Transferência de lípides para a lipoproteína de alta densidade (HDl) em mulheres com diabetes melito tipo 1

Lipid transfer to HDl in women with type 1 diabetes

Resumos

INTRODUÇÃO: Os portadores de diabetes melito tipo 1 (DM1) possuem aumentado risco de doença cardiovascular e, ainda assim, podem apresentar perfil lipídico normal. Para esclarecer se os níveis normais de HDL podem ocultar defeitos na função, foram estudados a transferência de lípides para a HDL em DM1. MÉTODOS: Vinte e uma mulheres jovens portadoras de DM1 foram comparadas com 21 mulheres não-diabéticas. Nanoemulsões foram usadas como doadoras de lípides para HDL: uma marcada com ³H-triglicérides e 14C-colesterol livre e outra com ³H-éster de colesterol e 14C-fosfolípides. Após 1 hora de incubação com amostras de plasma, seguida por precipitação química, o sobrenadante, contendo HDL, teve a radioatividade contada. RESULTADOS: Nenhuma diferença foi encontrada nas transferências dos ésteres de colesterol, triglicérides, colesterol livre e fosfolípides para as HDL. CONCLUSÃO: A transferência de lípides para a HDL não está afetada em portadoras de DM1. Isso sugere que a doença não altera a composição de lipoproteínas e a ação de proteínas de transferência.

Diabetes melito tipo 1; nanopartículas; colesterol HDL; lipoproteínas; controle glicêmico

INTRODUCTION: People with type 1 diabetes mellitus (T1DM) have an increased risk of cardiovascular disease and may still have a normal lipid profile. In order to clarify whether normal HDL cholesterol levels may conceal defects in HDL function, we have studied the transfer of lipids to HDL in T1DM. METHODS: Twenty-one young women with T1DM were compared with 21 non-diabetic women. Nanoemulsion preparations were used as lipid donor to HDL: one labeled with ³H-triglycerides and 14C-free cholesterol and the other with ³H-cholesteryl esters and 14C-phospholipids. These preparations were incubated with plasma samples for 1h. After chemical precipitation, the supernatant containing HDL was counted for radioactivity. RESULTS: No difference in transfer was observed to nanoemulsion HDL from cholesteryl esters, triglycerides, free cholesterol and phospholipids. CONCLUSION: Simultaneous lipid transfer to HDL was not affected in T1DM patients. This suggests that the disease does not alter lipoprotein composition and transfer protein action in such way as to disturb HDL metabolism.

Type 1 diabetes mellitus; nanoparticles; HDL cholesterol; lipoproteins; glycemic control

ARTIGO ORIGINAL

Transferência de lípides para a lipoproteína de alta densidade (HDl) em mulheres com diabetes melito tipo 1

Lipid transfer to HDl in women with type 1 diabetes

Alina Coutinho Rodrigues Feitosa^I; Raul Cavalcante Maranhão^I; Gilson Soares Feitosa Filho^I; Bernardo Léo Wajchenberg^II

^ILaboratório de Metabolismo de Lípides do instituto do Coração (inCor), Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (HC-FMUSP)

^IIInCor, HC-FMUSP; São Paulo, SP, Brasil

^{Correspondência para}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Os portadores de diabetes melito tipo 1 (DM1) possuem aumentado risco de doença cardiovascular e, ainda assim, podem apresentar perfil lipídico normal. Para esclarecer se os níveis normais de HDL podem ocultar defeitos na função, foram estudados a transferência de lípides para a HDL em DM1.

MÉTODOS: Vinte e uma mulheres jovens portadoras de DM1 foram comparadas com 21 mulheres não-diabéticas. Nanoemulsões foram usadas como doadoras de lípides para HDL: uma marcada com ³H-triglicérides e ¹⁴C-colesterol livre e outra com ³H-éster de colesterol e ¹⁴C-fosfolípides. Após 1 hora de incubação com amostras de plasma, seguida por precipitação química, o sobrenadante, contendo HDL, teve a radioatividade contada.

RESULTADOS: Nenhuma diferença foi encontrada nas transferências dos ésteres de colesterol, triglicérides, colesterol livre e fosfolípides para as HDL.

