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Marcadores biológicos de tumores tiroidianos

Biological markers in thyroid tumors

Resumos

Um marcador biológico ideal deve ser específico e sensível para identificar o tipo tumoral e caracterizar o estágio da progressão neoplásica. Os tumores de tiróide originam-se de dois tipos celulares: 1) carcinoma medular originário de células parafoliculares; e 2) as neoplasias de células epiteliais foliculares, que incluem bócio, adenomas, carcinomas diferenciados (carcinoma papilífero e carcinoma folicular) e carcinoma indiferenciado (carcinoma anaplásico). O comportamento biológico distinto faz com que cada tipo tumoral necessite de uma conduta terapêutica específica. O conhecimento acumulado ao longo destes anos, utilizando métodos de biologia molecular e, mais recentemente, a genômica, identificou mutações específicas de câncer de tiróide e, atualmente, entendemos muito das alterações que ocorrem na expressão de fatores de crescimento, seus receptores e proteínas sinalizadoras intracelular nas neoplasias tiroidianas. Contudo, apesar desses, até o momento não dispomos de um marcador eficiente que auxilie no diagnóstico e prognóstico e, conseqüentemente, para indicação de uma terapêutica mais adequada. Nesta revisão, discutiremos os principais aspectos relacionados à tumorigênese tiroidiana, avaliando o potencial destes fatores como marcador em neoplasia folicular de tiróide.

Marcador biológico; Tiróide; Tumores de tiróide; Câncer de tiróide; Tumorigênese


Thyroid tumors originate from two cell types: 1) medullar carcinoma from parafolicullar cells and 2) the tumors derived from follicular epithelial cells, which include multinodular goiter, adenomas, differentiated carcinomas (papillary and follicular carcinoma) and undifferentiated carcinoma (anaplastic carcinoma). Because of the tumors distinct biological behavior, there is a requirement for a specific therapeutic approach. Some thyroid cancer specific mutations have been identified using molecular biology and more recently, genomic methodology. We now understand much of the alterations that occur in the expression of growth factors, receptors and the intracellular signaling pathway. However, none of these have yet proven to be efficient as a marker for diagnosis and prognosis, nor are they helpful in establishing a targeted therapeutic approach. In this review, we will discuss the main aspects of thyroid tumorigenesis and evaluate the potential of these factors as markers for thyroid follicular neoplasia.

Biological markers; Thyroid; Thyroid tumors; Thyroid cancer; Tumorigenesis


ATUALIZAÇÃO

Marcadores biológicos de tumores tiroidianos

Biological markers in thyroid tumors

Sílvia E. Matsuo; Luciane Martins; Suzana G. Leoni; Denise Hajjar; Júlio Cézar M. Ricarte-Filho; Kátia N. Ebina; Edna T. Kimura

Departamento de Histologia & Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência Edna T. Kimura Departamento de Histologia & Embriologia, ICB, USP Av Prof Lineu Prestes 1524 05508-900 São Paulo, SP e.mail: etkimura@usp.br

RESUMO

Um marcador biológico ideal deve ser específico e sensível para identificar o tipo tumoral e caracterizar o estágio da progressão neoplásica. Os tumores de tiróide originam-se de dois tipos celulares: 1) carcinoma medular originário de células parafoliculares; e 2) as neoplasias de células epiteliais foliculares, que incluem bócio, adenomas, carcinomas diferenciados (carcinoma papilífero e carcinoma folicular) e carcinoma indiferenciado (carcinoma anaplásico). O comportamento biológico distinto faz com que cada tipo tumoral necessite de uma conduta terapêutica específica. O conhecimento acumulado ao longo destes anos, utilizando métodos de biologia molecular e, mais recentemente, a genômica, identificou mutações específicas de câncer de tiróide e, atualmente, entendemos muito das alterações que ocorrem na expressão de fatores de crescimento, seus receptores e proteínas sinalizadoras intracelular nas neoplasias tiroidianas. Contudo, apesar desses, até o momento não dispomos de um marcador eficiente que auxilie no diagnóstico e prognóstico e, conseqüentemente, para indicação de uma terapêutica mais adequada. Nesta revisão, discutiremos os principais aspectos relacionados à tumorigênese tiroidiana, avaliando o potencial destes fatores como marcador em neoplasia folicular de tiróide.

Descritores: Marcador biológico; Tiróide; Tumores de tiróide; Câncer de tiróide; Tumorigênese

ABSTRACT

Thyroid tumors originate from two cell types: 1) medullar carcinoma from parafolicullar cells and 2) the tumors derived from follicular epithelial cells, which include multinodular goiter, adenomas, differentiated carcinomas (papillary and follicular carcinoma) and undifferentiated carcinoma (anaplastic carcinoma). Because of the tumors distinct biological behavior, there is a requirement for a specific therapeutic approach. Some thyroid cancer specific mutations have been identified using molecular biology and more recently, genomic methodology. We now understand much of the alterations that occur in the expression of growth factors, receptors and the intracellular signaling pathway. However, none of these have yet proven to be efficient as a marker for diagnosis and prognosis, nor are they helpful in establishing a targeted therapeutic approach. In this review, we will discuss the main aspects of thyroid tumorigenesis and evaluate the potential of these factors as markers for thyroid follicular neoplasia.

