Mutações do Gene do Receptor Sensível ao Cálcio Extracelular e Suas Doenças Associadas

Mutations of the Extracellular Calcium-Sensing Receptor Gene and its Associated Diseases

revisão

Mutações do Gene do Receptor Sensível ao Cálcio Extracelular e Suas Doenças Associadas

Kozue Miyashiro

Omar M. Hauache

Laboratório de Endocrinologia

Molecular, Disciplina de

Endocrinologia, Departamento de

Medicina, Universidade Federal de

São Paulo (UNIFESP/EPM), SP.

Recebido em 15/01/2002

Revisado em 27/02/2002

Aceito em 03/03/2002

RESUMO

O receptor sensível ao cálcio extracelular (CaR) é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), que exerce um papel essencial na regulação da homeostase do cálcio extracelular. O CaR encontra-se expresso em todos os tecidos relacionados com o controle desta homeostase (paratiróides, células C tiroideanas, rins, intestino e ossos). Logo após a clonagem do CaR, mutações inativadoras e ativadoras do gene deste receptor foram associadas com doenças genéticas humanas: hipercalcemia hipocalciúrica familiar (FHH) e hiperparatiroidismo neonatal severo (NSHPT) são causados por mutações inativadoras do gene do CaR, enquanto que a hipocalcemia autossômica dominante é resultante de mutações ativadoras do gene do CaR. Apesar de raras, tais doenças devem ser consideradas no diagnóstico diferencial de distúrbios hipercalcêmicos e hipocalcêmicos. O reconhecimento do papel fundamental do CaR na manutenção da homeostase do cálcio extracelular motivou o desenvolvimento de drogas capazes de modular a função do CaR, ativando-o (drogas calcimiméticas) ou inativando-o (drogas calciolíticas). Tais drogas têm uma implicação terapêutica potencial, como o controle clínico de casos específicos de hiperparatiroidismo primário e urêmico com o uso de drogas calcimiméticas e um tratamento promissor para osteoporose com o uso de drogas calciolíticas. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4:411-417).

Descritores: Receptor sensível ao cálcio extracelular; Hipercalcemia hipocalciúrica familiar; Hiperparatiroidismo neonatal severo; Hipocalcemia autossômica dominante

ABSTRACT

Mutations of the Extracellular Calcium-Sensing Receptor Gene and its Associated Diseases.

The extracellular calcium-sensing receptor (CaR) is a G protein coupled receptor (GPCR) that plays a key role in the regulation of extracellular calcium homeostasis, being expressed in all tissues related to this control (parathyroid glands, thyroid C-cells, kidneys, intestine and bones). The cloning of the CaR was immediately followed by the association of genetic human diseases with inactivating and activating mutations of the CaR gene: familial hypocalciuric hypercalcemia (FHH) and neonatal severe hyperparathyroidism (NSHPT) are caused by inactivating mutations of the CaR gene, whereas autosomal dominant hypoparathyroidism is secondary to activating mutations of the CaR gene. In spite of being rare, these diseases should be considered in the differential diagnosis of hypercalcemic and hypocalcemic disorders. Recognition of the important role of the CaR for the regulation of extracellular calcium homeostasis motivated the development of drugs that modulate the CaR function, by either activating (calcimimetic drugs) or antagonizing it (calcilytic drugs). These drugs have potential therapeutic implications, such as medical control of specific cases of primary and uremic hyperparathyroidism with calcimimetic drugs and a potential treatment for osteoporosis with a calcilytic drug. (Arq Bras Endocrinol Metab 2002;46/4:411-417).

Keywords: Calcium-sensing receptor; Familial hypocalciuric hypercalcemia; Neonatal severe hyperparathyroidism; Autosomal dominant hypoparathyroidism

Regulação da Homeostase do Cálcio Extracelular

O ÍON CÁLCIO (Ca²⁺) é fundamental para uma grande variedade de processos intracelulares e extracelulares em todos os organismos. Intracelularmente, o cálcio está envolvido principalmente na proliferação, diferenciação e motilidade celular, no controle de diversas funções celulares como contração muscular, secreção hormonal e metabolismo do glicogênio, além de atuar como mensageiro secundário e cofator enzimático. No processo extracelular, participa de numerosas funções essenciais, tais como coagulação sangüínea, adesão celular, manutenção da integridade do esqueleto e regulação da excitabilidade extracelular (1,2).

