Manifestações Endócrinas das Mutações da Proteína Gsalfae do Imprinting do Gene GNAS1

Gsalpha Protein Mutations and Imprinting of the GNAS1 Gene

Resumos

Esta revisão resume o papel da patogênese molecular das mutações do gene da proteína Gsalfa em doenças endócrinas. As proteínas G transmitem o sinal celular de receptores de membrana 7TM. Este sistema pode ser ativado por fotons de luz, odorantes e hormônios (LH, FSH, TSH, PTH, etc). Seu efetor é a adenilato-ciclase que induz a formação de AMPc. A proteína G inativa é heterotrimérica e associada ao GDT. Receptores que ativam a proteína Gsalfa dissociam o GDT para GTP, enquanto a atividade intrínseca GTPase hidrolisa o GTP, mantendo a proteína Gsalfa no estado inativo, ligado ao GDP. Mutações no gene GNAS1, que codifica a proteína Gsalfa, alteram sítios altamente conservados (Arg201 e Gln227), críticos para a atividade GTPase, levando à ativação constitutiva do sinal celular. Tais mutações são encontradas em raros tumores endócrinos, na fibrodisplasia óssea e na síndrome de McCune Albright. Ao contrário, mutações inativadoras podem levar à osteodistrofia hereditária de Albright, se transmitidas pelo alelo paterno e pseudohipoparatireoidismo tipo Ia, se transmitidas pelo alelo materno. Em ratas com knockout, o gene Gnas sofre o fenômeno de imprinting tecido específico. Em tumores de hipófise, o gene GNAS1 também sofre imprinting com expressão preferencial do alelo materno. No pseudohipoparatireoidismo tipo Ib, um defeito do imprinting na região promotora do exon 1A do gene GNAS1 parece justificar a resistência renal isolada ao PTH. Estes exemplos ilustram como defeitos da proteína Gsalfa podem ser responsáveis pela patogênese molecular de diferentes doenças endócrinas.

Proteína Gsalfa; Gene GNAS1; Mutações; Imprinting

This review summarizes the role of the molecular pathogenesis of Gsalpha protein gene in endocrine disease. G proteins transmit the cellular signal of 7 transmembrane receptors (7TM). Agonists as light photons, odorants and hormones (LH, FSH, TSH, PTH, etc) can activate the system. The effector of Gsalpha protein is adenyl-cyclase, which induces the formation of cAMP. The receptors that activate Gsalpha protein dissociates GDT into GTP, while the intrinsic GTPase activity hydrolyses GTP, keeping Gsalpha protein in its inactive state, bound to GDP. Mutations in the GNAS1 gene, which codifies the Gsalpha protein, alter highly conserved sites (Arg201 and Gln227) that are critical for GTPase activity, leading to the constitutive activation of cell signaling. Such mutations are found in rare endocrine tumors, bone fibrodysplasia and McCune Albright syndrome. Conversely, inactivating mutations can lead to Albright hereditary osteodystrophy or pseudohypoparathyroidism type Ia, when transmitted by the paternal or maternal alleles, respectively. In knockout female mice the Gnas gene exhibits the phenomenon of tissue-specific imprinting. In pituitary tumors the GNAS1 gene also undergoes imprinting, when expressed preferably by the maternal allele. In pseudohypoparathyroidism type Ib, a defect of imprinting in the promoter region of exon 1A of GNAS1 gene appears to justify the isolated renal resistance to PTH. These examples illustrate how defects in Gsalpha protein can be responsible for the molecular pathogenesis of different endocrine disorders.

Gsalpha protein; GNAS1 gene; Mutations; Imprinting

revisão

Manifestações Endócrinas das Mutações da Proteína Gsa e do Imprinting do Gene GNAS1

Maria Candida

B. Villares Fragoso

Laboratório de Hormônios e Genética Molecular -

LIM/42, Disciplina de

Endocrinologia, Departamento

de Clínica Médica, Hospital

das Clínicas da Faculdade

de Medicina da Universidade

de São Paulo, SP

Recebido em 02/07/2002

Revisado em 25/07/2002

Aceito em 30/07/2002

RESUMO

Esta revisão resume o papel da patogênese molecular das mutações do gene da proteína G_sa em doenças endócrinas. As proteínas G transmitem o sinal celular de receptores de membrana 7TM. Este sistema pode ser ativado por fotons de luz, odorantes e hormônios (LH, FSH, TSH, PTH, etc). Seu efetor é a adenilato-ciclase que induz a formação de AMPc. A proteína G inativa é heterotrimérica e associada ao GDT. Receptores que ativam a proteína G_sa dissociam o GDT para GTP, enquanto a atividade intrínseca GTPase hidrolisa o GTP, mantendo a proteína G_sa no estado inativo, ligado ao GDP. Mutações no gene GNAS1, que codifica a proteína G_sa, alteram sítios altamente conservados (Arg²⁰¹ e Gln²²⁷), críticos para a atividade GTPase, levando à ativação constitutiva do sinal celular. Tais mutações são encontradas em raros tumores endócrinos, na fibrodisplasia óssea e na síndrome de McCune Albright. Ao contrário, mutações inativadoras podem levar à osteodistrofia hereditária de Albright, se transmitidas pelo alelo paterno e pseudohipoparatireoidismo tipo Ia, se transmitidas pelo alelo materno. Em ratas com knockout, o gene Gnas sofre o fenômeno de imprinting tecido específico. Em tumores de hipófise, o gene GNAS1 também sofre imprinting com expressão preferencial do alelo materno. No pseudohipoparatireoidismo tipo Ib, um defeito do imprinting na região promotora do exon 1A do gene GNAS1 parece justificar a resistência renal isolada ao PTH. Estes exemplos ilustram como defeitos da proteína G_sa podem ser responsáveis pela patogênese molecular de diferentes doenças endócrinas. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4:372-380)

Descritores: Proteína G_sa; Gene GNAS1; Mutações; Imprinting

ABSTRACT

Gs a Protein Mutations and Imprinting of the GNAS1 Gene.