CONCLUSÃO: A transferência de lípides para a HDL não está afetada em portadoras de DM1. Isso sugere que a doença não altera a composição de lipoproteínas e a ação de proteínas de transferência.

Descritores: Diabetes melito tipo 1; nanopartículas; colesterol HDL; lipoproteínas/metabolismo; controle glicêmico

ABSTRACT

INTRODUCTION: People with type 1 diabetes mellitus (T1DM) have an increased risk of cardiovascular disease and may still have a normal lipid profile. In order to clarify whether normal HDL cholesterol levels may conceal defects in HDL function, we have studied the transfer of lipids to HDL in T1DM.

METHODS: Twenty-one young women with T1DM were compared with 21 non-diabetic women. Nanoemulsion preparations were used as lipid donor to HDL: one labeled with ³H-triglycerides and ¹⁴C-free cholesterol and the other with ³H-cholesteryl esters and ¹⁴C-phospholipids. These preparations were incubated with plasma samples for 1h. After chemical precipitation, the supernatant containing HDL was counted for radioactivity.

RESULTS: No difference in transfer was observed to nanoemulsion HDL from cholesteryl esters, triglycerides, free cholesterol and phospholipids.

CONCLUSION: Simultaneous lipid transfer to HDL was not affected in T1DM patients. This suggests that the disease does not alter lipoprotein composition and transfer protein action in such way as to disturb HDL metabolism.

Keywords: Type 1 diabetes mellitus; nanoparticles; HDL cholesterol; lipoproteins, lipid metabolism; glycemic control

INTRODUÇÃO

diabetes melito (DM) associa-se frequentemente a alterações nas lipoproteínas plasmáticas. A dislipidemia típica é caracterizada por hipertrigliceridemia, HDL baixo e LDL pequena e densa, entretanto, portadores de diabetes melito tipo 1 (DM1) apresentam-na em menor frequên cia que os portadores de diabetes melito tipo 2 (DM2). A maioria dos DM1 tratada intensivamente com insulina cursa com perfil lipídico normal (1), podendo ser encontradas concentrações reduzidas de LDL e elevadas de HDL (2-4). Ainda assim, as doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte entre DM1. A concentração de HDL é inversamente associada ao desenvolvimento da aterosclerose (5), entretanto, em mulheres diabéticas, as DCV são a principal causa de morte (6), a despeito de apresentarem concentrações de HDL mais elevadas do que os homens (7). O impacto do diabetes no risco de morte por DCV na mulher é maior que o do homem (8).

Além da existência da relação inversa entre HDL e DCV, alterações no tamanho, na composição e na estrutura das HDL podem comprometer a funcionalidade e interferir com suas propriedades antiaterogênicas (9). A HDL está constantemente sendo remodelada e as transferências de lípides são essenciais para o transporte reverso e a esterificação do colesterol (10), importantes passos metabólicos na prevenção da aterosclerose. As transferências de lípides entre as classes de lipoproteínas são bidirecionais, mas, frequentemente, resultam depleção ou enriquecimento de dada classe de lípides. As transferências dependem das concentrações e da estrutura da lipoproteína doadora e aceptora (11), assim como da ação de proteínas de transferência (12) nomeadas proteína de transferência de ésteres de colesterol (CETP) (13) e proteína de transferência de fosfolípides (PLTP) (14). A insulina desempenha importante papel na regulação do metabolismo das HDL (15,16), atuando em proteínas de transferência (17) e regulando a produção das HDL (15). Considerando que a fisiopatologia do DM1 é caracterizada por insulinodeficiência e que o tratamento é feito exclusivamente com insulina, alterações no metabolismo das HDL são necessariamente influenciadas pelo requerimento obrigatório deste hormônio.

