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Tumores endócrinos associados às mutações das proteínas Gsalfa e Gi2alfa

Endocrine tumors associated to protein Gsalpha/Gi2alpha mutations

Resumos

Diversas mutações em oncogenes promovem o crescimento tumoral através da indução de atividade de proteínas que normalmente transmitem sinais proliferativos a partir de fatores extracelulares. As proteínas G são uma família de proteínas ligadas ao nucleotídeo guanina que apresentam homologia estrutural e estão amplamente distribuídas em células eucariotas. Elas são constituídas por três sub-unidades (alfa, beta e gama). A sub-unidade alfa apresenta o sítio de ligação ao nucleotídeo guanina e é única para cada proteína G. A proteínas G estão acopladas aos receptores de superfície celular com sete hélices transmembrana com uma grande variedade de efetores intracelulares e segundos mensageiros. Um subgrupo de tumores endócrinos, incluindo os tumores hipofisários secretores de GH e ACTH, nódulos tireoideanos autônomos, tumores adrenocorticais e gonadais, foram associados a mutações somáticas ativadoras em códons altamente conservados das proteínas Gs (Arg201 e Gln227) e Gi (Arg179, Gln205). Estes achados moleculares indicaram que as proteínas G atuam como oncogenes, contribuindo no processo da tumorigênese endócrina em humanos.

Proteína G; Sub-unidade alfa; Mutações ativadoras; Tumores endócrinos


Many oncogenic mutations promote tumor growth by inducing autonomous activity of proteins that normally transmit proliferative signal initiated by extracelular factors. G proteins are a family of guanine nucleotide binding proteins, which are structurally homologous and widely distributed in eukaryotic cells. They are composed of three different subunits (alpha, beta e gamma). The alpha subunit, which contains the guanine nucleotide-binding site, is unique to each G protein. The G proteins couple an array of seven transmembrane receptors at the cell surface with a variety of intracellular effectors, which produce second messenger molecules. A subset of endocrine tumors, such as GH- or ACTH-secreting pituitary adenomas, functioning thyroid adenomas, adrenocortical and gonadal tumors were associated with somatic activating mutations in the highly conserved codons of the Gs (Arg201 and Gln227) and Gi (Arg179 and Gln205) proteins. These findings indicated that the G proteins play a role as oncogenes, contributing with the human endocrine tumorigenesis.

G protein; a subunit; Activating mutations; Endocrine tumors


ATUALIZAÇÃO

Tumores endócrinos associados às mutações das proteínas Gsa e Gi2a

Endocrine tumors associated to protein Gsa/Gi2a mutations

Milena Gurgel Teles Bezerra; Ana Claudia Latronico; Maria Candida B.V. Fragoso

Disciplina de Endocrinologia e Metabologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência: Maria Cândida B. Villares Fragoso Laboratório de Hormônios e Genética Molecular LIM/42 Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar 155, PAMB, 2º andar, bloco 6 05403-900 São Paulo, SP E-mail: mariafragoso@uol.com.br

RESUMO

Diversas mutações em oncogenes promovem o crescimento tumoral através da indução de atividade de proteínas que normalmente transmitem sinais proliferativos a partir de fatores extracelulares. As proteínas G são uma família de proteínas ligadas ao nucleotídeo guanina que apresentam homologia estrutural e estão amplamente distribuídas em células eucariotas. Elas são constituídas por três sub-unidades (a, b e g). A sub-unidade a apresenta o sítio de ligação ao nucleotídeo guanina e é única para cada proteína G. A proteínas G estão acopladas aos receptores de superfície celular com sete hélices transmembrana com uma grande variedade de efetores intracelulares e segundos mensageiros. Um subgrupo de tumores endócrinos, incluindo os tumores hipofisários secretores de GH e ACTH, nódulos tireoideanos autônomos, tumores adrenocorticais e gonadais, foram associados a mutações somáticas ativadoras em códons altamente conservados das proteínas Gs (Arg201 e Gln227) e Gi (Arg179, Gln205). Estes achados moleculares indicaram que as proteínas G atuam como oncogenes, contribuindo no processo da tumorigênese endócrina em humanos.