Keywords: Biological markers; Thyroid; Thyroid tumors; Thyroid cancer; Tumorigenesis

A GLÂNDULA TIRÓIDE ESTÁ SOB O CONTROLE da tirotropina hipofisária (TSH) e do iodo, os quais regulam sua função e proliferação. A tiróide adulta caracteriza-se pela baixa renovação de suas células foliculares; entretanto, mantém o potencial para proliferar em resposta a estímulos. A incidência do nódulo tiroidiano palpável, na população geral, é de cerca de 4 a 7%, contudo, com o advento da ultra-sonografia, a prevalência sobe para 30%, mostrando uma alta capacidade mitogênica do tecido. Os nódulos são, em sua grande maioria, lesões benignas que incluem bócio colóide e os adenomas foliculares atóxico e tóxico, enquanto uma pequena porção corresponde ao câncer. Os carcinomas de tiróide se originam de dois tipos celulares: carcinoma medular originário de células parafoliculares e as neoplasias de células epiteliais foliculares. Dentre as neoplasias foliculares malignas, mais de 90% são carcinomas diferenciados papilíferos e carcinomas foliculares, e cerca de 1% corresponde ao carcinoma indiferenciado ou anaplásico, a neoplasia folicular mais agressiva da tiróide. Os adenomas e carcinomas de Hürthle, também de origem folicular, representam formas variantes de neoplasia. O câncer de tiróide constitui a neoplasia endócrina mais comum, responsável por 1.200 mortes anualmente nos Estados Unidos, sendo maior a incidência de câncer em mulheres e em indivíduos acima de 40 anos. Fatores ambientais influenciam no desenvolvimento do câncer de tiróide, como a exposição à radiação, predispondo ao carcinoma papilífero e fatores nutricionais sugeridos pela maior incidência de carcinoma folicular observada na população iodo-deficiente (1,2).

O câncer surge de uma mutação inicial em algum gene envolvido na regulação de proliferação e/ou diferenciação celular, ocorrendo, então, expansão clonal da célula geneticamente modificada devido à sua maior capacidade de proliferar e escapar ao controle do ciclo celular e dos sinais que induzem a apoptose, predispondo ao acúmulo de mutações sucessivas (3). O entendimento da tumorigênese depende da identificação de mutações que levam à expansão clonal. Na tiróide, padrão de expansão clonal é observado tanto em neoplasias benignas (bócios e adenomas) quanto malignas (4,5). Até o momento, foram identificadas mutações no gene do receptor de TSH (TSHR) e mutações de GSP em adenomas hiperfuncionantes; mutação de RAS é encontrada tanto em lesões benignas quanto malignas, mas predominantemente em carcinoma folicular; rearranjo PAX-8/PPARl em carcinoma folicular; mutação de p53 em carcinoma anaplásico, rearranjo RET/PTC e de TRK-T em carcinoma papilífero e, mais recentemente, mutação de BRAF em carcinoma papilífero. Interessantemente, em carcinomas papilíferos não se observa sobreposição de mutação de genes RET/PTC ao de BRAF e de RAS, refletindo uma diversidade biológica desta neoplasia que necessita ser elucidada. Entretanto, mesmo sem a identificação precisa destas mutações, podemos observar uma série de alterações na expressão ou função de fatores de crescimento, receptores e sinalizadores intracelulares, que auxiliam no entendimento da patogênese, com potencial como marcador em tumores de tiróide (6-8). A figura 1 representa as principais alterações genéticas observadas na tumorigênese da tiróide, idealizadas segundo o modelo Volgenstein de evolução neoplásica progressiva (3).


Discutiremos, a seguir, alterações dos principais fatores envolvidos na proliferação e diferenciação da célula folicular tiroidiana e a contribuição destes na tumorigênese da tiróide. Na tabela 1, os mesmos estão agrupados em diferentes categorias arbitrárias.

Marcadores Específicos da Diferenciação Tiroidiana

Receptor de TSH

TSHR é uma proteína da família de receptores com 7 segmentos transmembranosos associada à proteína G. A sub-unidade * da proteína G, GSP, transmite o sinal intracelular gerado pela interação do TSH ao receptor, através das vias adenil ciclase/cAMP ou fosfolipase C, regulando a proliferação e síntese de hormônios tiroidianos. Mutações em ponto do gene de TSH-R ou do gene de GSP resultam na ativação constitutiva, sendo observadas em cerca de 50% do adenoma hiperfuncionante (Doença de Plummer) (9). A ativação constante desta via, independente da presença de TSH, estimula a proliferação e, também, a maior produção de hormônios tiroidianos. As mutações promotoras de "ganho de função" do TSHR se concentram na terceira alça citoplasmática ou nos segmentos transmembranosos 6 e 7 (10). Devido à importância desta via regulatória na célula tiroidiana, alterações nesta via poderiam estar presentes em câncer de tiróide. Entretanto, associação entre mutações de TSH-R ou de GSP e malignidade tiroidiana não é um achado freqüente (11).