Informações a respeito de transferência de lípides para as HDLs em DM1 são escassas na literatura. Em pacientes DM1 normolipidêmicos que recebem insulinoterapia subcutânea convencional, a transferência de éster de colesterol (CE) da LDL para a HDL foi semelhante a dos controles não-diabéticos, enquanto a transferência de triglicérides (TG) foi maior apenas na subfração HDL₃ (18). Nesse estudo de Ritter e Bagdade, a técnica utilizada foi a de transferência de massa que avalia a composição lipídica da partícula HDL ao fim dos ensaios e estima a transferência a partir da depleção ou do enriquecimento das partículas. Ritter e Bagdade estudaram apenas dois lípides - TG e CE - e foi utilizado um inibidor da atividade da lecitina colesterol aciltransferase no plasma dos indivíduos, o que modifica parte da transferência, porquanto impede a esterificação do colesterol livre (CL).

A proteção antiaterogênica conferida pela HDL é mais importante no sexo feminino do que no sexo masculino, efeitos mediados por ações dos estrógenos (19,20). Além disso, a mulher está mais exposta a DCV relacionada ao diabetes do que o homem (21). Dessa forma, é importante estudar, nessas pacientes, os vários aspectos do metabolismo da HDL, já que está demonstrado que a determinação da concentração plasmática da lipoproteína é insuficiente para avaliar o seu papel protetor. Assim, o presente estudo objetivou avaliar a atividade aceptora de lípides da HDL em pacientes DM1. Esse é um importante aspecto do metabolismo da lipoproteína, já que várias funções da HDL estão relacionadas com a transferência de lípides (10,22). Na abordagem que foi utilizada, com fundamento em uma nanoemulsão artificial que funciona como doadora de lípides, pode quantificar-se, a um só tempo, a transferência de quatro lípides - CL, CE, TG e fosfolípides (FL). Além disso, foi avaliada a associação das transferências com o controle glicêmico e a insulinoterapia em esquema intensivo.

MÉTODOS

PARTICIPANTES DO ESTUDO

Vinte e uma mulheres portadoras de DM1 e 21 controles não-diabéticas não parentes dos casos pareadas para idade, sexo e índice de massa corpórea (IMC) foram estudadas. Foram considerados critérios de exclusão: dislipidemia (LDL > 130, HDL < 40 ou TG > 150 mg/dL) ou uso de hipolipemiantes, câncer, doenças inflamatórias, uso de imunossupressores ou glicocorticóides, hipotireoidismo não controlado e complicações macro e microvasculares significativas. Essas foram definidas como: retinopatia proliferativa ou não-proliferativa moderada a grave, microalbuminúria acima de 50 mg em 24 horas e neuropatia periférica caracterizada por alteração nos testes de rastreamento (teste do monofilamento de 10 g e teste da percepção da vibração alterado com diapasão 128 Hz) ou eletroneuromiografia compatível, associados à história de lesão não percebida, ulceração ou amputação.

EXAME CLÍNICO

A revisão dos prontuários e a entrevista foram feitas para checar complicações, comorbidades e medicações de cada participante do estudo. Foram mensurados altura, peso, circunferência abdominal, relação cintura-quadril de todas as participantes. O IMC foi calculado dividindo-se o peso pela altura ao quadrado.

ANÁLISES DA BIOQUÍMICA SANGUÍNEA

Foram coletadas amostras de sangue após 12 horas de jejum para a determinação de lípides plasmáticos, apolipoproteínas, glicemia em jejum, hemoglobina glicada e para realização dos ensaios de transferências de lípides. Triglicérides, colesterol total (CT), HDL, VLDL e glicemia foram mensurados por meio do método enzimático colorimétrico automatizado e o colesterol de LDL pelo método cinético automatizado. As concentrações plasmáticas de apoA1 e B foram determinadas pela turbidimetria (Roche/Hitachi - Roche Diagnostics - Mannheim), a hemoglobina glicada, pelo método HLPC, certificado pelo National Glyco Hemoglobin Standardization Program (NGSP, Estados Unidos), considerando a porcentagem entre 4,1% e 6,0% como valor normal.

MENSURAÇÃO DO TAMANHO DA HDL

O tamanho da partícula HDL foi medido pelo método do espalhamento de luz, segundo a técnica descrita por Lima e Maranhão (23).

