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Arquivos Brasileiros de Oftalmologia

versão impressa ISSN 0004-2749

Arq. Bras. Oftalmol. vol.72 no.1 São Paulo jan./fev. 2009

http://dx.doi.org/10.1590/S0004-27492009000100014 

ARTIGO ORIGINAL

 

Avaliação das alterações precoces na coróide e esclera ocorridas em coelhos hipercolesterolêmicos. Estudo histológico e histomorfométrico

 

Evaluation of choroid and sclera early alterations in hypercholesterolemic rabbits. Histologic and histomorphometric study

 

 

Rogil José de Almeida TorresI; Maurício MaiaII; Lucia NoronhaIII; Michel Eid FarahIV; Andréa LuchiniV; Décio BrikVI; Cristina MuccioliVII; Dalton Bertolin PrécomaVIII

IPós-graduando nível Doutorado do Departamento de Oftalmologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP (SP) - Brasil
IIOrientador da pós-graduação do Departamento de Oftalmologia da UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil. Médico Oftalmologista Diretor do Serviço de Cirurgia Vitreorretiniana do Hospital de Olhos Oeste Paulista - Assis (SP) - Brasil
IIIProfessora adjunta do Departamento de Patologia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná - PUCPR - Curitiba (PR) - Brasil
IVProfessor adjunto e livre-docente do Departamento de Oftalmologia UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil
VMédica do Centro Oftalmológico de Curitiba (PR) - Brasil
VIMestre em Oftalmologia pela UNIFESP - São Paulo (SP) - Brasil. Preceptor e responsável pela Residência Médica em Oftalmologia do Hospital Angelina Caron - Curitiba (PR) - Brasil
VIIProfessora livre-docente adjunta do Departamento de Oftalmologia da UNIFESP - São Paulo (SP), Brasil
VIIIProfessor adjunto do Departamento de Cardiologia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná - PUCPR - Curitiba (PR) - Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVO: Demonstrar experimentalmente, através de exames histológicos e histomorfométricos, as alterações degenerativas da esclera e coróide desencadeadas precocemente pela dieta hipercolesterolêmica.
MÉTODOS: Coelhos New Zealand foram organizados em dois grupos: GC (grupo controle), composto por 6 coelhos (6 olhos), recebeu dieta normal por 6 semanas; G1, composto por 12 coelhos (12 olhos), tratado previamente com ração colesterol a 1% (Sigma-Aldrich) por 2 semanas e a partir do 14º dia com ração colesterol a 0,5% (Sigma-Aldrich). Os olhos foram submetidos à análise histológica, avaliados com corante de hematoxilina-eosina e ao exame morfométrico. A análise histomorfométrica foi realizada no setor posterior, adjacente ao disco óptico, e na periferia.
RESULTADOS: O GC apresentou espessura média da esclera e coróide na periferia de 228,61 ± 31,71 micrômetros, enquanto na região posterior de aproximadamente 246,07 ± 25,66 micrômetros. No G1, observou-se espessura média da esclera e coróide na periferia de aproximadamente 303,56 ± 44,21 micrômetros, enquanto na região posterior de aproximadamente 295,59 ± 62,59. Houve diferença estatisticamente significativa da espessura da esclera e coróide entre os grupos na região periférica (p<0,001), não ocorrendo o mesmo no setor posterior (p=0,250). O aumento da espessura da parede de G1 em relação ao GC deve-se principalmente à quantidade elevada de histiócitos e fibras colágenas.
CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou que a dieta hipercolesterolêmica em coelhos induz rapidamente aumento da espessura da coróide e esclera, principalmente à custa de histiócitos e fibras colágenas.

Descritores: Colesterol/sangue; Coróide/irrigação sanguínea; Dieta; Hipercolesteremia; Degeneração macular; Aterosclerose; Esclera; Modelos animais; Coelhos; Estudo comparativo


