Efeito do lipopolissacarídio bacteriano sobre o esvaziamento gástrico de ratos: avaliação do pré-tratamento com dexametasona e azul de metileno

The effect of bacterial lipopolysaccharide on the gastric emptying of rats: a pretreatment evaluation using dexamethasone and methylene blue

Resumos

RACIONAL: O óxido nítrico pode estar envolvido no retardo do esvaziamento gástrico produzido pelo lipopolissacarídio bacteriano. OBJETIVO: Avaliar o efeito do pré-tratamento com a dexametasona, bloqueadora da indução do óxido nítrico-sintetase induzida e com o azul de metileno, que bloqueia a guanilato-ciclase, inibe as óxido nítrico-sintetases e inativa o óxido nítrico, sobre o retardo do esvaziamento gástrico determinado pelo lipopolissacarídio em ratos. MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizados ratos Wistar, machos, ''specific patogen free'', após 24 horas de jejum alimentar. No pré-tratamento foram empregadas, via intravenosa, soluções de dexametasona (3 e 6 mg/kg), azul de metileno (2 mg/kg) e veículo estéril. O tratamento constou da administração, via intravenosa, de lipopolissacarídio (50 mig/kg) e veículo. O intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos, exceto no estudo com dexametasona 6 mg/kg, que foi de 1 hora. O intervalo entre a administração do lipopolissacarídio e a avaliação do esvaziamento gástrico foi de 1 hora, exceto nos dois estudos com dexametasona 3 mg/kg que foram de 2 e 8 horas. O esvaziamento gástrico foi avaliado, indiretamente, através da determinação da percentagem de retenção gástrica de solução salina marcada com fenol vermelho. RESULTADOS: Os valores de retenção gástrica, nos animais pré-tratados com dexametasona ou azul de metileno e tratados com veículo, não diferiram significativamente dos observados nos que receberam veículo nos dois momentos. Os animais pré-tratados com veículo e tratados com lipopolissacarídio apresentaram valores de retenção gástrica significativamente mais elevados que nos controles. O pré-tratamento com dexametasona não interferiu no aumento da retenção gástrica determinado pelo lipopolissacarídio, nas primeiras 2 horas após administração da endotoxina. Oito horas após a administração da endotoxina, foi observada diminuição significativa da retenção gástrica nos animais pré-tratados com dexametasona e tratados com lipopolissacarídio em relação aos que receberam veículo + lipopolissacarídio. O mesmo fenômeno foi observado nos animais pré-tratados com azul de metileno e tratados com lipopolissacarídio. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem o envolvimento do óxido nítrico no efeito do lipopolissacarídio sobre o esvaziamento gástrico em ratos.

Esvaziamento gástrico; Lipopolissacarídeos; Óxido nítrico; Dexametasona; Azul de metileno; Ratos

BACKGROUND: The nitric oxide might be a putative mediator of the decrease in gastric emptying induced by bacterial lipopolysaccharide in rats. AIM: For that, we evaluated the effect of the pretreatment intravenous with dexamethasone and methylene blue in the retardation process of gastric emptying induced by intravenous application of lipopolysaccharide in rats. Dexamethasone has been shown to inhibit the induction of NOS II (induced NO-synthase) while the methylene blue, that blocks the soluble guanylyl cyclase, inhibits nitric oxide synthases and, in addition, inactivates nitric oxide directly. MATERIAL AND METHODS: Male Wistar rats, specific patogenic free, were used after a 24 hour fast and 1 hour-water withdrawn. The pretreatment was performed using dexamethasone solutions (3 and 6 mg/kg), methylene blue (2 mg/kg) or sterile vehicle. The treatment consisted in the application of lipopolysaccharide (50 mug/kg) or vehicle. The time period between the pretreatment and treatment was 10 minutes, excluding the study with dexamethasone 6 mg/kg that was 1 hour. The gastric emptying was evaluated 1 hour after the lipopolysaccharide application, except for two studies with dexamethasone 3 mg/kg in which the time periods were 2 and 8 hours. A saline solution containing phenol red was used as the test meal. The gastric emptying was determined by measuring gastric retention 10 minutes after the orogastric infusion of the test meal. RESULTS: The pretreatment with dexamethasone or methylene blue and treatment with vehicle did not have effect in the gastric emptying comparing to the control group. We found that pretreatment with dexamethasone in the studies for 1 hour and 2 hours did not interfere in the retardation of the gastric emptying produced by endotoxin. Nevertheless, in the eighth period study with this drug there was a significant reduction of gastric retention in the endotoxin-treated animals in relation to the unpretreated ones. Meanwhile, the pretreatment with the methylene blue completely blocked the action of endotoxin on the gastric emptying in rats. CONCLUSION: These results suggest a possible involvement of nitric oxide on the effect of lipopolysaccharide in rat gastric emptying.