PREPARO DA NANOEMULSÃO LIPÍDICA PARA O ENSAIO DA CAPACIDADE ACEPTORA DAS HDL

A nanoemulsão foi feita de acordo com o procedimento descrito por Ginsburg e Small (24) e modificado por Maranhão e cols. (25). A nanoemulsão foi preparada a partir damistura lipídica composta de 40mg de oleato de colesterol, 20 mg de fosfatildilcolina, 1 mg de trioleína e 0,5 de colesterol adquirida da Sigma (Estados Unidos). Os lípides radioativos foram adquiridos da Amersham International (Amersham, UK) e foram adicionados às misturas lipídicas. Dois tipos de nanoemulsões foram preparadas, uma marcada com ¹⁴C-oleato de colesterol e ³H-colesterol e outra com ¹⁴C-fosfatidilcolina e ³Htrioleína. A emulsificação dos lípides por irradiação ultrassônica prolongada em meio aquoso e duas etapas de ultracentrifugação da emulsão com ajustes de densidade por meio da adição de KBr resultaram a nanoemulsão.

Para o ensaio da capacidade da HDL em receber os lípides radioativos da nanoemulsão, foram coletadas amostras dos pacientes, após jejum de 12 horas, em tubos contendo 0,15% de Na₂EDTA e o plasma foi obtido após 15 minutos de centrifugação, a 2.500 rpm a 4ºC. Tubos teste contendo amostras de plasma (0,2 mL) e 0,05 m de nanoemulsão marcada com ¹⁴C-oleato de colesterol e ³H-colesterol ou com ¹⁴C-fosfatidilcolina e ³H-trioleína foram colocados em banho agitador e incubados por 60 minutos a 37ºC. Depois, 0,25 mL de solução contendo 0,02% de sulfato de dextran (50.000 MW) e 0,3 mol/L de MgCl₂ foi adicionada aos tubos e agitada em vórtex por 30 segundos. As amostras foram posteriormente centrifugadas por 10 minutos a 3.000 rpm e 0,25 mL do sobrenadante conten do a fração plasmática da HDL, obtidas e transferidas para frascos com solução cintiladora. A radioatividade presente nas amostras foi determinada em contador Beta (Liquid Scintillation Analyzer, Packard 1600 TR, Palo Alto, CA). A quantificação dos lípides transferidos da nanoemulsão para HDL plasmática foi calculada a partir do percentual de lípides marcados, doados da nanoemulsão e encontrados na fração da HDL plasmática.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) e o termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os participantes.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todas as análises foram feitas com o SPSS v.13. Os resultados foram expressos em média e desvio-padrão para variáveis contínuas e valores absolutos e percentuais para variáveis categóricas. As variáveis contínuas foram comparadas conforme distribuição: se normal pelo teste t de Student e se não-normal pelo teste Mann-Whitney. As associações entre as variáveis contínuas foram avaliadas pelo testes de Pearson ou Spearman (paramétricas e não-paramétricas, respectivamente). Foram consideradas significativas as diferenças com p < 0,05, bicaudal.

RESULTADOS

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E LABORATORIALS

A Tabela 1 mostra dados clínicos e antropométricos, lípides, lipoproteínas plasmáticas, controle glicêmico e dose da insulina subcutânea. As diabéticas apresentavam longa duração da doença (14,4 ± 7,2 anos) e controle glicêmico crônico ruim, com HbA1c de 8,8 ± 1,3%. O perfil lipídico, apolipoproteínas, circunferência abdominal, relação cintura-quadril e idade foram semelhantes. A maioria não fazia atividade física regular (sete [35%] versus oito [38%]), o uso de anticoncepcional foi semelhante entre DM1 e controles (sete [32%] versus seis [29%]). Duas diabéticas apresentavam hipertensão (9,5%), duas (9,5%) microalbuminúria entre 30 e 50 mg em 24 horas, três (14,3%) retinopatia não-proliferativa leve, três (15,8%) tinham alterações à pesquisa da vibração com diapasão de 128 Hz, nenhuma apresentou alterações ao teste do monofilamento de 10 g. A insulinoterapia em esquema intensivo (3 ou mais doses de insulina ao dia com ajustes de doses feitos com base em, pelo menos, três automonitorizações ao dia) era usada em 100% das DM1. A dose total diária de insulina foi de 0,67 ± 0,17 UI/kg.