Descritores: Proteína G; Sub-unidade a; Mutações ativadoras; Tumores endócrinos

ABSTRACT

Many oncogenic mutations promote tumor growth by inducing autonomous activity of proteins that normally transmit proliferative signal initiated by extracelular factors. G proteins are a family of guanine nucleotide binding proteins, which are structurally homologous and widely distributed in eukaryotic cells. They are composed of three different subunits (a, b e g). The a subunit, which contains the guanine nucleotide-binding site, is unique to each G protein. The G proteins couple an array of seven transmembrane receptors at the cell surface with a variety of intracellular effectors, which produce second messenger molecules. A subset of endocrine tumors, such as GH- or ACTH-secreting pituitary adenomas, functioning thyroid adenomas, adrenocortical and gonadal tumors were associated with somatic activating mutations in the highly conserved codons of the Gs (Arg201 and Gln227) and Gi (Arg179 and Gln205) proteins. These findings indicated that the G proteins play a role as oncogenes, contributing with the human endocrine tumorigenesis.

Keywords: G protein; a subunit; Activating mutations; Endocrine tumors

RODBELL E COLS. (1), em 1971, apresentaram a primeira evidência da importância do nucleotídeo guanina na geração de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) a partir do estímulo hormonal. Aproximadamente uma década após esta descoberta, a proteína heterotrimérica Gsa que se acopla aos receptores de membrana estimulando o sistema efetor enzimático adenililciclase que culmina na produção de AMPc, foi purificada em membranas de tecido hepático (2).

Os receptores que transmitem o sinal celular via proteína G possuem características comuns em relação a sua estrutura. Apresentam uma região amino-terminal extracelular, uma região transmembrana com sete a-hélices hidrofóbicas ligadas por três alças extracitoplasmáticas e três alças intracitoplasmáticas, sendo denominados receptores de sete domínios transmembrana (7TM). Esses receptores, juntamente com as proteínas G, participam de um sofisticado processo de transdução do sinal celular (3-6). Os ligantes extracelulares, tais como fóton de luz, odorantes, hormônios, neurotransmissores, íons, proteases, causam uma alteração na conformação do receptor, expondo sítios das a-hélices e ativando as proteínas G. As proteínas G ativadas estimulam diferentes sistemas efetores intracelulares (7).

Nos últimos anos, anormalidades da transdução do sinal celular envolvendo mutações ativadoras no gene GNAS1, que codifica a proteína Gsa, têm sido descritas em várias condições patológicas, como na síndrome de McCune Albright, condição esporádica de origem embrionária caracterizada pela clássica tríade de pseudopuberdade precoce, manchas café-au-lait, fibrodisplasia óssea poliostótica e endocrinopatias (8-13). Tumores endócrinos isolados também foram relacionados a mutações dos genes GNAS1 (14,15).

CLASSIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS G E O CICLO GTPASE

As proteínas G podem ser divididas em dois grupos com base no seu peso molecular: um grupo de baixo peso molecular de 20 a 50kDa, presente em todas as células eucariotas, representado principalmente pela família do proto-oncogene ras, e um grupo de alto peso molecular (80 a 90kDa) relacionado à transdução do sinal celular (16,17). Todas as proteínas de alto peso molecular são heterotriméricas, sendo constituídas de três polipeptídeos distintos, as sub-unidades: a, b e d, em ordem decrescente de peso molecular. As sub-unidades a ligam-se ao nucleotídeo guanina com alta afinidade e especificidade, interagem com os receptores 7TM, com os efetores e com o complexo bd. Todas as sub-unidades a possuem atividade intrínseca guanidina trifosfatase (GTPase) (18-20). As sub-unidades b e g são menos conservadas entre as espécies e estão fortemente associadas por uma ligação não covalente formando o dímero bg (14,19).