Gastric emptying; Lipopolysaccharides; Nitric oxide; Dexametasone; Methylene blue; Rats

EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGY

Efeito do lipopolissacarídio bacteriano sobre o esvaziamento gástrico de ratos: avaliação do pré-tratamento com dexametasona e azul de metileno

The effect of bacterial lipopolysaccharide on the gastric emptying of rats: a pretreatment evaluation using dexamethasone and methylene blue

Edgard Ferro Collares^I; Adriana Mendes Vinagre^II

^IDepartamento de Pediatria

^IINúcleo de Medicina e Cirurgia Experimental, UNICAMP, Campinas, SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

RACIONAL: O óxido nítrico pode estar envolvido no retardo do esvaziamento gástrico produzido pelo lipopolissacarídio bacteriano.

OBJETIVO: Avaliar o efeito do pré-tratamento com a dexametasona, bloqueadora da indução do óxido nítrico-sintetase induzida e com o azul de metileno, que bloqueia a guanilato-ciclase, inibe as óxido nítrico-sintetases e inativa o óxido nítrico, sobre o retardo do esvaziamento gástrico determinado pelo lipopolissacarídio em ratos.

MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizados ratos Wistar, machos, ''specific patogen free'', após 24 horas de jejum alimentar. No pré-tratamento foram empregadas, via intravenosa, soluções de dexametasona (3 e 6 mg/kg), azul de metileno (2 mg/kg) e veículo estéril. O tratamento constou da administração, via intravenosa, de lipopolissacarídio (50 mg/kg) e veículo. O intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos, exceto no estudo com dexametasona 6 mg/kg, que foi de 1 hora. O intervalo entre a administração do lipopolissacarídio e a avaliação do esvaziamento gástrico foi de 1 hora, exceto nos dois estudos com dexametasona 3 mg/kg que foram de 2 e 8 horas. O esvaziamento gástrico foi avaliado, indiretamente, através da determinação da percentagem de retenção gástrica de solução salina marcada com fenol vermelho.

RESULTADOS: Os valores de retenção gástrica, nos animais pré-tratados com dexametasona ou azul de metileno e tratados com veículo, não diferiram significativamente dos observados nos que receberam veículo nos dois momentos. Os animais pré-tratados com veículo e tratados com lipopolissacarídio apresentaram valores de retenção gástrica significativamente mais elevados que nos controles. O pré-tratamento com dexametasona não interferiu no aumento da retenção gástrica determinado pelo lipopolissacarídio, nas primeiras 2 horas após administração da endotoxina. Oito horas após a administração da endotoxina, foi observada diminuição significativa da retenção gástrica nos animais pré-tratados com dexametasona e tratados com lipopolissacarídio em relação aos que receberam veículo + lipopolissacarídio. O mesmo fenômeno foi observado nos animais pré-tratados com azul de metileno e tratados com lipopolissacarídio.

CONCLUSÃO: Os resultados sugerem o envolvimento do óxido nítrico no efeito do lipopolissacarídio sobre o esvaziamento gástrico em ratos.

Descritores: Esvaziamento gástrico. Lipopolissacarídeos. Óxido nítrico. Dexametasona. Azul de metileno. Ratos.

ABSTRACT

BACKGROUND: The nitric oxide might be a putative mediator of the decrease in gastric emptying induced by bacterial lipopolysaccharide in rats.

AIM: For that, we evaluated the effect of the pretreatment intravenous with dexamethasone and methylene blue in the retardation process of gastric emptying induced by intravenous application of lipopolysaccharide in rats. Dexamethasone has been shown to inhibit the induction of NOS II (induced NO-synthase) while the methylene blue, that blocks the soluble guanylyl cyclase, inhibits nitric oxide synthases and, in addition, inactivates nitric oxide directly.