Tiroglobulina

A tiroglobulina (TG) é uma glicoproteína de alto peso molecular (660kDa), fundamental para síntese e armazenamento de hormônio tiroidiano. A TG é sintetizada exclusivamente pelas células foliculares tiroidianas, sendo a dosagem sérica utilizada no acompanhamento dos pacientes após terapêutica do câncer. Mais recentemente, medida de mRNA de TG em sangue periférico tem aumentado a sensibilidade desta investigação para detecção precoce de células foliculares residuais no organismo pós tiroidectomia. Até o momento, não existe associação desta molécula com a tumorigênese da tiróide (12,13).

Peroxidase Tiroidiana

A peroxidase tiroidiana ou TPO (do inglês, thyroid peroxidase), enzima específica da célula folicular tiroidiana, desempenha papel fundamental na formação do hormônio tiroidiano, em múltiplas etapas que envolvem o iodo, tais como na catalizando a oxidação do iodo, na organificação da tiroglobulina e acoplamento de iodotironinas. A ausência de expressão de TPO reflete a perda da diferenciação celular, pois esta enzima está envolvida em importantes etapas da síntese hormonal. Mutação somática de TPO foi observada em nódulos hipocaptantes, sugerindo que esta enzima poderia estar contribuindo para o aumento da proliferação celular (14). Um mecanismo indireto pelo qual mutação no gene TPO poderia favorecer a atividade mitótica da célula folicular seria pela falência falência na formação de iodolactona, um inibidor de proliferação celular (15). A avaliação do grau de diferenciação dos tumores de tiróide pela análise da expressão protéica de TPO em tecido tumoral ou material de PAAF vem sendo realizada por diferentes grupos. A expressão de TPO é alta em tecidos normais, porém baixa ou ausente em neoplasias malignas, Eentretanto, até o momento não existe um consenso que permita utilizar TPO como marcador molecular de malignidade (7,16).

NIS

O NIS (do inglês, Na/I symporter) é uma glicoproteína integral da membrana plasmática, responsável pela captação de iodo nas células foliculares tiroidianas e em outros tecidos, como a glândula salivar, glândula mamária e estômago (17).

A presença de NIS na membrana basal da célula folicular garante a entrada de iodo, que será organificado e armazenado no folículo tiroidiano. Esta característica da tiróide é importante na terapia ablativa por radioiodo e tem garantido o sucesso no tratamento de carcinomas diferenciados de tiróide e de metástases. A redução da concentração de radioiodo é observada em tecidos malignos, sugerindo expressão de NIS diminuída mesmo em carcinomas diferenciados como papilífero e folicular (18,19). Entretanto, outros trabalhos mostram expressão aumentada de mRNA e proteína de NIS em câncer de tiróide (20,21). Embora a imunoexpressão de NIS seja observada em câncer de tiróide, estudos imuno-histoquímicos sugerem que a predominante localização intracelular e escassa marcação imuno-histoquímica em membrana plasmática poderiam ser reflexo do comprometimento do trafficking da proteína NIS no interior das células foliculares neoplásicas (17). Visando restaurar ou induzir a expressão de NIS em câncer, alguns pesquisadores testaram a capacidade da transferência gênica de NIS em células tumorais para posterior terapêutica com radioiodo (22). Terapia gênica de NIS em câncer de próstata mostrou-se eficaz para tratamento subseqüente com I131in vitro e in vivo (23). Estes resultados experimentais de manipulação do gene NIS são promissores para futura utilização em pacientes com câncer pouco diferenciados de tiróide, assim como naqueles com câncer de outros tecidos.

TTF-1 e PAX8

TTF-1 (do inglês, thyroid transcription factor 1), juntamente com PAX8, são importantes fatores de transcrição específicos para os genes da TG, TPO, NIS e receptor de TSH, componentes centrais do desenvolvimento e função celular da tiróide. Camundongos knockout de TTF-1 não conseguem desenvolver a tiróide, e animais, na ausência de PAX8, desenvolvem glândula dis-hormoniogênica, pois não expressam TG e TPO (24,25). A análise dos níveis de RNA mensageiro em tumores de tiróide mostra que a expressão de TTF-1 e de PAX8 está preservada em adenomas, mas diminuída em carcinoma papilífero e folicular, e ausente em carcinomas anaplásicos. A observação experimental confirma o importante papel da perda funcional de TTF-1 e de PAX8 nos carcinomas indiferenciados, pois células de carcinomas anaplásicos transfectadas com de vetores que induzem a reexpressão destes genes voltam a expressar TG e TPO (26). Desta forma, mais do que indicadores do estado de diferenciação da célula folicular no câncer, TTF-1 e PAX8 são potentes genes alvos a serem corrigidos em terapia gênica direcionada para o tratamento de carcinoma indiferenciado de tiróide.