De acordo com o grau de homologia de aminoácidos, a sub-unidade Ga é dividida em 4 subfamílias: Gs, Gq, Gi e Gi2. Os membros das subfamílias Gs e Gq em geral estão relacionados a eventos estimulatórios hormonais, enquanto os membros da família Gi inibem tais processos (21). Este sistema pode ser ativado por inúmeros ligantes, entre eles íons, fótons e hormônios. A ligação dessas substâncias ao receptor 7TM acarreta uma alteração estrutural levando a uma mudança da conformação da sub-unidade a, diminuindo a sua afinidade pelo difosfato de guanosina (GDP). A concentração citosólica de trifosfato de guanosina (GTP) é maior do que a concentração do GDP, ocorrendo sua substituição após a dissociação do GDP da sub-unidade a. Uma vez que o GTP está acoplado à sub-unidade Ga, esta assume a sua conformação ativa, dissociando-se do receptor e do complexo bg, ligando-se posteriormente ao seu respectivo efetor, que irá desencadear a cascata de eventos intracelulares para ativar ou inativar mensageiros secundários, tais como o AMPc, diacilglicerol e cálcio. Em condições fisiológicas, a ativação dos efetores é transitória, sendo finalizada pela atividade GTPase intrínseca da sub-unidade a. Esta converte o GTP em GDP por hidrólise do g-fosfato do GTP, mantendo a sub-unidade a com alta afinidade ao dímero bd, retornando ao seu estado inativo heterotrimérico (21, 22).

ESTRUTURA E LOCALIZAÇÃO DO GENE GNAS1

O gene GNAS1 humano de 20Kb foi clonado em 1988 por Kosaza e cols. (23) e localiza-se no braço longo do cromossomo 20 na região 13.1–13.2. Inicialmente a seqüência de nucleotídeos foi descrita como contendo 13 exons e 4 splicing alternativos localizados nos exons 3 e 4 (23). Atualmente sabe-se que o gene GNAS1 e seu homólogo em ratos (Gnas) apresentam alta complexidade com múltiplos splicing alternativos formando transcritos que codificam várias proteínas e transcritos não traduzidos. Utilizando promotores alternativos, os principais produtos transcritos pelo gene GNAS1 são: a conhecida proteína Gsa, a proteína neuroendócrina secretória 55 (NESP55), uma proteína semelhante à cromogranina com expressão em tecidos neuroendócrinos (medula adrenal, hipófise, hipotálamo, e outras regiões do cérebro); e as proteínas XLas (XLN1a e XLN1b), isoformas longas da proteína Gsa, que apresentam também expressão em tecidos neuroendócrinos (hipófise, adrenal, coração, pâncreas) com funções biológicas ainda não determinadas (24-26). Em humanos e ratos, a região promotora do NESP55 sofre metilação do alelo paterno, sendo o alelo materno transcrito. Contrariamente, a região promotora da XLas está metilada no alelo materno com geração de transcritos a partir somente do alelo paterno. Estudos do padrão de metilação em ratos e fetos humanos, da região promotora do gene da proteína Gsa, mostraram expressão bialélica em alguns tecidos (ossos), e monoalélica em outros (túbulo proximal do nefron) com imprinting paterno e expressão do alelo materno (27).

PROTEÍNAS G COMO ONCOGENES

Um oncogene pode ser definido como um gene que sofre transformações suficientes para conferir um fenótipo alterado por si mesmo ou em colaboração com outros oncogenes. Geralmente são formas dominantes de um proto-oncogene (28,29). Muitos proto-oncogenes codificam proteínas envolvidas nas vias de transdução de sinal, ativadas por hormônios e fatores de crescimento que estimulam a proliferação celular (30). As proteínas G claramente se encaixam na definição de proto-oncogene, pois mutações do tipo ganho e perda de função podem alterar as vias de transdução de sinal que controlam o crescimento celular (31).

Mutações na proteína G que levam a ativação constitutiva do sinal intracelular foram relatadas envolvendo as sub-unidades a das proteínas Gs e Gi2.