This review summarizes the role of the molecular pathogenesis of G_sa protein gene in endocrine disease. G proteins transmit the cellular signal of 7 transmembrane receptors (7TM). Agonists as light photons, odorants and hormones (LH, FSH, TSH, PTH, etc) can activate the system. The effector of G_sa protein is adenyl-cyclase, which induces the formation of cAMP. The receptors that activate G_sa protein dissociates GDT into GTP, while the intrinsic GTPase activity hydrolyses GTP, keeping G_sa protein in its inactive state, bound to GDP. Mutations in the GNAS1 gene, which codifies the G_sa protein, alter highly conserved sites (Arg²⁰¹ and Gln²²⁷) that are critical for GTPase activity, leading to the constitutive activation of cell signaling. Such mutations are found in rare endocrine tumors, bone fibrodysplasia and McCune Albright syndrome. Conversely, inactivating mutations can lead to Albright hereditary osteodystrophy or pseudohypoparathyroidism type Ia, when transmitted by the paternal or maternal alleles, respectively. In knockout female mice the Gnas gene exhibits the phenomenon of tissue-specific imprinting. In pituitary tumors the GNAS1 gene also undergoes imprinting, when expressed preferably by the maternal allele. In pseudohypoparathyroidism type Ib, a defect of imprinting in the promoter region of exon 1A of GNAS1 gene appears to justify the isolated renal resistance to PTH. These examples illustrate how defects in G_sa protein can be responsible for the molecular pathogenesis of different endocrine disorders. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4:372-380)

Keywords: G_sa protein; GNAS1 gene; Mutations; Imprinting

EM 1969, FOI SUGERIDO por Martin Rodbell e cols (1,2) que uma série de hormônios atuavam através de receptores específicos denominados de "discriminadores", os quais estimulavam a adenilato-ciclase e amplificavam o sinal celular, num sistema denominado de "transdutor". O "transdutor" comum a todos estes hormônios foi posteriormente caracterizado como sendo a família das proteínas ligadas ao nucleotídeo guanina, genericamente conhecidas como proteínas G (1,2).

Os receptores que transmitem o sinal celular via proteínas G possuem algumas características comuns em relação à sua estrutura. Apresentam uma região amino-terminal extracelular, uma região transmembrana com 7 domínios hidrofóbicos (a-hélices) ligados por 3 alças extracitoplasmáticas e 3 alças intracitoplasmáticas. Por apresentarem sete domínios transmembrana são também conhecidos como receptores 7TM. Estes receptores formam a maior família de proteínas do organismo com mais de 1000 diferentes membros identificados, participando juntamente com as proteínas G de um sofisticado sistema de transdução do sinal celular (3-6). Existem inúmeros ligantes extracelulares que podem causar uma mudança na conformação do receptor, expondo as a-hélices e ativando as proteínas G, tais como: fóton de luz, odorantes, hormônios, neurotransmissores, nucleotídeos, proteases e íons. Os efetores celulares, regulados via proteínas G são: adenilato-ciclase, as isoformas de fosfatidilinositol, fosfolipase Cb, fosfodiesterases dependentes de GMPc e canais iônicos (Na⁺ K⁺, Ca ²⁺) (7).

Apresentaremos nesta revisão alguns aspectos da estrutura e função das proteínas G, bem como doenças endócrinas causadas por mutações ativadoras e inativadoras no gene GNAS1, que codifica a proteína Gsa, e o mecanismo de imprinting deste gene.

Classificação das proteínas G

As proteínas G, fazem parte de uma superfamília com mais de 50 membros descritos, e representam a chave intermediária do sinal celular dos receptores de membrana 7TM (8,9). Elas podem ser divididas em dois grupos com base no seu peso molecular: um grupo de baixo peso molecular, entre 20 e 50Kd, presente em todas as células eucariontes, melhor representada pela família do protooncogene ras e um grupo de alto peso molecular entre 80 e 90Kd relacionado à transdução do sinal celular (9). Todas as proteínas G de alto peso molecular são heterotriméricas constituindo-se de três polipeptídeos distintos: as subunidades a, b e g, em ordem decrescente de peso molecular. As subunidades a ligam-se ao nucleotídeo guanina com alta afinidade e especificidade, interagem com os receptores, com os efetores, com o complexo bg e possuem atividade intrínseca GTPase (10-12).

As subunidades a são altamente conservadas entre os mamíferos (> 95%), sendo as proteínas G classificadas de acordo com a seqüência estrutural e/ou homologia funcional das subunidades a em quatro subfamílias: G_sa G_qa, G_ia, G₁₂a e cada subfamília é composta de vários membros. Na classe dos mamíferos, cerca de 16 genes codificam a subunidade a e mais de 20 diferentes subunidades a já foram identificadas. A subunidade a contém cinco regiões distintas altamente conservadas (G1-G5). G1, G4 e G5 são importantes para a ligação ao GTP enquanto G2 e G3 determinam a atividade GTPase. As subunidades b e g são menos conservadas entre as espécies e estão fortemente associadas por ligação não covalente, formando um dímero funcional bg extremamente estável; entretanto cada subunidade do dímero também pode funcionar como um homodímero. Cerca de 6 genes codificam as subunidades b e 12 codificam as subunidades g, O complexo bg quando associado à subunidade a, mantém a proteína G em seu estado heterotrimérico inativo (11-13).