Rearranjos Cromossômicos

Rearranjos cromossômicos são associados com câncer e representam um dos mecanismos de ativação de oncogene. RET/PTC, TRK-T e PAX8-PPARg1 são rearranjos típicos observados exclusivamente em câncer de tiróide.

RET/PTC

O gene RET codifica um receptor de membrana tirosino-quinase (TK,do inglês tyrosine-kinase) envolvido na transdução de sinais para a proliferação, diferenciação e migração no desenvolvimento de células da crista neural. Célula folicular de tiróide normal não expressa RET; no entanto, rearranjos de RET estão presentes em cerca de 20-25% dos carcinomas papilíferos de tiróide (27). Os rearranjos são resultado da fusão do domínio tirosino-quinase do gene RET à porção 5' de genes heterólogos e formam oncogenes quiméricos RET/PTCs classificados de 1 a 8 e, mais recentemente, outros dois rearranjos foram descritos (figura 2) (28). Os rearranjos de maior incidência são RET/PTC 1, derivado de uma inversão paracêntrica do braço longo do cromossomo 10 resultando no oncogene D10S170(H4)-RET, e RET/PTC 3 e 4, originados de um rearranjo no cromossomo 10, sobrepondo o domínio RET-TK à porção 5' do gene ELE 1 (28). A ativação constitutiva de RET/PTC leva à interação com SHC, um intermédio da via de sinalização RAS. A capacidade oncogênica de RET/PTC é dependente da integridade da via SHC-RAS-RAF-MEK.


Em carcinoma papilífero de adulto, o rearranjo mais observado é o RET/PTC1. A maior freqüência de ativação de RET/PTC foi encontrada em crianças com carcinoma papilífero de tiróide, expostas à radiação emitida em Chernobyl, 1996, que, na maioria, apresentavam rearranjo RET/PTC3 (29).

PAX8/PPARg

Rearranjo envolvendo os genes PAX-8 e PPARg1 (do inglês, peroxisome proliferator activated receptor) foi identificado por Kroll e cols. (30) exclusivamente em carcinoma folicular. Este rearranjo é uma translocação t(2;3)(q13;p25) que ocasiona a fusão do domínio de ligação do fator de transcrição de tiróide PAX8 ao domínio A a F do gene PPARg, cujo produto é a proteína quimérica Pax8-PPARg1 com atividade oncogênica, como mostrado na figura 3. A observação inicial de que mais de 50% dos carcinomas foliculares apresentavam Pax8-PPARg1, foi confirmada por outros que também mostravam o grande potencial de Pax8-PPARg1 em distinguir adenoma folicular de carcinoma folicular (30,31). Por outro lado, relatos mais recentes mostram que adenomas apresentam rearranjo Pax8-PPARg1 em número considerável (32,33). Segundo Kroll (34), Pax8-PPARg1 está associado ao estadiamento precoce do carcinoma folicular; porém não sabemos, ainda, se o rearranjo que tem sido observado em adenomas por outros autores representaria um indício precoce de transformação maligna.


TRK-T

NTRK1 codifica um dos receptores do fator de crescimento neural (do inglês nerve growth factor), e rearranjos deste genes com seqüências cromossômicas aleatórias resultam em diferentes produtos quiméricos. Estas proteínas, denominadas TRK-T1, TRK-T2 e TRK-T3, apresentam atividade oncogênica e estão presentes em carcinoma papilífero. São menos investigados do que os rearranjos RET/PTC, mas foram observados em 15% dos carcinomas papilíferos (35).

Reguladores do Ciclo Celular

Os fatores de crescimento atuam estimulando ou inibindo a progressão do ciclo celular. Na última década, a influência de grande número de fatores de crescimento com ação proliferativa, entre os quais o fator de crescimento insulin-like (IGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), assim como expressão de fatores de crescimento com ação antimitogênica, representados pelo fator de crescimento transformador beta (TGFß), foi estudada em células foliculares da tiróide utilizando modelos in vitro e in vivo. Ao mesmo tempo, consolidou-se o conceito de que células foliculares sintetizam fatores de crescimento, os quais contribuem na mitogênese por mecanismo autócrino/parácrino na glândula tiroidiana (36).

Desta forma, mostramos que IGF-I e IGF-II, peptídeos de aproximadamente 7kDa, são expressos em células foliculares da tiróide e atuam de maneira autócrina promovendo a proliferação celular. Em linhagem FRTL-5, o TSH estimula a síntese de mRNA de IGF-II, contribuindo para o seu efeito mitogênico (37-39).