O valor basal do cálcio intracelular (Ca²⁺_i), geralmente em torno de 100nM, é aproximadamente 10.000 vezes menor do que a concentração do cálcio ionizado extracelular (Ca²⁺_o), que é de cerca de 1mM. O Ca²⁺_i pode sofrer rápidas elevações quando ocorre ativação celular, devido à liberação de cálcio do estoque intracelular e/ou proveniente do cálcio extracelular (2). Em contraste, o valor de Ca²⁺_o medido no sangue varia muito pouco, permanecendo dentro de um intervalo estreito (1,14 - 1,30mmol/L). Neste sentido, um mecanismo ultra-sensível a pequenas mudanças de Ca²⁺_o regula e mantém a homeostase desse íon (1,2).

A elucidação de um dos principais componentes deste mecanismo veio em 1993, quando Brown e cols. (3) identificaram o gene do receptor sensível ao cálcio extracelular (CaR) em células paratiroideanas bovinas, através de clonagem de expressão em oócitos de Xenopus laevis. O CaR é o mecanismo molecular pelo qual as células paratiroideanas e outras células reconhecem e respondem a pequenas mas fisiologicamente relevantes mudanças de Ca²⁺_o, tendo, portanto, um papel fundamental no sistema homeostático responsável pela manutenção da constância do Ca²⁺_o (1,4).

A homeostase do Ca²⁺_o em mamíferos é mantida através de um complexo processo envolvendo a interação de alguns hormônios [paratormônio (PTH), 1,25-dihidroxivitamina D (1,25(OH)₂D₃), calcitonina] e sistemas orgânicos, como as glândulas paratiróides, células-C tiroideanas, rins, ossos e intestino (1). Alterações na concentração de Ca²⁺_o são reconhecidas pelas células sensíveis a essas mudanças por intermédio do CaR, resultando na ativação a curto prazo (minutos a horas) e a longo prazo (dias a semanas) da resposta homeostática, com a finalidade de normalizar o nível de cálcio (1,2).

Na vigência de hipocalcemia, por exemplo, há um aumento rápido da secreção de PTH pelas células paratiroideanas e, em questão de horas, há um aumento no nível de mRNA para a síntese de PTH. Esta resposta de aumento de secreção de PTH está diretamente relacionada ao mecanismo de percepção dos níveis séricos de cálcio, mediado pelo CaR. O PTH mobiliza o cálcio ósseo, aumentando o fluxo de cálcio do osso para a circulação sangüínea, reduz a excreção renal de cálcio (aumentando a reabsorção de cálcio pelos túbulos distais) e aumenta a produção de 1,25(OH)₂D₃ a nível renal. Por sua vez, este metabólito ativo da vitamina D age no intestino aumentando a absorção do cálcio proveniente da dieta. Assim, através da ação conjunta do PTH e da vitamina D, a concentração de cálcio sérico se eleva, resultando na diminuição de PTH, completando o mecanismo clássico de feedback negativo (1,2,5).

Em contraste, na hipercalcemia ocorre a supressão da secreção de PTH e conseqüente redução da síntese de 1,25(OH)₂D₃, com resultante diminuição da reabsorção renal de cálcio, da mobilização do cálcio do osso e da absorção do cálcio pelo intestino. Neste caso, o excesso de cálcio circulante é "sentido" pelo CaR, que, uma vez ativado, sinaliza a informação para a célula paratiroideana secretar menos PTH. A hipercalcemia também estimula diretamente a secreção de calcitonina pelas células C tiroideanas através de um mecanismo de feedback positivo. A calcitonina é um hormônio que possui uma atividade hipocalcêmica e exerce sua função reduzindo o fluxo de cálcio do osso para o fluido extracelular e aumentando a excreção de cálcio. Entretanto, a calcitonina possui um efeito hipocalcêmico modesto em circunstâncias normais, quando comparado aos efeitos do PTH e da 1,25(OH)₂D₃ (1,2,5). Assim, esses 3 hormônios calciotrópicos agem em seus órgãos efetores, principalmente osso, intestino e rins, alterando o transporte dos íons cálcio para o interior ou para o exterior do fluido extracelular, modulando desta forma a manutenção da homeostase desse íon (1,4).