Transdução do sinal celular dos hormônios que utilizam os receptores acoplados às proteínas G

A característica principal dos hormônios é sua habilidade em interagir com receptores altamente seletivos localizados na superfície ou no interior das células, cuja função é modificar o funcionamento ou o comportamento das células-alvo. Os receptores possuem alta afinidade e especificidade pelo seu ligante (hormônio), o que previne reações biológicas não específicas do hormônio. Os hormônios ativam uma série de eventos moleculares no interior das células induzindo alteração da transcrição gênica resultando numa resposta fisiológica. Transdução é o nome dado ao processo de ativação desses eventos intracelulares pelos estímulos externos. A primeira etapa do sinal celular é o acoplamento do ligante ao seu receptor. Os ligantes que podem ativar os receptores 7TM são diversos, variando desde pequenas moléculas (aminas biogênicas, odorantes), pequenos peptídeos (vasopressina), grandes peptídeos (paratormônio) e até grandes proteínas como os hormônios glicoprotéicos (14).

O mecanismo da transdução do sinal celular consiste de fosforilações e defosforilações seqüenciais dos resíduos das proteínas intracelulares. Estes eventos de fosforilação e desfosforilação ocorrem após a ligação dos hormônios aos seus receptores de membrana 7TM, que vão ativar as proteínas G e gerar um segundo mensageiro, tais como AMPc, diacilglicerol, ou íons cálcio (15-16).

O segundo mensageiro, AMPc, ativa a quinase protéica dependente de AMPc resultando na fosforilação do substrato serina. A fosforilação consiste na transferência de um grupo fosfato, a partir da adenosina trifosfato, para resíduos específicos de aminoácidos, usualmente serina, mas algumas vezes também treonina ou tirosina. A fosforilação é determinada pela atividade das enzimas quinases protéicas, e a desfosforilação pelas fosfoproteínas fosfatases.

A quinase protéica dependente de AMPc consiste de quatro subunidades, duas subunidades catalíticas e um dímero regulatório, o qual se liga à molécula de AMPc. Desta forma ocorre a dissociação da proteína quinase, subunidade regulatória da subunidade ativa catalítica. A subunidade ativa da proteína quinase catalisa a fosforilação de certas proteínas intracelulares (fatores de transcrição) que atuam na ativação e inativação gênica. O exato mecanismo pelo qual as proteínas fosforiladas ativam a transcrição gênica ainda não está bem estabelecido (17-18).

Ciclo GTPase

Todas as subunidades a possuem uma característica funcional comum que é a atividade GTPase, que determina o término do sinal celular.

As proteínas G em seu estado inativo encontram-se na sua forma heterotrimérica (abg) ligadas ao GDP. Quando o receptor é ativado por um ligante químico ou físico, ocorre uma alteração na sua conformação estrutural, expondo as a-hélices e sítios fundamentais para a ligação às proteínas G, o que acarreta uma mudança da conformação da subunidade a, diminuindo a sua afinidade pelo GDP.

A concentração molar intracelular do GTP é 10 vezes mais elevada do que o GDP, ocorrendo sua substituição após a dissociação do GDP da subunidade a. Uma vez que o GTP está acoplado à subunidade a, esta assume sua conformação ativa, dissociando-se do receptor e do complexo bg e ligando-se posteriormente ao seu respectivo efetor, que irá desencadear a cascata de eventos intracelulares para ativar ou inativar os mensageiros secundários, tais como o AMPc, o diacilglicerol e canais de cálcio. A atividade GTPase controla o término do sinal celular, através da clivagem do g-fosfato terminal do GTP para GDP. Desta forma a subunidade a se dissocia do efetor, liga-se novamente ao complexo bg e ao receptor. Assim a proteína G assume sua forma heterotrimérica inativa, podendo receber um novo estímulo e reiniciar outro ciclo (figura 1). A atividade GTPase é um dos mecanismos que controla a duração da resposta celular. A razão de hidrólise do GTP é acelerada pela interação com certos efetores (adenililato-ciclase isoforma 5) ou com membros de uma nova família de proteínas, RGS, conhecidas como reguladoras da atividade GTPase das proteínas G_i, G_q e G₁₂ (Regulator of G protein Signaling) (19-21).

Efeito da toxina da bactéria Vibrio cholerae na proteína G_s a

As primeiras evidências de que uma ativação inapropriada da proteína G_sa pudesse ter conseqüências patológicas foram observadas em estudos com o Vibrio cholerae. A toxina colérica, secretada pelo Vibrio cholerae, interage com as proteínas G_sa, e alteram os níveis celulares de AMPc. A toxina colérica ativa de forma irreversível a adenilato-ciclase nas células epiteliais do intestino, elevando os níveis de AMPc. Parte da toxina que é uma enzima penetra no citosol onde catalisa a adição covalente do grupo adenosina difosfato-ribosil (ribosilação), proveniente do grupo nicotinamida adenina dinucleotídeo no aminoácido arginina (Arg²⁰¹) da proteína G_sa, que é critico para a atividade GTPase. Esta proteína alterada pode ativar a adenilato-ciclase normalmente, porém não pode hidrolisar GTP para GDP, ou seja perde a atividade GTPase. A proteína G_sa permanece constitutivamente ativada, aumentando em 100 vezes ou mais os níveis de AMPc nas células epiteliais do intestino. Desta forma ocorre a passagem maciça de água do sangue para a luz intestinal, causando diarréia e desidratação (22).

