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Einstein (São Paulo)

versão impressa ISSN 1679-4508versão On-line ISSN 2317-6385

Einstein (São Paulo) vol.16 no.3 São Paulo  2018  Epub 17-Set-2018

http://dx.doi.org/10.1590/s1679-45082018ao4206 

Artigo Original

Análise do tecido muscular de ratos Wistar submetidos ao modelo de compressão do nervo isquiático e à crioterapia

Jhenifer Karvat1 
http://orcid.org/0000-0002-3714-0002

Camila Mayumi Martin Kakihata1 
http://orcid.org/0000-0002-1586-4720

Lizyana Vieira1 
http://orcid.org/0000-0003-3881-896X

José Luis da Conceição Silva1 
http://orcid.org/0000-0002-5460-8797

Lucinéia de Fátima Ribeiro Chasko1 
http://orcid.org/0000-0001-5174-7399

Rose Meire Costa Brancalhão1 
http://orcid.org/0000-0002-5344-5076

Gladson Ricardo Flor Bertolini1 
http://orcid.org/0000-0003-0565-2019

1Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, PR, Brasil

RESUMO

Objetivo:

Avaliar os efeitos da compressão nervosa do isquiático direito e da crioterapia no tecido muscular.

Métodos:

Foram utilizados 42 ratos Wistar machos, subdivididos nos Grupos Controle, Lesão 3, Lesão 8 e Lesão 15, submetidos a compressão nervosa e eutanasiados, respectivamente, no 3°, 8° e 15° dias pós-operatório; Lesão Crioterapia 3, tratado com crioterapia, por imersão durante 20 minutos, por 1 dia, e eutanasiados no 3° dia pós-operatório; e Lesão Crioterapia 8 e Lesão Crioterapia 15, tratados durante 6 dias e eutanasiados no 8° e 15° dias pós-operatório. A avaliação funcional foi realizada pela força de preensão do membro pélvico direito. Os músculos tibiais anteriores direitos foram avaliados quanto a massa, menor diâmetro e área de secção transversa. Em Lesão Crioterapia 8 e Lesão Crioterapia 15, foi dosada a hidroxiprolina nos sóleos direitos.

Resultados:

Na preensão, houve diferença significativa nos Grupos Lesão quando comparados ao Grupo Controle (p<0,05). No menor diâmetro, o Grupo Controle foi maior que Lesão 8 (p=0,0094), Lesão 15 (p = 0,002) e Lesão Crioterapia 15 (p<0,001). Na comparação entre os grupos com eutanásia no mesmo pós-operatório, houve diferença significativa (p=0,0363) no 8° pós-operatório, sendo Lesão Crioterapia maior que Lesão. Na área das fibras, o Grupo Controle também foi maior que Lesão 8 (p=0,0018), Lesão 15 (p<0,001) e Lesão Crioterapia 15 (p<0,001). Na hidroxiprolina, não houve diferença significativa entre os grupos.

Conclusão:

A lesão nervosa resultou na diminuição da força e em trofismo muscular, e a crioterapia retardou a hipotrofia, porém este efeito não se manteve após o tratamento cessar.

Descritores: Músculos; Compressão nervosa; Crioterapia; Ratos Wistar

As neuropatías periféricas dos membros inferiores são lesões comuns, geralmente associadas a traumas e procedimentos cirúrgicos. Estas lesões têm um impacto significativo sobre a mobilidade e a função do paciente, tornando-se de grande relevância econômica para a sociedade.(13) O modelo mais utilizado para estudar esta lesão é a compressão do nervo isquiático em ratos, pois, além de mimetizar a neuropatia compressiva mais comum do membro inferior, é de fácil acesso cirúrgico.(2,4)

O modelo de compressão do nervo isquiático pode levar a alterações de sensibilidade, bem como à hipotrofia muscular, observada a partir do terceiro dia de pós-operatório (PO) até cerca de 20 dias após o procedimento. Cerca de 30 dias após, o músculo e nervo já se recuperaram espontaneamente, impossibilitando a observação destes efeitos.(58) No entanto, quando há hipotrofia muscular, tal tecido pode ser substituído por conjuntivo, formado principalmente por colágeno, o que resulta em perda da função, quando a regeneração nervosa não ocorre adequadamente.(9)