Receptor Sensível ao Cálcio Extracelular (CaR)

O CaR, estando expresso em todos os tecidos relacionados à manutenção da homeostase do Ca²⁺_o (6-11), exerce importante papel na manutenção desta homeostase. Expressão do CaR também é encontrada em tecidos sem função aparente no controle homeostático do Ca²⁺_o, como por exemplo mamas, pâncreas, diversas áreas do sistema nervoso central, queratinócitos, dentes etc... A função específica do CaR nestes tecidos ainda não está claramente estabelecida (1).

Subseqüentemente à clonagem do cDNA do CaR em paratiróide bovina (BoPCaR1) (3), homólogos do CaR bovino foram isolados em ratos (células C, cérebro, rim) (12), humanos (paratiróide, rim) (13,14), coelho (rim) (15) e galinha (paratiróide) (16), todos muito similares ao BoPCaR1. Os CaRs humano (1078 aminoácidos) e do rato (1079 aminoácidos), possuem estruturas altamente conservadas, com 93% de identidade com o BoPCaR1 (2,6,11). As características estruturais do CaR humano incluem um largo domínio extracelular (ECD) amino-terminal de 612 aminoácidos, um domínio central com cerca de 250 aminoácidos formando sete regiões transmembranosas, característico dos receptores acoplados à superfamília da proteína G (GPCRs), e uma cauda carboxi-terminal com mais de 200 aminoácidos (4,17).

O CaR pertence a uma subfamília de GPCRs onde também estão incluídos os seguintes receptores: receptor metabotrópico do ácido glutâmico (18), receptores de feromônios (19-21), receptores gustativos (22) e receptor do GABA_B (23).

A clonagem do CaR também possibilitou a identificação de doenças hereditárias decorrentes de mutações inativadoras e ativadoras do gene desse receptor (1,4,24). Esses fatos reforçaram a importância do CaR na homeostase do Ca²⁺_o e levaram os pesquisadores a uma reavaliação do conceito tradicional do papel desse íon. Neste sentido, o Ca²⁺_o não pode mais ser visto como um componente passivo do fluido extracelular, mas sim comportando como um hormônio que modula a função do tecido alvo através de seu próprio receptor (1).

Doenças associadas com mutações inativadoras do gene do CaR: Hipercalcemia Hipocalciúrica Familiar (FHH) e Hiperparatiroidismo Neonatal Severo (NSHPT)

Na FHH e no NSHPT, mutações inativadoras do gene do CaR levam a uma resistência generalizada ao Ca²⁺_o. Mais de 35 mutações inativadoras do gene do CaR já forma descritas em pacientes, com conseqüente FHH ou NSHPT (4,24). Muitas destas mutações são pontuais e se localizam no longo domínio extracelular do CaR, local de ligação do agonista cálcio ao receptor com sua conseqüente ativação (25). Entretanto, algumas mutações inativadoras já foram identificadas nos domínios transmembranosos e na cauda carboxi-terminal (4,24). Estudos funcionais com células HEK293 transfectadas com DNA do CaR contendo estas mutações descritas em pacientes com FHH ou NSHPT comprovam a capacidade diminuída desta CaR mutado em "sentir" os níveis de cálcio extracelular circulantes (26,27), através da demonstração de um EC₅₀ aumentado (por EC₅₀ entende-se a concentração efetiva de cálcio extracelular que proporciona metade da resposta máxima referente à liberação de cálcio intracelular, medida por estes estudos funcionais).