Anormalidade da transdução do sinal celular da proteína G_s a

Tem sido proposto que os componentes da sinalização celular são possíveis alvos de mutações que podem levar ao desenvolvimento de doenças. A anormalidade da transdução do sinal celular pode ser devida a alterações do receptor 7TM, da proteína G, ou de seus efetores.

Na última década, os avanços na biologia molecular possibilitaram a identificação de mutações no gene GNAS1 (Guanine Nucleotide binding Alpha-subunit 1), que codifica a proteína G_sa. As mutações ativadoras e inativadoras descritas estão associadas a alterações da transdução do sinal celular. Mutações da proteína G_sa podem causar perda ou ganho de função por inativação ou ativação do sinal celular com apresentação clínica de excesso ou falta hormonal respectivamente. A expressão fenotípica destas mutações depende se elas ocorrem nas células germinativas, afetando todas as células em que o gene é expresso, ou se elas ocorrem nas células somáticas, com manifestações focais da doença (tabela 1).

Mutações ativadoras descritas nos exons 8 e 9 do gene GNAS1 são somáticas, pontuais em heterozigose e alteram codons altamente conservados (R²⁰¹ e Q²²⁷), envolvidos na atividade GTPase. Estudos através de cristalografia e experimentos com mutagênese in vitro indicam que a arginina 201 e a glutamina 227 funcionam como um anel para estabilizar o g-fosfato do GTP. Estas mutações denominadas gsp (G stimulatory protein) levam a mudanças estruturais da proteína G_sa diminuindo a hidrólise do g-fosfato do GTP, mantendo constitutivamente o sinal celular (23,24). As mutações inativadoras têm sido detectadas em todos os exons do gene GNAS1, exceto no exon 3, sendo 20% das mutações presentes no exon 7. As mutações inativadoras são germinativas, em heterozigose caracterizadas por pequenas deleções, inserções, mutações pontuais missense e stop codon prematuro. Ensaios bioquímicos que mediram a produção hormonal após a reconstituição de membranas de pacientes com PHP Ia que apresentavam mutação inativadora da proteína G_sa demonstraram uma deficiência parcial da atividade da proteína G_sa em vários tipos celulares, tais como: eritrócitos, fibroblastos, linfócitos e células renais. Estudos subseqüentes mostraram decréscimo da expressão do RNA mensageiro e da proteína G_sa (25).

Estrutura e localização do gene GNAS1

O gene GNAS1 humano foi clonado em 1988 por Kosaza e cols., possui 20Kb e localiza-se no braço longo do cromossomo 20 na região 13.1-13.2. Inicialmente a seqüência de pares de base estava distribuída em 13 exons com 4 splicing alternativos localizados nos exons 3 e 4 (26). Atualmente sabe-se que o gene GNAS1 e seu homólogo em ratos (Gnas) apresentam alta complexidade com múltiplos splicing alternativos formando transcritos que codificam várias proteínas e transcritos não traduzidos. Utilizando promotores alternativos, os principais produtos transcritos pelo gene GNAS1 são: a conhecida proteína G_sa, a NESP 55 (neuroendocrine secretory protein 55), que é uma proteína semelhante à cromogranina com expressão em tecidos neuroendócrinos (medula adrenal, hipófise, hipotálamo, e outras regiões do cérebro); as XLas (XLN1a e XLN1b), isoformas longas da G_sa, também apresentam expressão em tecidos neuroendócrinos (pituitária, adrenal, coração, pâncreas) com funções biológicas ainda não determinadas (27-29) (figura 2).

Em humanos e ratos a região promotora da proteína NESP55 está metilada somente no alelo paterno, sendo o alelo materno transcrito e contrariamente a região promotora da XLas está metilada no alelo materno com transcritos somente do alelo paterno. Estudos do padrão de metilação em ratos e fetos humanos, da região promotora da proteína G_sa, mostraram que essa região parece constituir a marca do imprinting. A expressão da proteína é bialélica em alguns tecidos (ossos), e monoalélica em outros (túbulo proximal do nefron) com imprinting paterno e expressão do alelo materno (25).

Doenças associadas às mutações ativadoras no gene GNAS1

Mutações do gene GNAS1 foram descritas primeiramente em 40% dos adenomas pituitários somatotróficos e 30% dos adenomas autônomos da tireóide. Estas mutações resultaram em hiperplasia celular e hipersecreção de hormônio de crescimento e hormônios da tireóide. A persistente ativação da adenilato-ciclase por deficiência da enzima GTPase mantém níveis elevados de AMPc, que estimula a secreção hormonal e o crescimento destes tecidos, o suficiente para levar aos fenótipos de acromegalia e hipertireoidismo respectivamente. Tais mutações ativadoras no codon da arginina 201 também foram detectadas em alguns tumores de células de Leydig em ovário e testículo, em neoplasias diferenciadas da tireóide e raramente em outros tumores endócrinos (30-33) (tabela 1).