Uma das formas de tratamento das compressões nervosas é o uso das modalidades fisioterapêuticas, como a crioterapia, que é aplicação do frio de 0°C a 18,3°C,(10) a qual reduz o fluxo sanguíneo local, a taxa metabólica e a velocidade de condução do nervo periférico. Estas alterações resultam na diminuição da reação inflamatória no trauma agudo, dor e formação de edema.(11) O tempo de crioterapia, por meio da técnica de imersão, é de cerca de 20 minutos, para atingir seus efeitos terapêuticos, pois resfria uma área maior em comparação com as outras modalidades.(10,1214)

Visto que a crioterapia é uma modalidade terapêutica de fácil acesso e baixo custo,(11) tornam-se relevantes estudos que verifiquem sua eficácia na alteração funcional e estrutural do tecido muscular decorrente de uma lesão nervosa.

OBJETIVO

Avaliar os efeitos do modelo experimental de compressão nervosa e crioterapia, no tecido muscular de ratos Wistar.

MÉTODOS

Foram utilizados 42 ratos machos da linhagem Wistar, com 10 semanas de idade, obtidos do Biotério Central da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Campus de Cascavel, no início do segundo semestre de 2015, com análises até o segundo semestre de 2016. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno, com ciclo claro/escuro de 12 horas, temperatura controlada 24ºC±1ºC, com acesso livre à água e ração.

Os animais foram separados aleatoriamente em sete grupos (n=6/grupo), a saber: Grupo Controle (C), composto por animais que não foram submetidos a compressão nervosa e nem à crioterapia, eutanasiados no 15° dia após início do experimento; Grupos Lesão 3, 8 e 15 (L3, L8 e L15), submetidos à compressão nervosa e eutanasiados no 3°, 8° e 15° PO; Grupo Lesão Crioterapia 3 (LCrio3), submetido à compressão nervosa e à crioterapia durante 1 dia, sendo eutanasiados no terceiro PO; Grupo Lesão Crioterapia 8 e 15 (LCrio8 e LCrio15), submetidos à compressão nervosa e à crioterapia durante 6 dias, eutanasiados no 8° e 15° PO.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal e Aulas Práticas da UNIOESTE, protocolo 06611 (15/07/2014), e conduzido segundo as normas internacionais de ética em experimentação animal.

Prévio ao procedimento cirúrgico de compressão do nervo isquiático, os animais foram pesados e anestesiados com cloridrato de quetamina (95mg/kg) e cloridrato de xilazina (12mg/kg) por via intraperitoneal. Após a aplicação da anestesia, foi realizada a verificação do estado de consciência (ausência de resposta motora ao pinçamento da cauda e das pregas interdigitais), em seguida, eles foram posicionados em decúbito ventral, para realizar a tricotomia no local do procedimento cirúrgico.

Posteriormente, foram realizadas a incisão, para expor o nervo isquiático direito, e a subsequente compressão nervosa, com uma pinça hemostática, durante 30 segundos. A pressão de pinçamento foi padronizada para todos os animais, utilizando-se como referência o segundo dente da cremalheira.(15) Por fim, foi realizada a sutura da pele do animal com fio catgut 4.0.

Os animais foram posicionados com o membro posterior direito imerso em recipiente de 1.440cm3 (20cmx 12cmx6cm), contendo água e gelo, em temperatura de 5°C±2°C, durante 20 minutos.(16) O primeiro tratamento foi realizado nos grupos LCrio3, LCrio8 e LCrio15 após o término do procedimento cirúrgico de compressão nervosa. A partir do 3° PO a crioterapia foi retomada e realizada em dias consecutivos, até o sétimo PO, somente nos grupos LCrio8 e LCrio15.

Para os Grupos L3, L8 e L15, os animais foram posicionados dentro do recipiente sem água por 20 minutos, para mimetizar o estresse causado pela manipulação do animal. Os dias de manipulação dos Grupos L3, L8 e L15 correspondem, respectivamente, aos dias de tratamento com crioterapia dos grupos LCrio3, LCrio8 e LCrio15.