MATERIAL AND METHODS: Male Wistar rats, specific patogenic free, were used after a 24 hour fast and 1 hour-water withdrawn. The pretreatment was performed using dexamethasone solutions (3 and 6 mg/kg), methylene blue (2 mg/kg) or sterile vehicle. The treatment consisted in the application of lipopolysaccharide (50 mg/kg) or vehicle. The time period between the pretreatment and treatment was 10 minutes, excluding the study with dexamethasone 6 mg/kg that was 1 hour. The gastric emptying was evaluated 1 hour after the lipopolysaccharide application, except for two studies with dexamethasone 3 mg/kg in which the time periods were 2 and 8 hours. A saline solution containing phenol red was used as the test meal. The gastric emptying was determined by measuring gastric retention 10 minutes after the orogastric infusion of the test meal.

RESULTS: The pretreatment with dexamethasone or methylene blue and treatment with vehicle did not have effect in the gastric emptying comparing to the control group. We found that pretreatment with dexamethasone in the studies for 1 hour and 2 hours did not interfere in the retardation of the gastric emptying produced by endotoxin. Nevertheless, in the eighth period study with this drug there was a significant reduction of gastric retention in the endotoxin-treated animals in relation to the unpretreated ones. Meanwhile, the pretreatment with the methylene blue completely blocked the action of endotoxin on the gastric emptying in rats.

CONCLUSION: These results suggest a possible involvement of nitric oxide on the effect of lipopolysaccharide in rat gastric emptying.

Headings: Gastric emptying. Lipopolysaccharides. Nitric oxide. Dexametasone. Methylene blue. Rats.

INTRODUÇÃO

O lipopolissacarídio (LPS) bacteriano determina, em animais, retardo do esvaziamento gástrico (EG) de líquidos e sólidos^{(20, 36)}. Em ratos, utilizando a via intravenosa (iv) e doses menores de LPS, o retardo do EG de uma refeição líquida foi precoce, intenso nas primeiras horas e correlacionado com a dose⁽⁸⁾. Estudo adicional demonstrou que o pré-tratamento com o próprio LPS aboliu este efeito, reproduzindo para o EG, o fenômeno de tolerância precoce, já descrito para outras alterações produzidas pela endotoxina⁽⁹⁾. Muitos dos efeitos do LPS em animais podem ser atribuídos a fatores liberados na fase aguda da inflamação, estando entre estes as citocinas^{(4, 12, 18, 39)} e óxido nítrico (ON)⁽³⁵⁾. Há evidências da participação do ON nos mecanismos fisiológicos de relaxamento do piloro⁽²⁸⁾, fundo gástrico^{(3, 10)} e duodeno⁽²⁴⁾. O fenômeno inibitório da atividade motora da musculatura lisa decorreria da ativação da guanilato-ciclase solúvel, na célula muscular, pelo ON produzido nesta célula a partir da ligação do VIP, liberado nas terminações não-colinérgicas não-adrenérgicas entéricas, com receptores localizados na membrana celular^{(15, 23, 31)}. A síntese do ON a partir de L-arginina depende da ação das ON-sintetases (ONS) constitutivas, ONS I (ou nc-ONS) e ONS III (ou ec-ONS) presentes no sistema nervoso e endotélio vascular, respectivamente, e da ONS II (ou i-ONS), induzida pela endotoxina ou citocinas^{(13, 25)}.

O azul de metileno (AM) foi considerado e utilizado inicialmente, in vitro, como bloqueador seletivo da guanilato-ciclase em tecido muscular liso^{(7, 31)}. Está claro atualmente que também inibe as ONS e inativa diretamente o ON⁽²¹⁾. O pré-tratamento com glicocorticóides bloqueia a indução da ONS II nas células endoteliais, musculares lisas, macrófagos e fibroblastos^{(13, 19, 29)}. Também os glicocorticóides, de acordo com o tipo, concentração e biodisponibilidade, são potentes inibidores da expressão das citocinas, tanto ao nível de transcrição como após transcrição^{(1, 38)}.