Mutações ativadoras no gene da sub-unidade a, GNAS, transformam esse gene em um oncogene denominado gsp. Essas mutações descritas nos exons 8 e 9 do gene são somáticas, pontuais, do tipo missense em heterozigose e alteram códons altamente conservados e críticos para a atividade intrínseca GTPase (Arg201 e Gln227). Esse oncogene codifica uma proteína Gsa mutada com menor atividade GTPase, diminuindo a hidrólise do g-fosfato do GTP, mantendo constitutivamente o sinal celular com aumento significativo de AMPc (32,33). O papel do AMPc na regulação da proliferação celular parece ser tecido específico. Em alguns tecidos como hipófise e tireóide, o AMPc promove proliferação, diferenciação e secreção hormonal (34). O aumento de AMPc ativa a proteína quinase A (PKA) que fosforila o CREB (proteína ligadora responsiva a AMPc); uma vez fosforilada, esta última atua no núcleo modulando a transcrição de um número relevante de genes envolvidos na mitogênese como c-fos, c-jun e jun B (35,36). Logo, a expressão do oncogene gsp nesses tecidos resulta em hiperplasia, hipertrofia e adenomas hiperfuncionantes (32). Em contrapartida, em outros tipos celulares o aumento de AMPc pode, via PKA, inibir a cascata MAPK (mitogen-activated protein kinase) que é desencadeada por fatores de crescimento (35).

Em 1992, o gene GNAI2 foi clonado e localizado no braço curto do cromossomo 3, região 2.1. Esse codifica a proteína Gai2, que está envolvida em rearranjos celulares e malignidade (37). Mutações ativadoras no gene GNAI2 também transformam o gene da sub-unidade ai2 em um oncogene denominado gip2. O potencial oncogênico da ativação constitutiva da proteína Gi2a ainda não é totalmente compreendido, principalmente porque o produto do gip2 causa inibição da adenililciclase e redução do cálcio citosólico em células transfectadas (38). No entanto, o achado de que os receptores acoplados a Gi2a ativam constitutivamente a via mAk-erk (mitogen-activated extracellular-signal regulated kinase; extracellular-signal regulated kinase) em células Rat1a indica que este pode ser o principal mecanismo pelo qual o oncogene gip2 regula o crescimento celular (39). A inibição da via adenililciclase-AMPc-PKA realizada pelo gip2 pode levar ao estímulo do sistema de proliferação celular, MERK-ERK (32). Portanto, em alguns sistemas celulares, uma ativação constitutiva de Gi2a pode causar transformação celular (33,39).

MUTAÇÕES ATIVADORAS DAS PROTEÍNAS G EM TUMORES ENDÓCRINOS

Hipófise

O primeiro passo para a identificação de mutações ativadoras Gsa em tumores endócrinos foi a observação de que tumores secretores de GH possuíam níveis elevados de GH basal e aumento da atividade da adenililciclase, não sendo estimulados por GHRH, que atua via receptor acoplado à proteína Gsa e estímulo da adenililciclase (40). Aproximadamente 40% dos tumores secretores de GH apresentam mutações do tipo missense nos exons 8 e 9 do gene GNAS1 em heterozigose que resultam nas substituições dos resíduos de aminoácidos Arg201 (por Cys, ou His) e Gln227 (por Arg ou Lys) da sub-unidade Gsa, respectivamente (41,42).

Bruce e cols. (43) demonstraram que em 21 de 22 adenomas hipofisários produtores de GH, a mutação gsp estava presente no NESP55 e não no transcrito XLas, sugerindo que estas mutações ocorrem preferencialmente no alelo materno (43). Posteriormente, um tumor somatotrófico contendo a mutação Arg201Ser foi descrito (44). A prevalência destas mutações em pacientes acromegálicos coreanos foi bem menor (< 5%) do que na população caucasiana (45). A alteração nesses resíduos, como foi previamente mencionado, diminuiu dramaticamente a atividade intrínseca GTPase da sub-unidade Gsa; a ativação constitutiva da proteína G aumenta a concentração de AMPc nos somatotrófos (27), estimulando a diferenciação e proliferação celulares através de um fator de transcrição tecido-específico, GHF1 (46).