O HGF, um fator mitogênico para células foliculares da tiróide, se liga a um receptor TK específico, o proto-oncogene MET. Diversos mecanismos contribuem para ativação constitutiva de MET, perpetuando o efeito do HGF. Amplificação do MET é observada predominantemente em carcinoma papilífero e anaplásico (40).

A ação proliferativa do EGF inicia-se pela interação com seu receptor EGFR, uma TK codificada pelo proto-oncogene c-erb-B, desencadeando cascata que envolve a via MAPK (do inglês MAPK: mitogen-activated protein kinase). O aumento de expressão de EGF e de EGF-R é observado em tumores de tiróide, com maior expressão em carcinoma. A ação de EGF pode ser bloqueada tanto pelos inibidores do receptor quanto da via MAPK por ela ativada (41,42).

Durante a evolução da transformação maligna, pode ocorrer falência da célula em sustentar, expressar ou responder a fatores de crescimento inibitórios do ciclo celular. Em tecido epitelial, TGFß é um protótipo de fator de crescimento antiproliferativo que atua na fase G1 tardia do ciclo celular interrompendo a progressão para a fase S.

TGFß é uma proteína dimérica de 25kDa, que inicia sua ação através da ligação com seus receptores de membrana serino-treonina quinase, os quais desencadeiam sinalização intracelular mediada por diversas proteínas da família SMAD (43). O efeito antiproliferativo de TGFß envolve a hipofosforilação de RB, ativação de ciclinas inibitórias e inibição da transcrição de C-MYC (44). Em célula folicular da tiróide, o iodo aumenta o mRNA de TGFß e, curiosamente, ambos diminuem expressão do NIS, sugerindo uma inter-relação destes fatores na função tiroidiana (45,46). Activina, uma proteína dimérica de cerca de 24kDa, também é membro da superfamília de TGFß e, quando se liga a receptores específicos, desencadeia sinalização intracelular SMAD dependentes, similar ao de TGFß. Inicialmente reconhecidas pelo seu efeito estimulatório na síntese de FSH, as activinas atuam em diversos outros tecidos, inclusive na tiróide (47). Apesar de serem fatores antimitogênicos para célula folicular tiroidiana, a expressão de diferentes isoformas de TGFß (TGFß1, TGFß2 TGFß3) e de activina (activina A, activina B), assim como os SMADS da via de sinalização direcionada para o núcleo celular, SMAD2, SMAD3 e SMAD4, é observada em tumores benignos e em carcinomas de tiróide, o que mostra a integridade desta via (48-50). Por outro lado, a expressão aumentada de SMAD7, uma proteína inibitória da via SMAD 2/3 e 4, em carcinoma e, mais acentuadamente, em linhagem anaplásica de tiróide, sugere um mecanismo de escape à ação de TGFß/activina (51). O escape ao efeito inibitório de TGFß foi observado em cultura primária de tiróide humana proveniente de bócio (52).

A expressão alterada dos fatores de crescimento, tanto estimulatórios quanto inibitórios, nos processos neoplásicos da tiróide não parece ser o fator etiológico, mas uma conseqüência do processo proliferativo descontrolado, desencadeado por um ou mais eventos-chave ainda desconhecidos.

Fator Angiogênico

Vascular endothelial growth factor (VEGF) é uma glicoproteína de 46kDa, que estimula a formação de vasos sangüíneos, a regeneração endotelial e aumenta a permeabilidade vascular. VEGF possui um importante papel na tumorigênese da tiróide, sendo possivelmente modulado por TSH (53). Linhagens de carcinoma celular secretam maior quantidade de VEGF após estímulo com TSH; entretanto, curiosamente, a administração de TSH recombinante em pacientes mostra diminuição do nível sérico de VEGF. Tanto em linhagens de carcinomas de tiróide quanto em tecidos tumorais, observa-se que o elevado nível de expressão de VEGF está associado a um alto potencial tumorigênico. Carcinomas papilíferos e foliculares apresentam expressão aumentada de mRNA e da proteína VEGF, quando comparada com tecidos normais ou tumores benignos (54). Um estudo experimental mostrou que utilização de anticorpo monoclonal anti-VEgF por via sistêmica é eficaz na redução do tamanho do carcinoma papilífero (55).

Associado ao VEGF, ocorre um aumento da expressão de outros fatores angiogênicos como VEGF-C e angiopoietin-2. A alteração dos níveis destes fatores, combinada com a perda progressiva da expressão de inibidores de VEGF, como trombospondin (TSP-1), pode determinar um fenótipo angiogênico, aumentando o potencial metastático do carcinoma (53).