TAXAS DE TRANSFERÊNCIA DA NANOEMULSÃO PARA AS HDL E TAMANHO DA PARTÍCULA HDL

As taxas de transferência de lípides das nanoemulsões para as HDL e o diâmetro médio da partícula HDL foram semelhantes entre diabéticas e controles (Tabela 2). As associações entre as taxas de transferências e o tamanho, lípides e apolipoproteínas plasmáticos e controle glicêmico estão na Tabela 3.

DISCUSSÃO

As portadoras de diabetes avaliadas no estudo são jovens, normolipidêmicas, com mau controle glicêmico e não apresentam complicações significativas da doença. Em DM1 sem complicações da doença e intensivamente tratados com insulina, a dislipidemia é incomum, acometendo cerca de 9% desta população (1).

O metabolismo de lípides no DM1 é dependente da insulinopenia (26) e variável conforme o grau (27,28) e forma de insulinização (27,29-31).

Na ausência absoluta de insulina, a lipólise está aumentada, provendo o fígado de ácidos graxos livres que, associados à glicose elevada, fornecem o substrato para a formação das VLDL. Essas VLDL acumulam-se por causa da redução da atividade de lipase lipoprotéica (32), resultando a hipertrigliceridemia e a redução de HDL. A utilização de insulina para o tratamento origina espectro variável de alterações no metabolismo lipídico. A administração de insulina por via subcutânea resulta hiperinsulinismo que suprime a lipólise (33), ativa a lipase lipoprotéica (LLP) (32,34) e reduz a glicemia, diminuindo o substrato para a formação de VLDL e aumentando a sua degradação via hidrólise mediada pela LLP. A insulina, ao ativar a PLTP (35) e a LLP, aumenta a HDL (15,35).

A composição da HDL, que envolve lípides doados e recebidos entre lipoproteínas, é influenciada pela insulina (28,30,36). A proteína de transferência CETP propicia a troca de ésteres de colesterol das HDL por TG com as partículas contendo apoB (13) e a PLTP medeia a transferência de FL e colesterol entre HDL e a interconversão das HDL (37). As ações destas proteínas alteram a composição e a estrutura da HDL. A literatura é controversa a respeito da atividade da CETP em DM1. A atividade da CETP pode estar aumentada (38), reduzida (39,40) ou normal (41,42), enquanto a PLTP está aumentada (43).

Em alguns trabalhos foi reportada a transferência no sentido da HDL para lipoproteínas contendo apoB no DM1 (18,28,31). Entretanto, até o momento, apenas um estudo avaliou a transferência no sentido das VLDL e LDL para a HDL, mostrando que não houve diferença na transferência de CE e TG para a fração HDL₂ em comparação com os controles e transferência aumentada de TG apenas para a fração HDL₃ (18). Neste estudo, as HDL foram depletadas em CE.

Na abordagem metodológica adotada no presente estudo, a nanoemulsão lipídica produzida artificialmente e que imita a composição da LDL foi utilizada como partícula doadora de lipídios para a HDL. Essa abordagem tem duas grandes vantagens: uma é a praticidade, já que se evitam os laboriosos procedimentos de marcação radioisotópica e isolamento do plasma das diversas lipoproteínas. Além disso, a nanoemulsão, em contato com o plasma, adquire as diversas apolipoproteínas plasmáticas e fica estruturalmente muito parecida com as lipoproteínas naturais. Usando-a como preparação-padrão única nos ensaios, evitam-se as variáveis inerentes às diferenças composicionais das lipoproteínas doadoras dos lípides, como as VLDL e as LDL, e assim o ensaio testa, especificamente, a capacidade da HDL do diabético de receber os lípides, independentemente das variações das lipoproteínas doadoras, como a glicação aumentada que ocorre no diabetes.

No presente estudo, não houve diferença na transferência de lípides da nanoemulsão para as HDL entre diabéticos e controles. A semelhança das transferências de lípides do estudo pode se dar na presença predominante da subfração HDL₂ nos diabéticos, visto que, no grupo avaliado, a concentração da HDL estava elevada e o aumento da HDL nos DM1 insulinizados ocorre em virtude do aumento da fração HDL₂ (44).