Não há prevalência quanto ao sexo ou idade na apresentação dos tumores com ou sem a mutação gsp. No entanto, existem algumas diferenças clínicas entre os tumores secretores de GH com gsp+ e com gsp- (35). Os tumores gsp+ são menores, porém mesmo os adenomas muito pequenos possuem sintomas clínicos exuberantes. Dados de microscopia eletrônica confirmam a presença de células densamente granuladas, com aparelho secretório bem desenvolvido (35). Além disso, tumores gsp+ parecem ser mais sensíveis à ação inibitória dos análogos da somatostatina (47), indicando que as vias Gi2a, que inibem adenililciclase, estão intactas nesses tumores, sendo os análogos da somatostatina agentes terapêuticos úteis nos pacientes com tumores gsp+ (27). A ativação da Gsa causa ainda o aumento de um subtipo específico de fosfodiesterase (tipo 4), enzima que hidrolisa o AMPc em excesso, na tentativa de reduzir seu acúmulo. Parece haver um maior bloqueio na atividade dessa enzima em tumores gsp+, o que pode influenciar na apresentação fenotípica desses tumores (48).

Mutações gsp estão presentes em outros tipos de tumores hipofisários. À semelhança do GHRH nos somatotrófos, o CRH estimula a liberação de ACTH pelos corticotrófos via ativação de proteína Gsa (27). Até o presente momento, poucos estudos relacionaram a mutação gsp com o adenoma corticotrófico. Williamson e cols. (49), demonstraram a presença de uma mutação gsp no códon 227 em 2 de 32 adenomas secretores de ACTH. Um outro adenoma apresentava uma mutação gip2 no códon 179 (49). Mais recentemente, a troca Arg201His foi encontrada em um adenoma basofílico causador de doença de Cushing em um menino de 11 anos (50).

Adenomas não-funcionantes apresentam uma prevalência da mutação gsp de aproximadamente 10% (42,51,52). Duas alterações da proteína Gsa, a primeira no códon 201 resultando na conversão de Arg para Cys e a outra no códon 227 caracterizada pela troca de glutamina pela arginina, foram identificadas em 2 de 22 adenomas de hipófise não-funcionantes (52). Nesse mesmo estudo, 3 tumores também apresentavam a troca da glutamina por arginina no códon 205 do gene GNAIS2 (mutações gip2). Dois desse três tumores também apresentavam mutações gsp. Todos os tumores com mutações nos genes das proteínas G apresentaram invasão óssea local e de tecidos adjacentes. A presença dos dois tipos de mutações em dois tumores sugere a possibilidade de múltiplos eventos na patogênese de neoplasias de hipófise (52). A ausência de mutações gsp em tireotrófos e lactotrófos pode ser explicada pela transdução do sinal celular por vias diferentes ao da proteína Gsa (42,53).

Tireóide e paratireóide

O sistema adenilciclase-AMPc é o principal regulador da função e do crescimento da célula folicular tireoideana. A adenilciclase está sob o efeito estimulatório da proteína Gsa e inibitório da proteína Gi2a (54). O TSH exerce seus efeitos por meio de um receptor do tipo 7TM acoplado à proteína G (54). Em células tireoideanas, o AMPc estimula fatores de transcrição dependentes de AMPc e o p38/MAPK em uma via dependente de PKA resultando em efeitos na função e proliferação da célula folicular (55).