P53

P53, conhecido como um gene de supressão tumoral, é um fator de transcrição que controla a integridade do genoma celular atuando no reparo do DNA (56). Células que perdem a atividade de P53 tornam-se vulneráveis à transformação maligna, pois acumulariam danos cromossômicos decorrentes da exposição a agentes nocivos, como radiação, droga ou outro estresse. Em câncer de tiróide, a mutação de P53 que gera proteína inativa é observada em alta incidência em câncer indiferenciado ­ o carcinoma anaplásico e, quando presente em carcinomas papilífero e folicular, afetam o subtipo pouco diferenciado (57). O reparo da mutação de P53 em linhagem de carcinoma anaplásico diminui a proliferação celular e restaura a diferenciação, restabelecendo a expressão de TPO e Pax-8 (58,59). A mutação de P53 é considerada um evento tardio da progressão tumoral, assim sendo, uma terapêutica mais agressiva deveria ser considerada quando carcinomas "ainda" diferenciados apresentam esta mutação.

Sinalizadores Intracelulares

RAS

O proto-oncogene RAS, o qual inclui as isoformas H-RAS, K-RAS, N-RAS, sintetiza um grupo de proteínas de 21kDa com importante papel na tumorigênese e na progressão tumoral em grande variedade de tecidos. A proteína RAS quando ativada desencadeia a via de sinalização intracelular ERK-MAPK (do inglês, ERK: extracellular ligand-regulated kinase). A mutação de RAS, predominantemente nos códons 12, 13 e 61, é encontrada em ampla gama de tumores humano (30%), inclusive na tiróide (60). Além da mutação que ativa a proteína RAS constitutivamente, a amplificação do gene ocasiona instabilidade genômica, propiciando o aparecimento de outras mutações que levam à progressão da transformação neoplásica. Estudos in vitro e in vivo, onde mutação de RAS são introduzidas em células foliculares tiroidianas, observa-se atividade oncogênica, induzindo proliferação e de-diferenciação das células. Curiosamente, foi observado que mutação H-RasG12V ocasiona apoptose em células foliculares, quando estas se encontram em situação de hiper-estímulo da sinalização de TSH-cAMP (61).

Mutação RAS é mais comumente encontrada em carcinoma anaplástico (58%), seguida por carcinoma folicular (32%), adenoma folicular (35%), carcinomas papilíferos (18%) e, em menor número, em adenomas hiperfuncionantes (7%) (62).

Mutação de RAS é considerada um evento precoce da tumorigênse tiroidiana, pois é observada em lesões benignas de tiróide e, mesmo quando não mutada, a expressão protéica de RAS está comumente aumentada em bócios (63). Carcinomas apresentam maior freqüência de mutação RAS; entretanto, a presença de mutação não é um indicador útil para prognóstico de comportamento agressivo em tumores de tiróide.

BRAF

BRAF é uma das isoformas da proteína RAF e um componente essencial da via RAS-MEK-MAPK, atuando como efetor da sinalização RAS nesta cascata (64). A mutação de BRAF foi evidenciada recentemente em 66% de melanomas e em cerca de 15% de câncer de colo retal (65). A mutação mais freqüente observada em BRAF envolve a translocação de timina pela adenina na posição 1796 (T1796A) no exon 15, o que leva à subsituição do aminoácido valina para ácido glutâmico na posição 599 (V599E) da proteína. A troca do aminácido ativa a proteína, pois propicia a fosforilação constitutiva dos aminoácidos adjacentes, conferindo capacidade oncogênica (figura 4). Em tumores de tiróide, observa-se mutação de BRAFV599E em 35% dos carcinomas papilíferos, mas não foi encontrada em nenhum caso de carcinoma folicular, adenoma ou bócio (8,66). Curiosamente, a mutação BRAF não ocorre em concomitância à mutação de RAS ou de rearranjo RET-PTC , indicando alteração genéticas distintas na patogênese do carcinoma papilífero (8). A observação mais recente de mutação BRAF, presente em alguns casos de carcinomas anaplásico, associada ao predomínio de mutação em carcinoma papilífero pouco-diferenciado, sugere a possibilidade de um envolvimento de BRAFV599E na progressão tumoral mais agressiva (67).


C-MYC, Ki67 e PCNA

A agressividade dos tumores tiroidianos pode ser demonstrada através da atividade proliferativa de suas células. C-MYC, antígenos associados ao ciclo celular - Ki-67 e antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA) são proteínas nucleares envolvidas na regulação da proliferação celular. A presença destas proteínas é indicativa de células em proliferação celular.

O proto-oncogene C-MYC é um fator de transcrição que ativa a expressão de uma série de genes regulatórios da proliferação e diferenciação celular, e sua expressão constitutiva está associada a diversos tumores. Na tiróide, fatores de crescimento e TSH induzem a expressão de C-MYC, ativando a progressão do ciclo celular. Em linhagens celulares mais agressivas da tiróide, observa-se maior expressão de C-MYC, sugerindo envolvimento deste gene na progressão tumoral. Entretanto, em tecidos de tumores de tiróide, foi descrita alta expressão de C-MYC, tanto em neoplasias benignas quanto malignas da tiróide (68).