ABSTRACT

PURPOSE: To demonstrate experimentally, by means of histological and histomorphometric examinations, the sclera and choroid degenerative alterations, which take place at an early stage due to a hypercholesterolemic diet.
METHODS: New Zealand rabbits were divided into two groups: CG (control group) of 6 rabbits (6 eyes) received a regular diet for 6 weeks; G1, of 12 rabbits (12 eyes), was first fed a 1% cholesterol diet (Sigma-Aldrich) for 2 weeks and then from the 14th day on a 0.5% cholesterol diet (Sigma-Aldrich). The eyes underwent a histological analysis, stained with hematoxiline-eosine, and a morphometric examination. The histomorphometric analysis was performed in the posterior region, adjacent to the optic disk, and in the peripheral region.
RESULTS: The CG presented a mean sclera and choroid thickness of 228.61 ± 31.71 micrometers in the peripheral region, while the thickness in the posterior region was approximately 246.07 ± 25.66 micrometers. In G1, these values were 303.56 ± 44.21 micrometers in the peripheral region and 295.59 ± 62.59 in the posterior region. There was a statistically significant difference in the sclera and choroid thickness between the groups in the peripheral region (p<0.001); however, this difference did not occur in the posterior region (p=0.250). The large number of histiocytes and collagen fibers accounted for the increase of G1 wall thickness in relation to CG.
CONCLUSION: This study demonstrated that the hypercholesterolemic diet in rabbits induces a fast increase in the choroid and sclera thickness, mainly due to the increase in the number of histiocytes and collagen fibers.

Keywords: Cholesterol/blood; Choroid/blood supply; Diet; Hypercholesterolemia; Macular degeneration; Atherosclerosis; Sclera; Models, animal; Rabbits; Comparative study


 

 

INTRODUÇÃO

A patogênese da degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) é controversa e muitas diferentes teorias têm sido propostas(1). Estudos epidemiológicos têm focado a hipótese vascular ao analisar os fatores clássicos de risco para a doença cardiovascular, tais como pressão arterial, colesterol sérico, tabagismo e consequentemente processo aterosclerótico como infarto do miocárdio. Os resultados têm sido inconclusivos, exceto no quesito tabagismo(2). Recente estudo demonstrou que níveis altos de HDL preveniriam a DMRI tardia enquanto alto nível de colesterol total proporcionaria risco maior para DMRI tardia e atrofia geográfica(3). Em modelo animal tem sido demonstrado que a dieta rica em colesterol ocasiona alterações coriorretinianas similares às ocorridas na DMRI humana(4-8). O objetivo deste trabalho é mostrar experimentalmente, através de exames histológicos e histomorfométricos, que as alterações degenerativas da esclera e coróide ocorrem precocemente ao administrar dieta hipercolesterolêmica a coelhos.

 

MÉTODOS

Para a realização deste estudo, o protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Hospital Angelina Caron e Universidade Federal de São Paulo (Protocolo nº 0806/07).

1. Ambiente de experimentação

Os procedimentos deste estudo foram realizados nas dependências do laboratório de Técnica Operatória da PUC-PR e do Centro de Estudos do Hospital Angelina Caron (HAC). Os animais foram mantidos no biotério em macroambiente com ciclos de iluminação 12/12 horas, com trocas de ar e temperatura controlada de 19 a 23ºC e receberam durante o experimento água e ração específica para a espécie (Nuvital®) de forma ad libitum.

2. Animais utilizados

Foram utilizados 18 coelhos machos albinos (Oryctolagus cunicullus) da linhagem New Zealand, provenientes do biotério da PUC-PR, com os pesos aproximados de 2.500 g, apresentando idade média de 4 meses. Estes animais tiveram um período de adaptação de 7 até 10 dias antes do início do experimento.

3.Preparo da ração suplementar

A ração própria para coelho (Nuvital®) foi colocada em um recipiente plano e largo, e distribuída numa camada fina. O colesterol diluído foi regado sob a ração, de forma homogênea.

A ração hipercolesterolêmica a 1%, utilizada nas duas primeiras semanas do experimento, apresentava 200 gramas de colesterol (Sigma-Aldrich à 95%®) dissolvido em 800 mililitros de clorofórmio (Biotec®), distribuídos em 20 quilogramas de ração Nuvital®. A ração hipercolesterolêmica a 0,5%, utilizada nas quatro semanas seguintes, apresentava 100 gramas de colesterol dissolvido em 800 mililitros de clorofórmio, distribuídos em 20 quilogramas de ração Nuvital®.

Esta ração foi preparada a cada 14 dias, esperando-se 48 horas para ser administrada aos animais. A quantidade diária ofertada para cada animal foi de 600 gramas ao dia(9).

4. Delineamento experimental

Foram organizados dois grupos de coelhos: O grupo controle denominado GC foi composto por 6 coelhos (6 olhos) enquanto o grupo denominado G1 foi composto por 12 coelhos (12 olhos). O GC recebeu dieta padrão, própria para coelho, durante 6 semanas, enquanto G1 recebeu ração colesterol a 1% por 2 semanas e posteriormente ração colesterol a 0,5% por 4 semanas.