A FHH é doença com herança autossômica dominante com uma penetrância superior a 90% (28-30). A maioria das famílias com FHH apresenta um linkage do gene afetado com o cromossomo 3 (banda q21-24), que sabidamente alberga o gene do CaR. Uma exceção diz respeito a uma família aparentemente portadora de FHH e que apresenta linkage com o braço curto do cromossomo 19 (banda 19p 13.3) (31). A FHH é um distúrbio raro do metabolismo mineral caracterizado por hipercalcemia leve a moderada, geralmente assintomática. Esta hipercalcemia na maior parte dos casos não ultrapassa um valor de mais de 10% acima do limite superior da normalidade. O nível de PTH é inapropriadamente normal, e estes são os casos que podem criar dificuldades no diagnóstico diferencial entre FHH e os casos de hiperparatiroidismo primário com níveis de PTH normais. Os pacientes com FHH apresentam uma hipocalciúria relativa, frente à hipercalcemia vigente. Nestes casos, a razão do clearance renal de cálcio sobre o clearance de creatinina é inferior a 0,01. Esta razão geralmente é maior em pacientes com hiperparatiroidismo primário ou com outros distúrbios hipercalcêmicos. Os sintomas característicos e complicações que afetam pacientes com outras formas de hipercalcemia parecem não fazer parte da FHH. Entretanto, mesmo algumas famílias com FHH portadoras de hipercalciúria e/ou nefrolitíase já foram descritas (29,32). Alguns indivíduos de famílias com FHH apresentaram pancreatite, colelitíase ou condrocalcinose (24).

Em resumo, o diagnóstico de FHH pode ser estabelecido através da combinação de uma razão de clearance de cálcio sobre clearance de creatinina inferior a 0,01, nível de PTH normal e uma hipercalcemia leve e assintomática com herança autossômica dominante. Baseado nisso, é muito importante o diagnóstico diferencial com hiperparatiroidismo primário. Paratiroidectomia não está indicada nos pacientes com FHH e não deve melhorar a hipercalcemia destes casos, comprovando que o defeito nestes pacientes é intrínseco ao gene do CaR.

Via de regra, o valor da hipercalcemia nos pacientes com NSHPT é maior que nos pacientes com FHH. Os pacientes portadores de NSHPT apresentam hiperplasia de todas as paratiróides e esta doença pode ser fatal caso paratiroidectomia total não for realizada nas primeiras semanas de vida. O quadro clínico pode ser dramático, com presença de desmineralização óssea e múltiplas fraturas de ossos longos e costelas. Algumas crianças com NSHPT representam a forma homozigota da FHH (33). Mais raramente, pode ser verificada heterozigosidade composta, onde duas mutações inativadoras distintas foram herdadas, uma do pai e outra da mãe (34). Em alguns casos, pode ser observado o fenômeno de dominância negativa, onde um alelo mutado exerce um efeito inibidor sobre o alelo normal. Nesta situação, uma mutação inativadora heterozigota do gene do CaR, seja herdada ou de novo em uma criança com pais sem mutação no gene do CaR, pode levar à manifestação do fenótipo de NSHPT (35). Entretanto, é importante destacar que alguns relatos recentes documentam uma forma de NSHPT onde a hipercalcemia não era tão elevada e/ou transitória. Estes casos não estavam relacionados a famílias com FHH e podem responder bem ao tratamento clínico medicamentoso (24). Camundongos apresentando unicamente inativação heterozigota ou homozigota do gene do CaR foram estudados (36). Estes animais compartilham as alterações bioquímicas apresentadas por pacientes portadores de FHH e NSHPT, o que reforça a importância fisiológica do CaR no metabolismo mineral iônico.

Doença associada com mutações ativadoras do CaR: Hipocalcemia Autossômica Dominante

A hipocalcemia autossômica dominante é decorrente de mutações ativadoras do gene do CaR. Até o presente, mais de 20 mutações ativadoras distintas já foram descritas em pacientes portadores de hipocalcemia autossômica dominante (4,24). Da mesma forma que as mutações inativadoras, a maioria das mutações ativadoras do gene do CaR localiza-se no ECD. Mutações do gene do CaR em pacientes com hipocalcemia autossômica dominante via de regra levam a uma sensibilidade aumentada ao cálcio extracelular (37,38). A exceção a esta regra diz respeito a uma mutação constitutivamente ativadora (A843E) localizada no sétimo domínio transmembranoso do CaR (39). Estas mutações ativadoras, quando expressas em células HEK293 e estudadas funcionalmente, resultam em reduções do EC₅₀, o que denota uma sensibilidade aumentada ao agonista cálcio (26,38,40). Indivíduos afetados de famílias com hipocalcemia autossômica dominante apresentam hipocalcemia de graus variados (geralmente entre 6,0 e 8,0mg/dL) na presença de níveis de PTH inapropriadamente baixos. Os níveis de PTH geralmente são mais baixos nos pacientes portadores de hipoparatiroidismo do que nos pacientes com hipocalcemia autossômica dominante. A presença de uma mutação ativadora do CaR, contrariamente ao que é observado na FHH, reduz a reabsorção renal de cálcio diante de uma calcemia inapropriadamente baixa (37). Desta forma, observamos uma hipercalciúria relativa nestes pacientes com hipocalcemia autossômica dominante.