Este estudo teve como objetivo avaliar, in vivo, o efeito do pré-tratamento com dexametasona (D_EX) e com AM sobre o fenômeno de retardo do EG determinado pelo LPS em ratos.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais

Foram utilizados ratos Wistar, machos, ''specific patogen free'', com 8-10 semanas de vida, pesando entre 220-280 g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual de Campinas. Antes do estudo, os animais permaneceram pelo menos 2 semanas adaptando-se às condições do laboratório, com temperatura entre 22°C e 26°C, ritmo de luz e penumbra de 12/12 horas, recebendo ração (Labina, Purina) e água ad libitum. No planejamento e execução da pesquisa, foram obedecidas as recomendações do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).

Drogas

Foram utilizadas: LPS de E. coli, cepa 055:B5 (Sigma), na concentração de 50 mg/mL, solução de D_EX (Decadron, Prodome) na concentração de 3 mg/mL e solução de AM (Sigma) na concentração de 2 mg/mL. Solução salina estéril e livre de pirogênio foi empregada como veículo na preparação das diluições. Em todos os estudos, os volumes do veículo e de cada solução administrada por via iv, utilizando uma das veias da cauda, para cada animal e para cada aplicação, foram equivalentes. A dose de LPS utilizada para o tratamento em todos estudos foi de 50 mg/kg de peso do animal.

Delineamento experimental

Os estudos foram realizados entre 14 e 17 h do dia, após 24 horas de jejum alimentar, com os animais tendo livre acesso à água, suspenso no momento da prova.

Foram feitos três estudos do efeito da administração prévia da D_EX (Figura 1). Cada estudo foi formado de um grupo-controle (C) pré-tratado com salina e outro grupo em que o pré-tratamento foi feito com D_EX. No primeiro estudo (E1h) foi utilizado D_EX na dose de 6 mg/kg, o intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 1 hora e a avaliação do EG foi feita 1 hora após o tratamento. Nos segundo e terceiro estudos, empregou-se D_EX 3 mg/kg. No segundo estudo, o intervalo de tempo entre o tratamento e a avaliação do EG foi de 2 horas (E2h) e no terceiro foi de 8 horas (E8h). Nestes dois últimos, o intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos. Em cada estudo, cada grupo foi formado de dois subgrupos de oito animais cada: o grupo-controle formado com o subgrupo CS, em que os animais receberam solução salina em duas oportunidades e com o subgrupo CL_PS, em que, após administração de salina, os animais receberam LPS; o grupo pré-tratado com D_EX formado com o subgrupo D_EXS, em que os animais receberam D_EX e, a seguir, solução salina; e com o subgrupo D_EXL_PS, em que, após administração da D_EX, os animais receberam LPS. Após intervalo de 1, 2 e 8 horas do tratamento nos estudos E1h, E2h e E8h, respectivamente, foram feitas avaliações do EG.

Na observação do efeito do pré-tratamento com AM (2 mg/kg de peso), os animais foram também divididos em dois grupos: C pré-tratado com salina e outro grupo em que o pré-tratamento foi feito com AM. Cada grupo foi dividido em dois subgrupos de oito animais cada: o C, formado com subgrupo CS, em que os animais receberam salina em duas oportunidades e com o subgrupo CL_PS, onde os animais receberam solução salina e, a seguir, LPS; o grupo pré-tratado com AM foi formado com o subgrupo AMS, em que os animais receberam salina após a administração de solução de AM e com o subgrupo AML_PS, onde os animais receberam LPS após administração do AM. O intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos. Uma hora após o tratamento, foi feita avaliação do EG (Figura 1).

Esvaziamento gástrico

Como refeição de prova (RP) foi utilizada solução de NaCl 0,9% (p/v) marcada com fenol vermelho (6 mg/dL). Em todos os experimentos, a determinação do EG foi feita indiretamente, em ratos acordados, através da determinação da percentagem de retenção gástrica (RG) da RP, 10 minutos após sua administração orogástrica, utilizando técnica padronizada no laboratório^{(2, 5)}.

Análise estatística

Na análise estatística foi empregada ANOVA, seguida, quando indicado, do teste de Tukey na comparação entre os pares. O valor de a foi estabelecido em 5%.