Cada coelho foi submetido à dosagem sérica de colesterol total, triglicerídeos, HDL colesterol, glicemia de jejum no início do experimento, no 14º dia e na eutanásia, 42º dia. As coletas das amostras sanguíneas foram realizadas através de punção da veia marginal auricular magna sob anestesia geral com injeção intramuscular de ketamina 5 mg/kg e xylazina 35 mg/kg. As dosagens plasmáticas de glicemia, colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos foram realizados pelo método enzimático colorimétrico automatizado (Architec® - Abbott). Uma soroteca com 500 microlitros de cada animal foi congelada para análises futuras.

Os animais foram sacrificados com injeção endovenosa de 5 ml de pentobarbital e os olhos imediatamente fixados em paraformaldeído a 4% em 0,1 M fosfato / pH 7,4 por 4 horas para análise histopalógica e morfométrica.

5. Análise histomorfométrica (quantitativa)

Os dois olhos de cada animal (total de 36) foram removidos e submetidos à fixação, porém somente um foi escolhido para o estudo. Depois da fixação os espécimes foram avaliados macroscopicamente, sendo feito uma secção coronal ao nível do nervo óptico, dividindo os globos oculares em duas metades iguais (superior e inferior). A metade inferior foi estocada para estudos posteriores. Já a metade superior foi submetida à desidratação, diafanização e impregnação em parafina com histotécnico marca Leica®, modelo TP 1020. Para a confecção dos blocos de parafina (total de 36) utilizouse o inclusor Leica®, modelo EG1160. Estes blocos foram cortados com micrótomo, marca Leica® modelo RM2145, a 5 µ para obtenção dos cortes histológicos (total de 36). Estes cortes foram pescados em lâmina de vidro com albumina, corados com hematoxilina-eosina e montados com lamínula de vidro de 24x90 mm Entellan, Merck®.

As 36 lâminas coradas em hematoxilina-eosina foram analisadas sob o ponto de vista morfológico qualitativo, sendo que foram selecionados 18 cortes histológicos, um para cada animal do estudo, com qualidade técnica adequada para a realização da análise quantitativa.

Para a análise quantitativa, os cortes corados em hematoxilina-eosina previamente selecionados foram avaliados, e com a ajuda da objetiva de 4x e uma caneta de retroprojeção azul, a porção posterior da hemisecção do globo ocular foi dividida, manualmente, em 10 segmentos iguais (de pars plana a pars plana contralateral). Foi então feita a captura de uma imagem por segmento (total de 10 imagens capturadas em cada um dos 18 olhos analisados) através de microscópio Olympus BX50 acoplado a câmera Sony e software Image Proplus®. Em cada imagem capturada foram realizadas 4 medidas morfométricas lineares utilizando-se o software Image Proplus® (40 medidas em cada um dos 18 animais avaliados) para avaliar a espessura da coróide e da esclera nos 10 segmentos. Finalmente foram realizadas as médias das 4 medidas de cada um dos 10 segmentos em cada um dos 18 espécimes analisados e posteriormente, para efeitos de análise estatística, os 10 segmentos foram agrupados em 2 regiões: regiões próximas ao disco óptico (segmentos A e B), denominada região posterior e; regiões mais próximas a pars plana (zonas C, D e E), denominada região periférica (Figura 1).

 

 

6. Análise estatística

Para a comparação dos grupos em relação às variáveis do estudo, foi usado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Para a comparação das regiões analisadas, dentro de cada grupo, foi usado o teste não paramétrico de Wilcoxon. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística.

Quanto ao controle metabólico em cada um dos momentos de avaliação, para a comparação dos grupos em relação às variáveis, foi usado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística.

 

RESULTADOS

1. Resultados laboratoriais (Tabela 1)

No momento basal, não havia diferença estatisticamente significativa entre os grupos nos quesitos: peso, glicemia, colesterol total, HDL e triglicerídeos. Observou-se, no curso do experimento, que os coelhos do grupo G1 apresentaram significativo aumento do peso, da glicemia e do colesterol total em relação ao GC.

2. Microscopia óptica

Observou-se significativo aumento da espessura do complexo esclera-coróide no G1 (Figura 2B) em relação ao GC (Figura 2A). Com hematoxilina e eosina, foi possível verificar grande quantidade de histiócitos e fibras colágenas na esclera dos coelhos pertencentes ao G1 (Figura 2B).

3. Grupo controle (GC) X grupo hipercolesterolêmico (G1), para cada região (periférica e posterior)

Houve significativo aumento da espessura da esclera e coróide do G1. Esta alteração foi mais evidente nos setores periféricos (Tabela 2 e Gráfico 1) que nos setores posteriores (Tabela 2 e Gráfico 2).