A mesma mutação somática do gene GNAS1 é a base molecular da síndrome de McCune Albright, que acarreta a substituição da arginina 201 (CGT), principalmente por histidina (CAT) ou por cisteína (TGT). Esta síndrome descrita por McCune e Albright em 1930 é uma doença esporádica classicamente definida pela presença de displasia óssea fibropoliostótica, manchas "café au lait" e puberdade precoce. Variações clínicas desta tríade clássica podem ocorrer, associadas a outras endocrinopatias, tais como: hipertireoidismo, acromegalia, prolactinoma e síndrome de Cushing (34,35).

Alguns órgãos não endócrinos também podem ser afetados, incrementando o risco de mortalidade e morbidade desta patologia. Estes órgãos incluem: fígado, rim, timo, baço, trato gastrointestinal e cérebro. As anormalidades cardíacas incluem cardiomegalia, taquicardia, hipertrofia muscular associada à morte súbita. Outras raras alterações são: hiperplasia do timo, pólipo gastrointestinal, pancreatite, câncer de mama e microcefalia. As manifestações clínicas da síndrome de McCune Albright são explicadas pelo padrão mosaico de distribuição das células que carregam o alelo mutado, caracterizando uma mutação pós zigótica, em heterozigose, que ocorre nas primeiras fases da embriogênese no gene GNAS1 (35).

Doenças associadas às mutações inativadoras do gene GNAS1

Inúmeras mutações inativadoras no gene GNAS1 têm sido identificadas com padrão autossômico dominante de herança, e variável manifestação clínica nos casos de osteodistrofia hereditária de Albright (AHO) e pseudohipoparatireoidismo tipo Ia (PPH Ia).

Pseudohipoparatireoidismo (PHP) é uma doença hereditária cujo defeito se localiza na transdução do sinal celular. Os pacientes com PHP apresentam sinais de hipoparatireoidismo, com níveis elevados do paratohormônio (PTH) e resposta alterada ao PTH exógeno, indicando resistência ao PTH. Esta doença tem sido subdividia em vários subtipos, que apresentam diferentes etiologias (tabela 2). Pacientes com PPH Ia apresentam algumas características somáticas que incluem: baixa estatura, ossificação subcutânea, obesidade centrípeta, fácies arredondada, nariz em sela, hipertelorismo e déficit mental variável. Estas anormalidades são denominadas de osteodistrofia hereditária de Albright. Bracdactilia envolvendo o terceiro, quarto e quinto metacarpo, com padrão simétrico ou assimétrico é relativamente específica da AHO. As manifestações esqueléticas da AHO não são secundárias à hipocalcemia, hiperfosfatemia ou aos níveis elevados de PTH, pois estes parâmetros bioquímicos estão presentes em pacientes com hipoparatireoidismo e com ausência de manifestações ósseas. O PPH Ia apresenta as mesmas características clínicas e bioquímicas da AHO associada à resistência dos seguintes hormônios: TSH, LH, e FSH. A maioria das mutações inativadoras descritas são: deleções ou iserções, que produzem frameshifts e stop codons prematuros. Algumas mutações interrompem a expressão do RNA mensageiro e conseqüentemente da proteína G_sa, por desestabilizar a ligação da subunidade-a com o nucleotídeo guanina ou substituírem aminoácidos da região carboxiterminal levando ao não acoplamento da proteína G_sa ao receptor 7TM. Mutações mais raras aumentam a atividade GTPase, diminuindo a ligação do GTP à subunidade-a, e conseqüentemente diminuindo a quantidade de proteína produzida. Estas mutações têm sido descritas em pacientes com osteodistrofia hereditária de Albright (AHO) e pseudohipoparatireoidismo tipo Ia (PPH Ia) (36). Uma intrigante mutação missense (Ala366Ser) localizada na região G5 da proteína G_sa foi identificada em dois pacientes não correlacionados com PHP Ia e testotoxicose. Esta substituição leva à ativação constitutiva da adenilato ciclase devido ao incremento da razão de dissociação do GDP, favorecendo a ligação ao GTP-G_sa. Porém a proteína à 37°C é muito instável, levando a uma perda de expressão e um fenótipo de PPH Ia. Entretanto, em temperaturas mais baixas, como no testículo, a proteína permanece mais estável e constitutivamente ativa favorecendo a produção hormonal de testosterona e o quadro clínico de puberdade precoce independente de gonadotrofinas (37).

Imprinting do gene GNAS1

O imprinting genômico é um fenômeno epigenético que afeta um pequeno número de genes autossômicos. Neste evento bioquímico que pode ser reversível, existe uma modificação no genoma parental, que leva a uma diferença funcional nas células somáticas da prole, onde um dos alelos parentais não é expresso e o outro é transcrito (38).

As principais características dos genes que sofrem imprinting são:

¾ Cerca de 80% destes genes estão fisicamente ligados em clusters com outros genes que sofrem imprinting e são ricos em ilhas CpGs;

¾ Apresentam regiões que sofrem metilação denominadas de DMRs (Differentially Methylated Regions);

¾ Geralmente formam transcritos anti-sense, não traduzidos com função regulatória do gene.

A precisa natureza do imprinting, e sua determinação durante o desenvolvimento, ainda não está totalmente elucidada. Um dos mecanismos favoráveis ao imprinting é a adição do grupo metil na posição 5', principalmente nas regiões ricas em CpGs (metilação) (39).

A hipótese de imprinting do gene GNAS1 tem sido aventada para explicar a patogênese molecular da Osteodistrofia hereditária de Albright (AHO), e pseudohipoparatireoidismo tipo Ia (PHP Ia). Estudos clínicos genéticos de pacientes com AHO revelaram a presença de mutações inativadoras em heterozigose no gene GNAS1, determinando fenótipos diferentes conforme a herança do alelo mutado fosse transmitido via materna ou paterna.