RESULTADOS

Os resultados da RG são apresentados em média ± erro padrão da média (epm) nas Figuras 2, 3, 4, 5.

Nos animais pré-tratados com D_EX ou AM e tratados com salina, os valores da RG não diferiram significativamente dos observados nos seus CS. Em todos os estudos, os animais pré-tratados com salina e tratados com LPS apresentaram valores da RG significativamente mais elevados que aqueles observados nos controles.

Constatou-se que em E1h e E2h (Figuras 2, 3), o pré-tratamento com D_EX, mesmo com dose mais elevada ou até 2 horas após a administração do LPS, não interferiu no retardo do EG induzido pela endotoxina. Os valores da RG no subgrupo D_EXL_PS não diferiram significativamente dos observados no subgrupo que não recebeu D_EX (subgrupo CL_PS). No estudo E8h (Figura 4), o glicocorticóide reduziu significativamente a RG induzida pela endotoxina (D_EXL_PS vs CL_PS) indicando bloqueio do efeito do LPS sobre o EG. O resultado no subgrupo DvL_PS também não diferiu significativamente do observado no respectivo controle (subgrupo D_EXS).

Na Figura 5, são apresentados os resultados da RG no estudo do efeito do AM. Pode ser observado que administração prévia de AM reduziu significativamente a RG da refeição, nos animais tratados com endotoxina (AML_PS vs CL_PS). A redução do efeito da endotoxina foi suficiente para que o subgrupo AML_PS não diferisse significativamente do seu controle (subgrupo AMS).

DISCUSSÃO

Os sintomas como anorexia, náuseas, vômitos e saciedade precoce são manifestações comuns nos processos infecciosos. Acompanhando estes sintomas, tem sido observado retardo do EG que, em parte, pode explicá-los. A indução desta alteração funcional do estômago em animais, com o emprego do LPS, vem sendo utilizada como modelo de estudo dos mecanismos envolvidos no retardo do esvaziamento em infecções^{(8, 20)}. Contudo, até o momento, possivelmente em razão da complexidade do fenômeno, estes mecanismos não estão claramente definidos. Como fator adicional que dificulta o entendimento, destaca-se nos estudos disponíveis na literatura a falta de uniformidade quanto às doses de LPS, às vias de administração e ao momento em que foram feitas as observações in vivo ou in vitro, dificultando a comparação dos resultados.

É conhecido que a endotoxina estimula a síntese ou a liberação de várias citocinas da fase aguda da infecção ou injúria^{(4, 12, 18, 39)}. Recentemente, HERMANN et al.⁽¹⁷⁾, estudando o efeito da endotoxina iv sobre o EG, após 60 minutos, concluíram que o fenômeno de retardo seria conseqüência da ação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) sobre o complexo dorsal do vago. Observações indicam que a dexametasona liga-se preferentemente a receptores tipo II e suprimem o aparecimento do fator de necrose tumoral (TNF)^{(37, 38)}. Entretanto, o efeito máximo de supressão foi demonstrado quando o intervalo entre a administração da dexametasona e o LPS foi de 5 horas⁽³⁷⁾. Sendo assim, como nos estudos E2h e E1h o pré-tratamento com o corticoesteróide foi feito 10 minutos e 1 hora antes do tratamento, respectivamente, o fenômeno poderia ser imputado à ação do TNF-a no sistema nervoso central (SNC), como sugerido por HERMANN et al.⁽¹⁷⁾.

Contudo, há indicações de que a via aferente vagal é rota de atuação das citocinas no SNC⁽²²⁾. Como evidência da possibilidade de participação desta via, foi observado recentemente que a abolição da via sensitiva aferente do vago, com capsaicina, bloqueia o efeito da endotoxina sobre o EG de sólidos em ratos⁽⁶⁾.

Em contradição com o que aqui foi encontrado, TURNER e BERRY⁽³⁶⁾, utilizando intervalos de tempos semelhantes, demonstraram em camundongos, utilizando cortisona, bloqueio do efeito no EG da administração intraperitonial de uma suspensão morta de S. typhimurium. Levando em conta a via de administração e a natureza do estímulo, é provável que esses tenham interferido num fenômeno diferente do aqui estudado.