 

 

 

 

4. Região periférica X região posterior dentro de cada grupo

A espessura da esclera e coróide posterior do GC foi maior que a espessura deste complexo na região periférica (p=0,249). No G1 observou-se modificação destes resultados, sendo que a região periférica tornou-se mais espessa que a região posterior (p=0,583). Estes dados não adquiriram relevância estatística dentro de cada grupo, exceto no quesito diferença entre a espessura da coróide periférica e posterior no GC (p=0,046) (Tabela 3).

 

 

DISCUSSÃO

Acredita-se que a fase inicial da DMRI possa estar relacionada com o acúmulo de depósitos ricos em lipídios abaixo do epitélio pigmentário retiniano (EPR)(1-2). Estes depósitos teriam origem no mau funcionamento das células do EPR(10) que enviaria restos celulares maiores que o normal, provenientes da fagocitose das extremidades dos fotorreceptores, para a coriocapilar. Estes fragmentos não conseguiriam ultrapassar a membrana de Bruch e se depositariam sobre ela, aumentando sua espessura(11), reduzindo a porosidade e condutibilidade hidráulica(11-13). Isto prejudicaria o acesso de nutrientes da coriocapilar para as células do EPR e fotorreceptores e interferiria na passagem de metabólitos do EPR para a coriocapilar(10).

Entretanto, a teoria proposta neste estudo baseia-se no modelo chamado vascular, similar à fisiopatologia da aterosclerose. Sabe-se que a aterosclerose é um processo reconhecidamente inflamatório, onde o colesterol (LDL) deposita-se na íntima da parede vascular, levando à perda da elasticidade arteriolar. Na esclera, o acúmulo de lipídios(14-15) provoca aumento da resistência pós-capilar da rede vascular da coróide, situada entre a parede escleral progressivamente enrijecida e o conteúdo não compressível do globo(16). A diminuição do fluxo sanguíneo da coróide e o aumento da resistência tendem a elevar a pressão hidrostática da coriocapilar aumentando o vazamento e deposição de proteínas extracelulares e lipídios, particularmente no pólo posterior, formando depósitos basais na membrana de Bruch e drusas; primeiras manifestações clínicas da DMRI(16-17). Na década de 80, após estudar o coeficiente de rigidez escleral de 29 pacientes com DMRI, esta teoria foi solidificada(18).

A partir destes estudos maior atenção foi dada ao componente escleral na gênese da DMRI. Na década de 90, houve um relato que demonstrou, através de ecodoppler colorido, diminuição da velocidade sanguínea e aumento da pulsação da artéria central da retina e das artérias ciliares posteriores curtas de pacientes que apresentavam DMRI(16).

Outro estudo, realizado na mesma década, avaliou o fluxo sanguíneo coroideano na região foveolar(19). Foi utilizada a dopplerfluxometria a laser para demonstrar que o fluxo sanguíneo na região foveolar, em pacientes com DMRI, é menor que no grupo controle. Este efeito foi atribuído principalmente à diminuição do volume sanguíneo. Estes estudos demonstraram a diminuição do fluxo sanguíneo da coróide em pacientes com DMRI, sugerindo etiologia isquêmica no desenvolvimento desta doença. É importante ressaltar que existem vários relatos que constatam angiograficamente o comprometimento da perfusão coroideana em pacientes com tal doença(20-24).

É importante lembrar que processos imunológicos e inflamatórios também são observados na DMRI visto que a análise imuno-histoquímica das drusas revela presença de apolipoproteínas B e E, imunoglobulinas, fator X, componente amiloidal P, complemento C5 e C5b-9, fibrinogênio e vitronectin, assim como exames histológicos da membrana neovascular ou cicatriz disciforme mostram a presença de macrófagos adjacentes às áreas adelgaçadas ou roturas da membrana de Bruch(25-28). Estes fatos podem demonstrar que a aterosclerose e DMRI compartilham de mecanismos fisopatogênicos similares.

Em modelo animal camundongo foi demonstrado que a administração de dieta altamente gordurosa provoca alterações na membrana de Bruch e EPR, comprovando que a ingestão deste tipo de dieta tem potencial para provocar no camundongo alterações similares à DMRI humana(4-5).

A utilização de coelho neste tipo de estudo ganhou preferência em relação a outros animais. Está comprovado que existem semelhanças experimentais entre a aterosclerose neste animal e no ser humano(29). Sabe-se também que os níveis séricos normais de colesterol variam de 25 a 60 mg% em contraste com o ser humano que apresenta variação de 100 a 200 mg%. Desta forma o sistema metabólico do coelho pode ser facilmente sobrecarregado através de simples dieta diária hipercolesterolêmica, tornando os experimentos mais viáveis e reprodutíveis(29). Este fato foi constatado no presente relato. O colesterol passou de 41,50 mg% para aproximadamente 600 mg% em 14 dias e finalmente, no momento da eutanásia, chegou a aproximadamente 881 mg%.

