lixo, desmatamento desordenado¹². O DEN-1 foi introduzido no Estado pela mesorregião Sudeste em 1995 e cerca de 1 ano depois causava epidemia na capital do Estado, na mesorregião Metropolitana.

Um estudo realizado para avaliar os índices de sensibilidade e especificidade, bem como as taxas de falso-negativos e falso-positivos do ELISA-IgM para DEN em relação ao IH¹, demonstrou a correlação de resultados entre ambas as técnicas. Entretanto, na presente investigação sorológica, apesar de muitas amostras procederem de quadros clínicos típicos de dengue, apenas 144 (25,6%) dos pacientes com anticorpos para Flavivirus foram confirmadas como infecção recente para este vírus (Tabela 2).

A detecção de anticorpos IgM pelo ELISA-IgM para DEN quando comparados com a positividade para Flavivirus obtida no IH, revelou um declínio de positividade maior que o esperado (Figura 1), já que esta foi a principal suspeita clínica que motivou a demanda de amostras. O acentuado declínio pode ter sido decorrente de resultados falso-negativos no ELISA-IgM, devido a coleta de soro até o 5^o dia após o início dos sintomas, bem como, por conta de infecção secundária por Flavivirus. Em ambos os casos, pode ocorrer produção de anticorpos IgM a níveis não detectáveis⁷. Além disso, o quadro clínico de alguns pacientes poderia não corresponder a infecção pelo DEN, e, neste caso, os anticorpos inibidores da hemaglutinação detectados seriam decorrentes de infecções anteriores por algum Flavivirus, ou vacinação antiamarílica.

A positividade para DEN (62,4%) entre os pacientes com ³ 6 dias de doença foi bem maior do que entre aqueles com £ 5 dias de doença (18,8%), sendo esta diferença estatísticamente significativa, com x²=65,71; p<0,0001 (Tabela 4). O percentual de positividade de 18,8% observado entre os pacientes com suspeita de DEN e tempo de doença ignorado sugere coleta do soro em momento inadequado para pesquisa de anticorpos IgM (Tabela 4).

A literatura relata um maior número de infecções por DEN em pessoas do sexo feminino, possivelmente devido a um maior tempo de permanência nas residências, e conseqüentemente maior exposição ao vetor⁴. A análise estatística dos resultados obtidos em nosso estudo revelou diferença significativa de infecção entre os sexos (x²=10,13; p=0,0014) mostrando que o risco de transmissão do DEN foi maior nas mulheres. Os resultados mostraram também que todas as faixas etárias foram acometidas, sendo que o grupo mais vulnerável foi o de 16-30 anos, seguido pelo grupo de 31-45 anos (Tabela 3), portanto aqueles com maior atividade produtiva.

Os casos de FA detectados neste estudo ocorreram em indivíduos não imunizados contra FA e residentes em zona rural, nas mesorregiões Marajó e Sudeste, áreas endêmicas do vírus, que freqüentemente registram casos esporádicos de FA silvestre. O elevado declínio de positividade entre o IH e o ELISA-IgM para FA reflete a atuação da vigilância epidemiológica para manter a FA urbana erradicada e a FA silvestre sob controle. Na última década foram registrados cerca de 73 casos de FA silvestre no Estado do Pará⁶, nenhum deles nas mesorregiões Nordeste e Metropolitana. O pequeno percentual de amostras decorrente de pacientes com suspeita de FA foram oriundas, principalmente, das mesorregiões Marajó e Sudeste.

Dos seis casos de FA, quatro ocorreram em pessoas do sexo masculino, o que está de acordo com a literatura⁵. A análise dos casos de FA, segundo a faixa etária dos pacientes (dados não mostrados), identificou um caso entre indivíduos £ 15 anos na mesorregião do Marajó. Este fato pode indicar que as crianças desempenham um papel importante no auxílio aos pais no trabalho, e se infectam quando penetram no nicho de transmissão do vírus, fato já evidenciado em outros estudos^{16 17}. Contudo, pode também significar que na região da Ilha do Marajó, as pessoas foram mais infectadas no domicílio e/ou peridomicílio, já que o deslocamento nessa região é dificultado pela presença de áreas alagadiças e pela limitação do número de barcos e canoas, os principais meios de transporte usados pelas pessoas. Vale ressaltar que em 1984 observou-se um surto no Baixo Amazonas onde registraram-se 31 casos, sendo 7 (22,6%) em mulheres e 5 (16,1%) em crianças, e nesta oportunidade identificou-se um novo vetor de FA silvestre no Brasil, Haemagogus albomaculatus¹¹. Este mosquito tem sido incriminado na transmissão humana peridoméstica na Amazônia Central, visto que apresenta maior autonomia de vôo, podendo chegar ao domicílio e peridomicílio para picar^{3 17}.

Os achados sorológicos sugerem ainda que afora DEN e FA, outros Flavivirus tais como SLE e ILH, circulam na região e podem ser responsáveis por quadros febris agudos sem diagnóstico definido.

AGRADECIMENTOS

A todos os funcionários da Seção de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas/FUNASA/MS que contribuíram para o desenvolvimento deste estudo e ao Dr. Robert Tesh da University of Texas Medical Branch pela revisão do inglês.

Recebido para publicação em 30/5/2001.

Fontes de financiamento: IEC/FUNASA/MS e CNPq

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Fev 2003
• Data do Fascículo
  Dez 2002

Histórico

• Recebido
  30 Maio 2001