Para a avaliação da função muscular, foi utilizado um medidor de força de preensão.(17) O teste foi adaptado para avaliar a força de preensão do membro pélvico direito. Os animais foram segurados gentilmente pelo dorso e permitiu-se que eles agarrassem com a pata posterior direita em uma grade conectada a um transdutor de força. O animal foi tracionado com firmeza crescente, até ele perder a preensão, registrando, neste momento, a força máxima exercida, gravada no equipamento. Em cada avaliação, o teste foi repetido três vezes, e foi utilizado o valor médio.

Foi realizado um tempo de adaptação e treino com todos os animais 3 dias prévios à lesão nervosa. O teste foi realizado antes da compressão do isquiático, para obtenção dos valores basais (AV1) e no 2° dia após a compressão do nervo para todos os grupos (AV2); posteriormente, foi realizada uma terceira avaliação (AV3), no 3° PO, para os Grupos C, L3 e LCrio3; no 8° PO, para os Grupos C, L8 e LCrio8; e 15° PO, para os Grupos C, L15 e LCrio15, sendo realizado sempre pelo mesmo avaliador.

Após o período de intervenção de cada grupo, os animais foram pesados, devidamente anestesiados e eutanasiados em guilhotina. Em seguida, o músculo tibial anterior direito foi dissecado, pesado e fixado em Metacarn por 24 horas, seguindo o processamento histológico de rotina para inclusão em parafina: desidratação em uma série crescente de álcool; diafanização em xilol; infiltração na parafina histológica; e emblocamento para obtenção de cortes transversais.

Os músculos foram cortados com espessura de 7μm e corados em hematoxilina e eosina (HE). Foram fotomicrografados dez campos com objetiva de 40x e, posteriormente, foram analisadas quanto ao menor diâmetro e a área, de cem fibras por músculo, pelo programa Image-Pro-Plus 6.0, além disto, foram analisados quanto à morfologia geral do tecido.

A hidroxiprolina é o principal componente do colágeno, e a medição de seus níveis pode ser utilizada como um indicador do teor de colágeno. A análise foi realizada no músculo sóleo direito, nos Grupos L8, L15, LCrio8 e LCrio15. Para isto, o músculo foi coletado, congelado em nitrogênio líquido e homogeneizado, e as dosagens seguiram conforme instruções do fabricante (Sigma-Aldrich®, número do catálogo MAK008).

Análise estatística

Os resultados foram expressos em média e desvio padrão. Os dados foram avaliados quanto à sua normalidade pelo teste Shapiro-Wilk e, posteriormente, foi utilizada análise de variância (ANOVA) unidirecional, seguida do pós-teste LSD (teste t), comparando os grupos nos diferentes momentos. Foi considerado significativo quando p<0,05. Para tais análises, foi utilizado o programa Bioestat 5.0.

RESULTADOS

De acordo com a análise da força de preensão, verificou-se que, para os valores basais, não havia diferença significativa entre os grupos [F(6; 35)=1,6; p=0,181)]. No entanto, para a AV2, houve diferenças [F(6; 35)=34,7; p<0,001)], e todos os grupos apresentaram menor força do que o C. Tal fato repetiu-se para a AV3, independente se a comparação foi do 3° PO [F(2; 15)=6,3; p=0,007)], 82 PO [F(2; 15)=6,5; p=0,009)] ou 152 po [F(2; 15)=6,5; p=0,009)] (Tabela 1). Houve diminuição da força de preensão após a lesão, independente do tratamento com crioterapia, e ela não retornou aos valores basais.

Tabela 1 Força de preensão dos Grupos Controle (C), Lesão (L3, L8 e L15) e tratados com crioterapia (LCrio3, LCrio8 e LCrio15) 

Avaliação C L3 LCrio3 L8 LCrio8 L15 LCrio15
1 72,7±32,5 64,1±36,5 53,9±16,4 41,8±18,9 33,6±10,3 43,2±29,6 57,7±31,5
2 51,3±17,1 6,1±8,7* 0±0* 0±0* 0±0* 0±0* 0±0*
3 66,2±20,7 18,7±29,1* 0±0* 0±0* 0±0* 0±0* 0±0*

*Diferença significativa comparado ao Grupo Controle. Resultados expressos como média e desvio padrão.