Os pacientes com hipocalcemia autossômica dominante geralmente apresentam poucos sintomas. Entretanto, alguns pacientes mais jovens podem apresentar convulsões. Outros sintomas de hipocalcemia, como parestesias e tetania não são comuns (24). Hiperfosfatemia e hipomagnesemia podem ser observadas em alguns pacientes. A resposta ao tratamento com vitamina D é um diferencial em relação ao hipoparatiroidismo. No caso de pacientes com hipocalcemia autossômica dominante, a tentativa de reposição de cálcio e principalmente de vitamina D com o intuito de normalizar a calcemia pode piorar a hipercalciúria, podendo chegar ao ponto de apresentarem nefrocalcinose. Alguns pacientes também apresentam um diabetes insipidus nefrogênico. Isto reforça a idéia de que, nestes pacientes com hipocalcemia autossômica dominante, o sistema homeostático do cálcio está adaptado a uma calcemia inferior à calcemia normal e eventuais tentativas de torná-los normocalcêmicos podem resultar em hipercalciúria e diabetes insipidus nefrogênico (41). Assim, muito cuidado deve ser tomado no sentido de evitar o excesso de tratamento da hipocalcemia autossômica dominante com vitamina D ou suplementos de cálcio. O risco de nefrocalcinose durante o tratamento pode ser minimizado através da monitorização periódica da excreção urinária de cálcio (42).

Comentário final: Potencial terapêutico de drogas que modulam a atividade do CaR

Considerando que o CaR representa um alvo terapêutico em potencial, alguns compostos estão sendo testados com o objetivo de ativar o CaR (calcimiméticos) (43,44) ou inativá-lo (calciolíticos) (45,46).

Os calcimiméticos são compostos orais que ativam o CaR e conseqüentemente aumentam a sensibilidade do CaR ao cálcio extracelular, resultando em uma menor secreção de PTH. Diferentemente do agonista cálcio que ativa o CaR ligando-se a sítios de ligação situados principalmente no domínio extracelular (25), o local de ação do calcimimético R-568 parece estar situado especificamente nos domínios transmembranosos (40). Esta inibição da secreção de PTH foi demonstrada in vitro e em pacientes portadores de hiperparatiroidismo primário (47,48) e urêmico (49,50). Desta maneira, constituem-se em excelentes candidatos para o manejo clínico de determinados casos de hiperfunção paratiroideana e de sua conseqüente hipercalcemia, como por exemplo em pacientes sem condições clínicas para um procedimento cirúrgico.

Neer e cols. (51) recentemente comprovaram o efeito benéfico do PTH 1-34 no tratamento de osteoporose na pós-menopausa. Estes autores verificaram que o uso de PTH 1-34 por via subcutânea diária esteve associado a um aumento significativo de massa óssea em fêmur e coluna vertebral e a um menor risco de fraturas vertebrais e não vertebrais. Com isto em mente, o desenvolvimento e a aplicabilidade clínica de uma droga calciolítica para o tratamento da osteoporose parece muito promissor. Tal droga, cuja farmacodinâmica é muito atraente por ser administrada via oral, age antagonizando o CaR e conseqüentemente estimula a secreção de PTH (45,46).

Endereço para correspondência:

Omar M. Hauache

Disciplina de Endocrinologia - UNIFESP/EPM

Rua Pedro de Toledo 781 - 12^o andar

04039-032 São Paulo, SP

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e.mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Nov 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Aceito
  03 Mar 2002
• Revisado
  27 Fev 2002
• Recebido
  15 Jan 2002