O Ki-67 e o PCNA são marcadores localizados no núcleo celular e são bastante utilizados para identificar células em proliferação, normalmente em conjunto com outros oncogenes. O anticorpo monoclonal Ki-67 detecta uma proteína nuclear, originalmente descrita por Gerdes e cols. (69), e deriva de camundongos imunizados com o núcleo da linhagem celular L428. Este anticorpo marca núcleos das células em diferentes fases do ciclo celular (fase G1, S, G2 e M), mas não marcam aqueles em quiescência (G0). Além da tentativa de utilização isolada deste marcador no carcinomas de tiróide, onde a expressão está aumentada, o Ki-67 foi utilizado em conjunto com a investigação de P53 (70). O PCNA, um polipeptídeo nuclear de 36kDa, é uma proteína auxiliar à DNA d polimerase, sintetizada durante as fases G1 tardia e S do ciclo celular. Um anticorpo monoclonal específico, PC10, é capaz de detectar esta proteína no núcleo da célula em proliferação em ensaio imunohistoquímico (71). Células PCNA positivas, como indicador de proliferação, estão aumentadas em carcinomas folicular e papilífero em comparação aos tecidos normais. Em carcinomas anaplásicos, o índice de células PCNA positivas é extremamente alto e se correlaciona com a expressão de p53 (72). Entretanto, apesar da tentativa de associar a positividade de PCNA para auxiliar no diagnóstico, este marcador não é capaz de discriminar lesões tumorais benignas de malignas.

Outros Marcadores

Telomerase

Telomerase humana é uma transcriptase reversa, constituída de uma sub-unidade de RNA (hTR) e uma sub-unidade protéica catalítica (hTERT), responsável pela síntese do DNA telomérico. Os telômeros são seqüências de DNA repetitivas, (TTAGGG)n, localizadas nas extremidades dos cromossomos. A manutenção da estabilidade cromossômica durante a replicação do DNA é mantida pela presença dos telômeros. A telomerase é abundante em células embrionárias, mas está ausente na maioria dos tecidos somáticos adultos. Entretanto, em células tumorais, há uma franca atividade telomerase (73).

Na tiróide, estudos em tecidos e linhagens celulares tumorais utilizando ensaio TRAP mostram que a atividade da telomerase é predominantemente observada em carcinomas diferenciados e indiferenciados, mas pouco observada ou ausente em adenomas foliculares e tecido normal (74,75). A medida da atividade da telomerase poderia representar uma importante ferramenta diagnóstica e prognóstica; no entanto, além de ser um procedimento difícil e pouco utilizado em laboratórios clínicos, o ensaio TRAP pode gerar resultados falso-positivos devido à infiltração de linfócitos. Alternativamente, detecção da expressão mRNA de hTERT foi realizada em tecidos tumorais de punção aspirativa de agulha fina (PAAF), mostrando que o mRNA de hTERT é expresso, predominante, em tumores malignos e ausente nos tumores benignos; entretanto, outros mostram expressão de mRNA de hTERT em 42% dos tumores benignos e 63% dos malignos (7,76,77).

Além dos resultados contraditórios, as dificuldades metodológicas do ensaio, tanto por TRAP ou por hTERT, dificultam a utilização sistemática da medida da telomerase na prática clínica. Recentemente, um procedimento menos trabalhoso e altamente sensível de ensaio TRAP poderá facilitar a investigação de atividade telomerase (75).

Galectina-3

Galectina-3 é um membro da crescente família de lectinas animais, ligando ß-galactosídeos, que desempenha múltiplas funções biológicas, tais como, na adesão celular, proliferação, diferenciação e progressão tumoral (78). Na tiróide, desde os trabalhos iniciais que mostravam que mais de 90% de lesão tiroidiana maligna expressavam galectina 3, expressão esta observada quase que exclusivamente em carcinomas folicular e papilífero, sugeria que galectina-3 poderia ser um marcador de malignidade em neoplasia da tiróide (79-81). Neste contexto, em trabalho recente, observou-se que expressão da proteína galectina-3 não é exclusiva de tumores malignos, e está expressa em adenomas foliculares (14/31) e bócios multinodulares (4/24) (82). A avaliação dos níveis de mRNA de galectina-3 revelam que, tanto carcinomas quanto adenomas e bócios, expressam mRNA de galectina-3 (82). Assim como, em material proveniente de punção aspirativa de agulha fina (PAAF) de adenomas e bócios multinodulares de crianças e adolescentes, foi detectado mRNA de galectina-3 (83). Assim sendo, uma vez que expressão de galectina-3 não é exclusiva de tumores malignos, a utilização da expressão de galectina-3 em material proveniente PAAF, como ferramenta para diagnóstico pré-cirúrgico, deve ser interpretada com cautela, principalmente na distinção entre adenoma e carcinoma folicular.