Para a variável do peso do músculo tibial anterior, houve diferença significativa no Grupo C [F(6; 35)=39,7; p<0,001)], que apresentou média maior que os demais grupos. Não houve diferença entre os grupos eutanasia-dos no mesmo PO. Entre os grupos submetidos somente à lesão nervosa, foi observada diferença significativa, sendo a média de L3 maior que às dos Grupos L8 e L15. O mesmo ocorreu nos grupos lesionados e tratados com crioterapia: a média de LCrio3 foi maior que LCrio8 e LCrio15 (Tabela 2).

Tabela 2 Peso dos músculos tibial anterior de ratos Wistar 

Controle Pós-operatório Lesão Lesão Crioterapia
0,812±0,264 0,584± 0,049* 0,544±0,032*
0,397±0,033* 0,442±0,043*
15° 0,359±0,012* 0,347 ± 0,014*

*Diferença em relação ao Grupo Controle;

diferença em relação ao Grupo Lesão 3;

diferença em relação ao Grupo Lesão Crioterapia 8. Resultados expressos como média e desvio padrão.

Nas mensurações morfométricas para a análise do menor diâmetro das fibras musculares do tibial anterior, houve diferença significativa [F(6;35)=54,0; p=0,001]; sendo o Grupo C maior que L8 (p=0,009), L15 (p=0,002) e LCrio 15 (p<0,001). Na comparação entre os grupos com eutanásia no mesmo PO, houve diferença significativa (p=0,036) no oitvao PO, e o grupo com LCrio foi maior que o Grupo L (Tabela 3).

Tabela 3 Diâmetro da fibra do músculo tibial anterior de ratos Wistar 

Controle Pós-operatório Lesão Lesão Crioterapia
37,61±4,58 34,71±2,72 37,08±2,54
31,85±3,16* 36,07±4,01
15° 30,33±2,42* 30,08±3,44*

*Diferença em relação ao Grupo Controle;

diferença com relação ao Grupo Lesão 8. Resultados expressos como média e desvio padrão.

Na análise da área das fibras musculares do tibial anterior, também houve diferença significativa [F(6;35)=83,7; p<0,001], sendo o Grupo C maior que L8 (p=0,002), L15 (p<0,001) e LCrio 15 (p<0,001). Não houve diferença entre os grupos eutanasiados no mesmo PO (Tabela 4).

Tabela 4 Média e desvio padrão da área das fibras musculares do tibial anterior de ratos Wistar 

Controle Pós-operatório Lesão Lesão Crioterapia
1.726±400 1.465±188 1.732 ± 245
1.190±170* 1.469±332
15° 1.005±163* 1.095±161*

*Diferença em relação ao grupo controle. Resultados expressos como média e desvio padrão.

O tecido muscular, em C, apresentou padrão fascicular normal, com alta celularidade e ricamente suprido por vasos sanguíneos no conjuntivo do endomísio, perimísio e epimísio. As fibras musculares apresentaram formato poligonal, aproximadamente hexagonal, com células individuais amoldadas umas às outras, núcleos periféricos e capilares sanguíneos íntegros no endomísio (Figura 1). Estas mesmas características morfológicas foram observadas em L3, LCrio3 e LCrio8 (Figura 2A; 2B e 2D). Os grupos L8, L15 e LCrio 15 apresentaram grande quantidade de fibras musculares polimórficas, com aparente diminuição no tamanho, porém houve manutenção do posicionamento periférico dos núcleos celulares (Figura 2C; 2E e 2F).