Os pacientes com herança materna da AHO apresentam-se com PHP Ia. A resistência renal ao PTH nestes pacientes se manifesta por: hipocalcemia, hiperfosfatemia, níveis séricos baixos de 1,25(OH)2 D e elevados de PTH. A resistência aos hormônios glicoprotéicos TSH, LH e FSH caracteriza-se clinicamente por hipotireoidismo e infertilidade respectivamente.

Frente a estes dados, algumas questões têm sido formuladas sobre a patogênese molecular da AHO e PHPIA.

1) Por que a resistência hormonal não engloba todos os hormônios que utilizam o sistema do receptor 7TM e proteínas G na transdução do sinal celular?

2) Por que familiares com a mesma mutação inativadora apresentam-se fenotipicamente diferentes de acordo com a origem parental do alelo mutado ?

Algumas hipóteses têm sido aventadas para explicar tais questões. As de Farfel e cols. podem ser resumidas nos seguintes tópicos (40).

No tecido ósseo a expressão do gene GNAS1 é bi-alélica, com ausência do imprinting. Quando ocorre uma mutação inativadora neste gene, tanto no alelo materno quanto no alelo paterno, a quantidade de proteína produzida é insuficiente para uma função normal do tecido ósseo. Isto caracteriza uma haploinsuficiência tecido-específica e ausência do imprinting com fenótipo de AHO.

Em células do túbulo renal proximal a expressão do gene GNAS1 é monoalélica, por imprinting paterno, havendo expressão somente do alelo materno. Se a mutação estiver presente no alelo paterno (não expresso), não há alteração fenotípica, ou seja, ausência de resistência ao PTH. Se a mutação estiver presente no alelo expresso materno, a função da proteína estará comprometida, acarretando resistência ao PTH. Isto caracteriza uma haplossuficiência com imprinting paterno tecido específico.

Em outros tecidos a expressão do gene é bialélica, porém haplossuficiente, e não ocorre o fenômeno do imprinting. Se a mutação inativadora estiver presente no alelo materno ou no alelo paterno não acarretará alteração da função, o que explica a falta de resistência a outros hormônios que utilizam a mesma via da proteína G_sa para a transdução do sinal celular.

A natureza tecido-específica do imprinting do GNAS1 pode explicar porque os pacientes com PHP Ia não apresentam resistência a outros hormônios que ativam a proteína G_sa, bem como a manutenção de resposta ao PTH no nefron distal. Estes pacientes apresentam reabsorção adequada de cálcio no tubo ascendente, onde possivelmente o imprinting não ocorre.

Em vários tecidos humanos, como tecido fetal, cultura de fibroblastos e tecido ovariano, nenhuma evidência de imprinting genômico foi encontrada, no entanto, em tecido hipofisário, pode-se estabelecer um padrão materno de expressão da proteína G_sa. Estes dados sugerem que o imprinting do gene GNAS1 ocorre com padrão tecido específico (41,42).

Defeito do Imprinting do gene GNAS1 no pseudohipoparatireioidismo tipo Ib (PHP Ib)

PHP Ib é definido pela resistência renal ao PTH, ausência de AHO ou resistência a outros hormônios. A maioria dos casos é esporádica, porém há relatos de casos familiais. Estudos recentes têm demonstrado resistência ao PTH, somente quando a herança é materna semelhante aos casos de PHP Ia. Em quatro pacientes o mapeamento genético associou a doença à região 20q1.3 que abriga o gene GNAS1 (43-44). Nenhuma mutação foi descrita no receptor do PTH e uma única mutação foi descrita no exon 13 do gene GNAS1, responsável pela interação da proteína Gsa com o receptor, em três irmãos com PHP Ib. A mesma mutação clinicamente silenciosa foi detectada na mãe e avô materno destes irmãos (45).

Um recente estudo examinando o imprinting do GNAS1 em 18 pacientes revelou que o exon 1A não estava metilado em ambos alelos com transcritos bialelicamente expressos. Estes achados sugerem que o exon 1A é importante para estabelecer e/ou manter o padrão de imprinting tecido específico do gene GNAS1. Um modelo hipotético criado por Lee Weinstein e cols. (46) sugere que o exon 1A contém um elemento silenciador, o qual se liga a um repressor que é expresso somente em alguns tecidos, como o túbulo renal proximal. Neste tecido o repressor se liga no alelo paterno e inibe a transcrição do RNAm da G_sa, mas é incapaz de ligar-se ao alelo materno pois este sítio está metilado. A transcrição do RNAm da G_sa é via alelo materno expresso e não metilado. Na maioria dos tecidos o padrão anormal de metilação não tem impacto porque o repressor não está presente, explicando desta forma os níveis normais da expressão da proteína G_sa e ausência do fenótipo da AHO. Este modelo assume que a expressão do RNAm da proteína G_sa é expressa exclusivamente pelo alelo materno no túbulo proximal renal, sítio de ação do PTH no rim. Estas evidências foram comprovadas em tecido renal de ratos e hipófise humana, mas não há evidências destes achados em túbulos renais de humanos. Zheng e cols. tentaram resolver estas questões utilizando tecidos de feto humano para estudo com RT-PCR e observar se a expressão dos transcritos do gene GNAS1 seria mono ou bialélica. NESP55, XLas e exon 1A eram monoalelicamente expressos em todos os tecidos estudados. Entretanto, G_sa foi bialelicamente expresso nas amostras de córtex renal. Baseados nesta informação os autores concluem que G_sa não sofre imprinting no córtex renal e a resistência ao PTH no PHP Ib e provavelmente PHP Ia não é devida à perda de expressão da G_sa no túbulo renal proximal. Weinstein e cols. questionaram estes resultados em seu editorial, devido a possíveis contaminações com estruturas mais distais do nefron, que em ratos sabe-se que a expressão da G_sa é bialélica. Outra possível explicação para não detecção do imprinting é que as células do córtex renal fetal não têm a mesma maturidade do córtex formado, e o imprinting pode se estabelecer somente nas células maduras. De fato, pacientes com PHP Ia não desenvolvem resistência renal ao PTH ao nascimento, mas só posteriormente aos primeiros anos de vida (46,47).