A presença de mutações em adenomas tireoideanos funcionantes foi confirmada em vários estudos (42,56). Mutações no receptor de TSH que ativam a mesma via acoplada à proteína Gsa são as mais comumente encontradas em nódulos autônomos, e a sua prevalência pode chegar a 80% segundo algumas casuísticas (57,58). Mutações ativadoras da proteína Gsa foram descritas em até 25% em nódulos tireoideanos autônomos (54). Há, no entanto, uma grande variabilidade nas prevalências reportadas em neoplasia de tireóide (42,56,59-61). Um estudo feito por Esapa e cols. (54) identificou duas mutações em 100 tumores examinados. O primeiro era um adenoma de células de Hürthle com mutação gsp Arg201Cys. O outro se tratava de um adenoma folicular com uma alteração no oncogene gip2, códon 179, resultando também na troca de uma arginina por uma cisteína. Uma revisão feita no mesmo estudo mostrou uma prevalência de 2 a 13% de mutações gsp em tumores papilíferos e foliculares da tireóide, mostrando assim que em comparação aos nódulos funcionantes, a prevalência de mutações na proteína G em neoplasias de tireóide é menor (54).

A presença de mutações gsp em paratireóide foi descrita por Williamson e cols. (62). Dois pacientes com hiperparatireoidsimo primário apresentaram a mutação Arg201Cys na análise molecular dos adenomas de paratireóide (62).

Supra-renais e gônadas

O receptor do ACTH é acoplado à proteína Gsa, tendo a adenililciclase como seu principal efetor. Portanto, mutações nessa via podem levar à proliferação celular secundária. Em um estudo realizado por Yoshimoto e cols. (62), apenas 1 de 19 tumores adrenocorticais examinados apresentava mutação na proteína Gsa. A paciente era portadora de um tumor em adrenal à direita de aproximadamente 2,0cm e apresentava sintomas clássicos de hiperaldosteronismo primário. Um outro estudo detectou a mutação Arg201Cys em 2 pacientes portadores de feocromocitoma (62). Entretanto, estudos posteriores sugeriram que mutações no gene gsp em tumores adrenocorticais são raramente encontradas (42,63). Mutações no oncogene gip2 envolvendo o resíduo Arg179 foram encontradas em 3 de 11 tumores adrenocorticais e 3 de 10 tumores ovarianos (2 tumores de granulosa e 1 tecoma). Mutações no gene gsp não foram encontradas nesses tumores (42). Fragoso e cols. (64) descreveram mutações no gene Gsa em 4 de 14 tumores do estroma do cordão sexual e não detectaram nenhuma mutação no gene gip2.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nos últimos anos, foi demonstrado que mutações constitutivas nas proteínas G resultam na ativação das vias de sinalização intracelular. Tais mutações são responsáveis por doenças humanas, apresentando-se com hipersecreção e neoplasia diferenciada. O estímulo à proliferação celular é o principal mecanismo envolvido na gênese dessas patologias. Mutações ativadoras no gene GNAS1 estão bem caracterizadas em alguns tumores da hipófise (somatotróficos, adenomas não-funcionantes) e de tireóide (nódulos funcionantes e neoplasias diferenciadas) e na síndrome de McCune Albright. Mutações no gene GNAI2 são extremamente raras e identificadas em alguns tipos celulares, tais como: tumores ovarianos, supra-renais e adenomas não-funcionantes de hipófise. Portanto, maiores estudos são necessários para se avaliar a importância da participação da sub-unidade Gi2a no processo da tumorigênese.

A mutação gsp representa a base da patogênese molecular da síndrome de McCune Albright. Tais mutações podem se apresentar de forma isolada em tecidos que são também acometidos na síndrome de McCune Albright, o que nos faz questionar se estas doenças não fazem parte de uma mesma entidade nosológica, com espectro de apresentação fenotípica variável. Estudos das vias de sinalização intracelular permitirão maior compreensão da participação das mutações gsp e gip2 nas neoplasias benignas, malignas, funcionantes e não-funcionantes dos diferentes tumores endócrinos.

Recebido em 15/07/05

Revisado em 17/07/05

Aceito em 22/07/05

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  • Endereço para correspondência:

    Maria Cândida B. Villares Fragoso
    Laboratório de Hormônios e Genética Molecular LIM/42
    Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar 155, PAMB, 2º andar, bloco 6
    05403-900 São Paulo, SP
    E-mail:
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      23 Jan 2006
    • Data do Fascículo
      Out 2005

    Histórico

    • Recebido
      22 Jul 2005
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