Figura 1 Fotomicrografía do músculo tibial anterior de ratos Wistar do Grupo Controle, corte transversal, coloração hematoxilina e eosina, 1000x. Barra de 10μm. Fibras musculares (fm) com formato poligonal, núcleos periféricos (N) e padrão fascicular normal. Capilar sanguíneo (seta) no conjuntivo do endomísio 

Figura 2 Fotomicrografias do músculo tibial anterior de ratos Wistar, corte transversal, coloração hematoxilina e eosina, 1.000x. Barra de 10μm Grupos: (A) Lesão 3, (B) Lesão Crioterapia 3, (C) Lesão 8, (D) Lesão Crioterapia 8, (E) Lesão 15, (F) Lesão Crioterapia 15. Em Lesão 3, Lesão Crioterapia 3 e Lesão Crioterapia 8, é possível visualizar o padrão fascicular normal do tecido, fibras musculares (fm) com formato poligonal, núcleos periféricos e capilares sanguíneos íntegros (setas) no conjuntivo (A, B e D). Enquanto que Lesão 8, Lesão 15 e Lesão Crioterapia 15 apresentaram grande quantidade de fibras musculares polimórficas, com aparente diminuição de seu tamanho, porém mantiveram o posicionamento periférico dos núcleos celulares (n) (C, E e F) 

Na análise da hidroxiprolina, que não houve diferença significativa [F(3; 15)=1,1; p-0,379)] entre L e LCrio eutanasiados no 8º e 15º PO (Tabela 5).

Tabela 5 Dosagem de hidroxiprolina no músculo sóleo 

Pós-operatório Lesão Lesão Crioterapia
0,076±0,03μg/μL 0,12±0,07μg/μL
15° 0,11±0,07μg/μL 0,06±0,04μg/μL

DISCUSSÃO

As lesões nervosas periféricas afetam diretamente o tecido muscular, uma vez que interrompem a comunicação neuromuscular(18) e resultam em perda da função do órgão inervado,(19) com consequente redução da área de secção transversa e do diâmetro das fibras musculares,(20) No presente estudo, as alterações na estrutura muscular, como diminuição do peso, diâmetro e área muscular, foram observadas nos grupos lesionados a partir do 8° PO, mas, quando realizada a crioterapia, elas foram observadas apenas no 15° PO, denotando que esta modalidade fisioterapêutica desacelerou a instalação da atrofia muscular.

Poucas horas após a lesão nervosa, ocorre a liberação de mediadores inflamatórios por mastócitos, como a histamina e quimiocinas, que contribuem para o recrutamento de outras células inflamatórias e, consequentemente, para o desenvolvimento de hiperalgesia.(7) Tal hiperalgesia e a alteração da inervação muscular resultam na diminuição da utilização do membro acometido, gerando atrofia muscular. Desta forma, a crioterapia pode ter resultado em redução da condutibilidade nervosa e, assim, produzido efeitos anti-inflamatórios, com a diminuição da liberação dos fatores álgicos,(11) o que pode ter evitado o desuso do membro do animal, prevenindo a hipotrofia muscular.

Os momentos de eutanásia propostos no presente estudo foram no 3° e 15° PO, pois, a partir de 3 dias após a lesão nervosa periférica, já são observadas características de hipotrofia muscular;(5) com 2 semanas de lesão, a degeneração walleriana é bem documentada,(15) ou seja, a ocorrência de alterações com vistas à redução da hipotrofia poderia ser computada à crioterapia.

Após o cessar da crioterapia, observou-se a instalação de quadro de atrofia muscular, possivelmente decorrente do desuso do membro pélvico e de hiperalgesia, que, para o modelo proposto, atingiram ápice por volta do 14° PO.(7) Infere-se assim que, se o protocolo de crioterapia não fosse descontinuado, poderia ter ocorrido a manutenção do trofismo muscular. Sugerem-se novas pesquisas com a utilização de protocolos mais extensos de crioterapia.

A crioterapia tem sido relatada como uma forma de preservar a integridade neuronal após lesão, como apresentado por Cruz et al.,(21) que utilizaram tal modalidade associada à alcalinização do tecido em animais submetidos à lesão por isquemia prolongada. Esta associação terapêutica foi eficaz na preservação de neurônios do gânglio da raiz dorsal. Já Kawamura et al.,(22) também avaliando os efeitos da crioterapia em animais submetidos à isquemia, observaram que a crioterapia, aplicada durante o período de isquemia, foi eficaz na proteção neuronal - fato que não ocorreu quando esta foi utilizada durante a reperfusão.