Indícios de alterações esclerais e coroideana provocadas pela hipercolesterolemia em coelhos já foram observados na literatura(29). Um experimento que consistiu na administração diária de 0,75% colesterol e 2,5% colesterol a coelhos durante 6 meses demonstrou presença de depósitos lipídicos na superfície interna da coróide assim como células espumosas (histiócitos) e gotículas de lipídios no tecido conectivo. Este estudo ponderou sobre a possibilidade de redução na circulação sanguínea ocular provocada pela hipercolesterolemia(30).

Experimentos posteriores, em olhos de coelhos, surgiram contribuindo para melhor compreensão desta patologia. Um relato(6) demonstrou que a dieta hipercolesterolêmica produz alterações em todas as camadas retinianas, aumento da espessura da membrana de Bruch, corpos densos no citoplasma do EPR, entre outras alterações. Foi concluído que o excesso de colesterol induz a alterações ultraestruturais da retina de coelhos similares àquelas da DMRI humana.

Outro estudo experimental observou que gotículas de colesterol na supracoróide comprimem as camadas vasculares e provocam hipertrofia das células endoteliais e musculares lisas vasculares(8). Neste estudo foi verificado que a espessura supracoroidea está aumentada em coelhos hipercolesterolêmicos devido à abundância de fibras colágenas. No presente relato foi possível evidenciar o significativo aumento da espessura da coróide e da esclera nos coelhos com a dieta hipercolesterolêmica, corroborando a teoria vascular. É importante frisar que os estudos destinados à avaliação das alterações coriorretinianas em olhos de coelhos realizados até a presente data, caracterizaram-se pela administração de dieta colesterol 0,5% durante o período mínimo de 6 meses(6-8). No presente relato foi possível obter alterações em 6 semanas de dieta hipercolesterolêmica. A dosagem de colesterol administrada neste estudo foi maior que outros relatos nas duas primeiras semanas (colesterol 1%), porém iguais aos demais estudos nas últimas 4 semanas do experimento (colesterol 0,5%). Este fato ganha importância em nosso meio científico, visto que fica demonstrado que alterações na parede ocular de coelhos podem ser obtidas em curto espaço de tempo, facilitando assim os experimentos e reduzindo os custos das pesquisas.

A espessura do complexo esclera-coróide na região periférica dos coelhos submetidos à dieta hipercolesterolêmica estava significativamente aumentada em relação aos coelhos de dieta normal. A região posterior também demonstrou aumento de espessura no G1, porém sem significância estatística. Estes resultados coincidem com outro relato(8).

Finalmente, vale lembrar que este estudo pode representar a formação da DMRI seca e que experimentos visando à prevenção desta patologia, envolvendo antioxidantes e medicamentos destinados ao controle do colesterol e aterosclerose, poderiam ter seu espaço neste modelo. Desta forma, ressaltase a importância da dieta hipocolesterolêmica na tentativa de se evitar ou atenuar a instalação ou progressão da DMRI.

 

CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou que a dieta hipercolesterolêmica em coelhos induz rapidamente aumento da espessura da coróide e esclera, principalmente à custa de histiócitos e fibras colágenas.

 

AGRADECIMENTOS

Aos Graduandos da Pontifícia Universidade Católica do Paraná: Luca Rodrigo Pasqualotto, Guilherme Winter, Flávia Kaiber e Greyce Kelly de Souza pela eficiente colaboração prestada em todas as fases do experimento.

À Prof. Dra. Márcia Orlandoswki pela importante colaboração na análise estatística do material coletado.

 

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Endereço para correspondência:
Rogil José de Almeida Torres
Praça Ruy Barbosa, 827 - Conj 305
Curitiba (PR) CEP 80010-030
E-mail: rjat@terra.com.br

Recebido para publicação em 03.03.2008
Última versão recebida em 17.12.2008
Aprovação em 20.12.2008

 

 

Trabalho realizado no Hospital Angelina Caron - Campina Grande do Sul (PR), no Departamento de Oftalmologia da Universidade Federal de São Paulo e na Pontifícia Universidade Católica do Paraná - PUCPR - Curitiba (PR) - Brasil.
Fontes de auxílio à pesquisa: Lilacs, Medline e Biblioteca Cocharane. Sem restrição de ano ou linguagem.
Trabalho parcialmente auxiliado pela FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) e pela empresa Kemin do Brasil.