Tumores de Tiróide Familiar Não Medular

Ao contrário do carcinoma medular familiar, neoplasias foliculares com caráter familiar não são freqüentes, correspondendo a 5% dos casos de carcinoma papilífero. As neoplasias foliculares não medulares familiares são geralmente multifocais, mais agressivas, com maior freqüência de recorrência, com início em idade mais precoce do que os casos esporádicos. As síndromes familiares não medulares são menos conhecidas, porém tem se procurado um elo que possa agrupar os carcinomas papilíferos de membros de mesma família. São chamados "carcinoma papilífero familiar", mas, até o momento, não se conhece nenhuma alteração genética específica. Há poucas síndromes genéticas associadas ao carcinoma de tiróide "não medular". A associação de neoplasias foliculares de tiróide com síndromes genéticas não são freqüentes. Dentre estas, podemos citar a síndrome de Cowden, polipose adenomatosa familiar, e TCO (do inglês, thyroid tumors with cell oxyphilia) associadas a mutações germinativas de genes PTEN, APC e TCO, respectivamente (84,85).

Perspectivas

Inúmeras estratégias estão sendo desenvolvidas para aperfeiçoar os métodos diagnósticos, assim como para buscar terapias mais eficientes no combate ao câncer de tiróide. Desta forma, é de extrema importância buscarmos novos genes associados à tumorigênese da glândula tireóide, assim como o melhor entendimento das alterações moleculares, para que métodos mais precisos de diagnóstico auxiliem no estabelecimento de conduta terapêutica diferenciada para os tipos distintos de neoplasias da tiróide.

Estudos da perda de heterozigosidade identificaram regiões cromossômicas, tais como 2p, 2q, 3p, 7q, 10q, 11q e 17p, que são mais vulneráveis à perda de material genético em carcinomas de tiróide (86). Estas regiões cromossômicas merecem uma cuidadosa investigação, por representar potenciais localizações de genes candidatos em neoplasia tiroidiana.

As informações genéticas em larga escala, provenientes da conclusão de seqüenciamento do genoma humano e número crescente de seqüências expressas ESTs (do inglês, Expressed Sequence Tags) nos bancos de dados genômicos, favorecem inúmeros métodos de investigação inovadores (87,88). Algumas destas metodologias baseadas em genômica, tais como microarrays, estudo citogenético em larga escala e SAGE (do inglês, Serial Analysis of Gene Expression), poderão revelar o perfil molecular da doença, do paciente e até mesmo da eficácia terapêutica (89). Um outro aspecto importante envolve a busca de alternativas de tratamento, principalmente para os casos de carcinomas pouco diferenciados ou indiferenciados, não responsivos à terapêutica convencional, os quais incluem cirurgia, radioiodoterapia e terapia supressora de TSH com T4. Para esta finalidade, novas estratégias terapêuticas estão sendo investigadas, tanto em modelos in vitro quanto in vivo (90,91). Embora a patogenia dos tumores envolva mecanismo multifatorial, é possível bloquear um único gene e obter resultados surpreendentes. Assim sendo, o uso de drogas ou anticorpos que atuam bloqueando os componentes da sinalização ativada constitutivamente no câncer, silenciamento de oncogenes através de métodos de antisense de mRNA ou através de uma técnica descrita mais recentemente, a interferência de RNA, imunoterapia, entre outros, poderão trazer benefícios futuros (55,68,92). A terapia gênica torna possível a reintrodução de um gene defeituoso ou deletado na tumorigênese, como o gene P53, a imunização genética e introdução de agentes angiogênicos, a indução da expressão de "genes suicidas" por promotores de genes específicos da tiróide, como o da TG, em células tumorais e a restauração da expressão de NIS em células tumorais foliculares para torná-las responsivas à radioiodoterapia (23,26,58,90).

Podemos concluir que os conhecimentos acumulados no entendimento dos eventos genéticos e moleculares que envolvem os tumores de tiróide ainda são insuficientes, assim sendo, persiste o desafio para obtermos marcadores que auxiliem no diagnóstico clínico e indiquem terapêuticas melhor direcionadas. O desafio maior tem sido identificar marcadores capazes de distinguir tumores de tiróide malignos de benignos, que sejam especificamente sensíveis para identificar os limites entre adenoma folicular e carcinoma folicular.

Recebido em 17/10/03

Aceito em 30/10/03

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  • Endereço para correspondência

    Edna T. Kimura
    Departamento de Histologia & Embriologia, ICB, USP
    Av Prof Lineu Prestes 1524
    05508-900 São Paulo, SP
    e.mail:
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      28 Maio 2004
    • Data do Fascículo
      Fev 2004

    Histórico

    • Aceito
      30 Out 2003
    • Recebido
      17 Out 2003
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