Por meio do ensaio usando a nanoemulsão como doadora de lípides, a transferência é avaliada sob o ponto de vista unidirecional. Na direção oposta, o aumento de transferência de lípides da HDL para as lipoproteínas contendo apoB (36), com a doação de CE das HDL para as VLDL aumenta a proporção TG/CE nas HDL dos diabéticos (28). A depleção de CE no centro das partículas de HDL (18) diminui à concentração de HDL colesterol e apoA1 e pode levar a alteração da estabilidade da HDL (45) e poderia prejudicar a função desta lipoproteína.

A semelhança do diâmetro das partículas HDL entre diabéticas e não-diabéticas encontrada neste estudo não permite afirmar que não haja diferenças de composição e função entre os dois grupos. O tamanho da partícula pode ser similar, porém com função vasodilatadora comprometida (46). Os portadores de DM1 podem ter maior proporção de partículas grandes de HDL e menor de HDL de pequeno tamanho (47) e o aumento da quantidade de HDL de maior diâmetro pode ser explicado, em parte, pela ampliação da atividade da PLTP em diabéticos (43). Entretanto, a metodologia utilizada no presente estudo avalia a média do diâmetro de todas as partículas mensuradas, sem fracionamento de subclasses, e pela dispersão da luz poderia haver diferenças nos tamanhos das subclasses das HDL, que não foram avaliados.

O conjunto de resultados dos participantes deste estudo, no qual não houve diferenças não só do tamanho e dos parâmetros de transferência de lípides para a HDL, mas também na concentração plasmática do HDL colesterol, não obstante as restrições anteriormente formuladas, sugere-se que não haja, em mulheres jovens com esta doença, alterações acentuadas na composição e na ação das lipoproteínas de transferência. Caso contrário, isso seria refletido nos vários parâmetros aferidos neste estudo. Este resultado é diferente do que se encontra em pacientes com DM2 e em pacientes com síndrome metabólica (dados não publicados). Naqueles casos, em que o mecanismo fisiopatológico reside na resistência à insulina, houve alterações caracterizadas por aumento na transferência de lípides.

Apesar de a insulina influenciar as proteínas de transferência de lípides, não foram encontradas associações entre as taxas de transferências de lípides e as doses de insulina. A ausência desta associação pode ser resultado da absorção variável da insulina subcutânea para a circulação portal (48). A glicemia e a hemoglobina glicada não se associaram às transferências, mas as concentrações da apoA1 e HDLc estiveram positivamente associadas à transferência de CL e CE. O aumento das taxas de transferência relacionado à elevação da concentração de HDLc sugere que tal achado resulte, predominantemente, da lei de ação de massas e não de aumento de atividade da CETP.

Uma questão importante é a de elucidar se ocorrem alterações na transferência de lípides para a HDL em pacientes com DM1 que desenvolveram DCV. As pacientes que participaram deste estudo eram jovens, e a questão da presença de DCV remete à faixa etária mais elevada, tanto dos casos quanto dos controles. É possível que em idade mais elevada cenário diferente surja, em que a transferência esteja alterada e haja relação entre este fato e o desenvolvimento de complicações cardiovasculares.

Em conclusão, em portadoras de DM1 jovens, a capacidade da HDL em receber lípides não está alterada em comparação com controles não-diabéticas, mesmo em vigência de controle glicêmico não ideal. Em estudos futuros, seria interessante explorar os efeitos da idade e a relação com DCV sobre este mecanismo.

Agradecimentos: O presente estudo foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp).

Este artigo é parte da tese de doutorado de Alina Coutinho Rodrigues Feitosa pelo Programa de Pós-graduação em Endocrinologia do Departamento de Clínica Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Declaração: Os autores declaram não haver conflito de interesses científicos pertinentes.

Recebido em 24/Jul/2008

Aceito em 17/nov/2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Mar 2009
• Data do Fascículo
  Fev 2009

Histórico

• Recebido
  24 Jul 2008
• Aceito
  17 Nov 2008