Por outro lado, o pré-tratamento com AM diminuiu significativamente o efeito do LPS sobre EG, 1 hora após o tratamento. Como o AM bloqueia de forma não específica a geração e ação do ON^{(21, 27)}, este resultado sugere a participação, numa condição não-fisiológica, in vivo, deste gás no efeito da endotoxina sobre o esvaziamento. Numa primeira possibilidade, o ON seria gerado no sistema vascular, através da ativação da ONS III constitutiva. O LPS em doses extremamente elevadas via iv (mais de 200 vezes em relação à empregada neste estudo) determina agudamente, em ratos, hipotensão arterial sistêmica e diminuição da reatividade vascular aos vasoconstrictores. Este efeito é bloqueado com emprego de um antagonista de L-arginina, sugerindo a participação da ONS III^{(16, 34)}. Esta possibilidade, contudo, parece pouco provável, visto que a hipotensão arterial, em conseqüência à perda aguda de volume sangüíneo em ratos, aumenta o EG⁽¹⁴⁾. Sendo assim, uma segunda possibilidade é que a geração do ON seja decorrente da atividade da ON-sintetase constitutiva ONS I, ativada via não-adrenérgica não-colinérgica.

Em adição, foi também observado no presente estudo, que a D_EX foi capaz de inibir o efeito mais tardio da toxina (8 horas após), sugerindo que, nesta fase, há necessidade da indução de um sistema que envolva ativação ou síntese. Sendo assim, estes resultados poderiam ser interpretados como devidos exclusivamente à supressão das citocinas pelo corticoesteróide, tendo como conseqüência a ausência de estímulo inibitório via vago e/ou circulatória do SNC. Contudo, a supressão mais efetiva das citocinas só foi conseguida com a administração crônica ou quando o intervalo entre a administração da D_EX e o LPS foi de horas^{(26, 37)}.

Há muitas evidências que sugerem que este efeito tardio da D_EX seria decorrente da supressão da produção de ONS II. Assim, o pré-tratamento com D_EX bloqueia a expressão desta enzima no endotélio vascular de ratos tratados com endotoxina^{(19, 29)}. No estômago, foi demonstrada in vitro a indução desta enzima, utilizando preparações isoladas de fundo gástrico de ratos, incubadas durante 6 horas com LPS, indução esta bloqueada, acrescentando ao banho um inibidor de síntese protéica⁽³²⁾. Posteriormente, foi demonstrado o mesmo efeito in vivo empregando o pré-tratamento com aminoguanidina, inibidor específico da ONS II⁽³³⁾. Sendo assim, a liberação de ON nas células musculares lisas do estômago seria responsável pelo retardo do EG observado 8 horas após a administração do LPS. Outra possibilidade seria através da ativação da ONS II em macrófagos da submucosa gástrica, determinando o relaxamento da camada muscular circular adjacente, como já demonstrado in vitro⁽⁴⁰⁾. Como o estômago proximal, que inclui o fundo gástrico, participa do EG de líquidos⁽³⁰⁾, o efeito tardio do LPS, no presente estudo, poderia ser devido à liberação de ON neste segmento.

Recentemente, um estudo in vitro sugere que, adicionalmente, o LPS determinaria, pelo menos em parte, retardo do EG em conseqüência da inibição do relaxamento não-adrenérgico não-colinérgico e aumento da resposta à estimulação muscarínica do piloro⁽¹¹⁾.

Como conclusão, os resultados obtidos nesta pesquisa sugerem a possibilidade do envolvimento do óxido nítrico no retardo do EG produzido pelo LPS in vivo, inicialmente através da ativação da ON-síntetase constitutiva (ONS I) e, tardiamente, da induzida (ONS II).

Recebido em 14/3/2002

Aprovado em 6/2/2003

Trabalho realizado no Departamento de Pediatria, Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental (NMCE) e Centro de Investigação em Pediatria (CIPED) da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP.

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Endereço para correspondência

Dr. Edgard Ferro Collares

Departamento de Pediatria – Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP

Cidade Universitária Zeferino Vaz – Barão Geraldo

13083-970 – Campinas, SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jan 2004
• Data do Fascículo
  Jun 2003

Histórico

• Aceito
  06 Fev 2003
• Recebido
  14 Mar 2002