Além das alterações estruturais, a lesão nervosa periférica resulta em alteração funcional, observada pela diminuição da força, que foi evidenciada no presente estudo. Ela pode ocorrer por alterações na estrutura do músculo e/ou neurais.(9) É provável que a diminuição da força, neste estudo, foi decorrente das alterações neurais, pois, após uma lesão nervosa traumática, ocorre alteração na eletromiografia e redução do recrutamento de unidades motoras sadias.(23) Ressalta-se que a diminuição da força pode ter sido decorrente da alteração neural, e não por alterações na estrutura muscular, pois ocorreu em todos os grupos no mesmo período, a partir do segundo PO, enquanto que as alterações na estrutura muscular começaram em momentos diferentes, dependendo do uso da crioterapia.

Embora o processo regenerativo esteja previsto, o período de doença implica em perdas funcionais e estruturais, justificadas pela desnervação parcial. Tais prejuízos funcionais são caracterizados, principalmente, pela redução do tônus muscular e, consequentemente, de sua capacidade de gerar força.(24) Após a lesão nervosa, além das alterações morfológicas descritas, observam-se também modificações na excitabilidade muscular(25) e aumento da densidade do tecido conjuntivo,(24) embora em modelos experimentais nem sempre tal fato ocorra.(20)

A lesão nervosa leva à interrupção da comunicação neuromuscular.(26,29) No presente estudo, a ausência do estímulo alterou a morfologia do músculo tibial anterior dos animais do grupo lesão, revelando características típicas de dano muscular causado por desnervação como fibras musculares polimórficas, com aparente diminuição de seu tamanho, o que leva ao comprometimento da funcionalidade do tecido.(28)

Devido às alterações apresentadas no 8° PO, foi realizada análise complementar do tecido conjuntivo por meio da quantificação de hidroxiprolina, apenas nos grupos lesados e tratados, do 8° e 15° PO do músculo sóleo, mas não houve diferença significativa. Apesar de serem músculos com estrutura e função diferentes, ambos recebem inervação do nervo tibial, que é um ramo do nervo isquiático.(4)

A hidroxiprolina atua como um marcador biológico do catabolismo/anabolismo do colágeno do aparelho locomotor.(29) Existe, na literatura, um consenso no que se refere à identificação da concentração de colágeno, relacionado aos componentes bioquímicos, que, por sua vez, são determinantes na regeneração dos danos pelo aumento da bioatividade molecular.(30) Desta forma, observou-se que não houve diferença na deposição de colágeno entre o grupo tratado e aquele apenas lesão, mas ressalta-se que, por dificuldades técnicas, não foi realizada tal avaliação no Grupo C (outra limitação), sugerindo-se que, em futuros estudos, seja realizada tal comparação. Destaca-se ainda, como limitação, a ausência de avaliação de marcadores inflamatórios, tanto sistêmicos quanto locais, no tecido muscular, mediados pelo processo de inflamação neurogênica,(31,32) sendo indicado para que futuros estudos possam explorar tais avaliações, bem como possam ser realizadas pesquisas envolvendo seres humanos com lesões nervosas periféricas, de forma aguda e em curto prazo.

CONCLUSÃO

A lesão nervosa resultou na diminuição da força e trofismo muscular (peso, diâmetro e área). A crioterapia retardou a hipotrofia durante sua aplicação, porém não ocorreu a manutenção deste efeito após o tratamento cessar.

AGRADECIMENTOS

À Fundação Araucária, Curitiba, PR, Brasil, pelo apoio financeiro ao estudo.

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Recebido: 13 de Julho de 2017; Aceito: 26 de Outubro de 2017

Autor correspondente: Jhenifer Karvat, Rua Universitária, 2.069 - Jardim Universitário, CEP: 85819-110 - Cascavel, PR, Brasil Tel.: (45) 3220-3157 E-mail: jhennykarvat@hotmail.com

Conflitos de interesse:

não há.

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