CONCLUSÕES

Mutações do gene GNAS1 têm sido identificadas em diferentes doenças endócrinas, com características esporádicas e familiais. Mutações ativadoras e inativadoras são a base da patogênese molecular da síndrome de McCune Albright, OHA-PPH Ia respectivamente. O gene GNAS1 apresenta alta complexidade na sua estrutura e função. Alteração no padrão de imprinting e raramente mutação inativadora deste gene podem estar associados ao PPH Ib O mecanismo que estabelece e mantém o imprinting do gene GNAS1 ainda é um enigma a ser esclarecido. Recentes evidências sugerem que o imprinting do gene GNAS1 pode também ter um efeito nas manifestações clínicas em pacientes com mutações ativadoras. Hayward e cols. mostraram que em 21 de 22 tumores hipofisários secretores de GH, a mutação gsp encontrava-se no alelo materno. Em pacientes com síndrome de McCune-Albright, poderíamos esperar que a expressão da atividade constitutiva nos tecidos que sofrem imprinting pode ser muito maior quando a mutação estiver presente no alelo materno ativo.

Estudos futuros em animais e em humanos, podem esclarecer o mecanismo complexo do imprinting do gene GNAS1 e o seu envolvimento na patogênese molecular dos PHP Ia e PHP Ib e das doenças associadas ao oncogene gsp.

Endereço para correspondência:

Maria Candida Barisson Villares Fragoso

Laboratório de Hormônios e Genética Molecular

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• 1. Rodbell M, Krans HM, Pohl SL, Birnbaumer L. The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. Effects of guanylnucleotides on binding of ¹²⁵I-glucagon. J Biol Chem 1971;246:1872-6.
• 2. Rodbell M, Birnbaumer L, Pohl SL, Krans HM. The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. An obligatory role of guanylnucleotides in glucagon action. J Biol Chem 1971; 246:1877-82.
• 3. Spiegel AM, Shenker A, Weinstein LS. Receptor-effector coupling by G-proteins: implications for normal and abnormal signal transduction Endocr Rev 1992; 13:536-65.
• 4. Spiegel AM, Weinstein LS, Shenker A. Abnormalities in G protein-coupled signal transduction pathways in human disease J Clin Invest 1993;92:1119-25.
• 5. Wess J. Molecular basis of receptor/G-protein-coupling selectivity. Pharmacol Ther 1998;80:231-364.
• 6. Gether U. Uncovering molecular mechanism involved in activation of G-protein-coupled receptors. Endocr Rev 2000;21:90-1132.
• 7. Felig P, Baxter JD, Frohman LA. Endocrinology and Metabolism 3^rd ed. New York: Atlis Graphycs & Design, 1995.
• 8. Spiegel AM. Signal transduction by guanine nucleotide biding proteins. Mol Cell Endocrinol 1987;49:1-16.
• 9. Hepler JR, Gilman AG. G-proteins. Trends Biochem Sci 1992;17:383-7.
• 10. Bourne HR, Sanders DA, McCormick F. The GTPase superfamily: Conserved structure and molecular mechanism. Nature 1991;349:117-27.
• 11. Birnbaumer L. Receptor-to-effector signaling through G protein: roles for bg dimers as well as a subunits. Cell 1992;71:1069-72.
• 12. Conklin BR, Bourne HR. Structural elements of Ga subunits that interact with G bg, receptors, and effectors. Cell 1993;73:631-41.
• 13. Clapham DE, Neer EJ. New roles for G protein bg dimers in transmenbrane signaling. Nature 1993;365:403-6.
• 14. Dohlman HG, Thorner J, Caron MC, Lefkowitz RJ. Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Ann Rev Biochem 1991;60:653-88.
• 15. Neer EJ. Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals. Cell 1995;80:249-57.
• 16. Gautam N, Downes GB, Yan K, Kisslev O. The G-protein complex. Cell Signal 1998;10:447-55.
• 17. Habener JF, Miller CP, Vallejo M. Cyclic AMP-dependent regulation of gene transcription by CREB and CREM. Vitam Horm 1995;51:1-57.
• 18. Habener JF. Cyclic AMP second messenger signaling pathway. In De Groot LJ, et al eds. Endocrinology 3^rd ed 1995;1:77-921.
• 19. Watson N, Linders ME, Druey KM, Kehrl JH, Blumer KJ. RGS family members: GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein a-subunit. Nature 1996;383:172-5.
• 20. Hunt TW, Fields TA, Casey PJ, Peralta EG. RGS10 is a selective activator of G?i GTPase activity. Nature 1996;383:175-7.
• 21. Ross EM, Wilkie TM. GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-proteins: regulators of G-protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. An Rev Biochem 2000;69:795-827.
• 22. Bornancin F, Chabre M. Choleratoxina ADP-ribosylates transducin only when it is bound to photoexcited rhodopsin and depleted of its nucleotide. FESB Lett 1991;291:273-5.
• 23. Van Biesen T, Luttrell LM, H awes BE, Lefkowitz RJ. Mitogenic signaling via G-protein coupled receptors. Endocr Rev 1996;17:698-714.
• 24. Dhanasekaram N, Tsim ST, Dermott JM, Onesime D. Regulation of cell proliferation by G-proteins. Oncogene 1998;17:1383-4.
• 25. Weinstein LS, Yu S, Warner DR, Liu J. Endocrine manifestations on stimulatory G-protein a-subunit. Mutations and the role of genomic imprinting. Endocrine Reviews 2001;22(5):675-705.
• 26. Kozasa T, Itoh H, Tsukamoto T, Kaziro Y. Isolation and characterization of human Gsa gene. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:2081-5.
• 27. Hayward BE, Moran V, Strain L, Bonthron DT. Bidirectional imprinting of a single gene: GNAS1 encodes maternally, paternally and biallelically derived proteins. PNAS 1998;95:15475-80.
• 28. Hayward BE, Bonthron DT An imprinted antisense transcript at the human GNAS1 locus Hum Mol Genet 2000;9:835-41.
• 29. Pasolli HA, Klemke M, Kehlenbach RH, Wang Y, Hunttner WB. Characterization of the extra large G protein a-subunit XLas. Tissue distribution and subcellular localization. J Biol Chem 2000;275:33622-32.
• 30. Landis CA, Masters SB, Spada A, Pace AM, Bourne HR, Vallar L. GTPase inhibiting mutations activate the a chain of G_s and stimulate adenyl cyclase in human pituitary tumors Nature 1989;340:692-6.
• 31. Suarez HG, du Villard JA, Caillou B, Schlumberg M, Parmentier C, Monier R. gsp mutations in human thyroid tumors. Oncogene 1991;6:677-9.
• 32. Lyons J, Landis CA, Harsh G, Vallar L, Grunewald K, Feichtinger H et al. Two G-protein oncogenes in human endocrine tumors. Science 1990;249:655-9.
• 33. Fragoso MCBV, Latronico AC, Zerbini MC, Carvalho FM, Frazzatto ET, Lando VS et al. Activating mutation of the stimulatory G-protein gsp as a putative cause of ovarian and testicular human stromal Leydig cell tumors. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:2074-8.
• 34. Ringel MD, Schwindinger WF, Levine MA. Clinical implications of genetics defects in G-proteins. The molecular basis of McCune Albright syndrome and Albright hereditary osteodistrophy. Medicine (Baltimore) 1996; 75:171-84.
• 35. Weinstein LS, Shenker A, Gejman PV, Merino MJ, Friedman E, Spiegel AM. Activating mutations of the stimulatory G-protein in the McCune-Albright syndrome. N Engl J Med 1991;325:1688-95.
• 36. Simon A, Koppeschaar HPF, Roijers JFM, Höppener CJM. Pseudohypoparathyroidism type Ia. Albright hereditary osteodystrophy: a model for research on G protein-coupled receptors and genomic imprinting. Neth J Med 2000;56:100-9.
• 37. Iiri T, Herzmark P, Nakamoto JM, van-Dop C, Bourne HR. Rapid GDP release from Gs alpha in patients with gain and loss of endocrine function. Nature 1994;371:164-8.
• 38. Reik W, Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2001;2:21-32.
• 39. Bird AP. CpG-rich islands and the function of DNA methylation Nature 1986;321:209-13.
• 40. Farfel Z, Bourne HR, Iiri T The expanding spectrum of G protein diseases. N Engl J Med 1999;340:1012-20.
• 41. Weinstein LS, Yu S. The role of genomic imprinting of G_sa in the pathogenesis of Albright hereditary osteo-distrophy Trends Endocrinol Metab 1999;10:81-5.
• 42. Hayward BE, Barlier A, Korbonits M, Grossman AB, Jacquet P, Enjalbert A. Imprinting of the G(s) alpha gene GNAS1 in the pathogenesis of acromegaly. J Clin Invest 2001;107:31-6.
• 43. Liu J, Litman D, Rosemberg MJ, Yu S, Biesecker LG, Weinstein LS. A GNAS1 imprinting defect in pseudohypoparathyroidsm type IB. J Clin Invest 2000;106:1167-74.
• 44. Juppner H, Shipani E, Bastep M, Cole DE, Lawson ML, Mannstadt M. The gene responsible for pseudohypoparathyroidsm type Ib is paternally imprinted and maps in four unrelated kindreds to chromossome 20q13.3. PNAS 1998;95:11798-803.
• 45. Wu WI, Schwindinger WF, Aparício LF, Levine MA. Selective resistance to parathyroid hormone caused by a novel uncopling mutation in the carboxyl terminus of Gsa: a cause of pseudohypoparathyroidsm type Ib. J Bio Chem 2001;276:165-71.
• 46. Weinstein LS. Editorial: The stimulatory G protein a-subunit gene: Mutations and imprinting lead to complex phenotypes. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:4622-6.
• 47. Zheng H, Radeva G, McCann JA, Hendy GN, Goodyer CG. Gsa transcripts are biallelically expressed in the human kidney cortex: Implications for pseudohypoparathyroidsm type 1b. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:4627-9.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Nov 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Aceito
  30 Jul 2002
• Revisado
  25 Jul 2002
• Recebido
  02 Jul 2002