Análise das impressões digitais de DNA e de fatores de virulência de linhagens de Helicobacter pylori

Analysis of molecular fingerprint and virulence factors of Helicobacter pylori strains

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL ARTICLE

Análise das impressões digitais de DNA e de fatores de virulência de linhagens de Helicobacter pylori

Analysis of molecular fingerprint and virulence factors of Helicobacter pylori strains

Anita P. O. Godoy; Maíra C. B. Miranda; Luciana C. Paulino; Sergio Mendonça; Marcelo Lima Ribeiro; José Pedrazzoli Jr.

Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia – UNIFAG, Universidade São Francisco, Bragança Paulista, SP

^{Correspondência}

RESUMO

RACIONAL:Helicobacter pylori é hoje aceito como o principal agente etiológico de gastrite em seres humanos e fator de risco para úlcera péptica e câncer gástrico. A evolução da infecção está relacionada a diversos fatores, inclusive bacterianos, como presença do gene cagA e o genótipo vacA s1m1, associados ao desenvolvimento de úlcera e adenocarcinoma gástrico. A técnica de RAPD ("random amplified polimorphic") tem sido amplamente utilizada para obtenção de impressões digitais de DNA para examinar a similaridade entre linhagens.

OBJETIVOS: Avaliar a presença de cagA e alelos do vacA em amostras de H. pylori e associar os achados com a doença apresentada e também investigar possível clonicidade entre os fatores de virulência e as doenças com a impressão digital de DNA gerada pelo RAPD-PCR.

MÉTODOS: Foram incluídas 112 amostras provenientes de pacientes com diferentes laudos endoscópicos: gastrite (n = 41), esofagite de refluxo (n = 14), úlcera gástrica (n = 19) e úlcera duodenal (n = 38). A análise dos fatores de virulência da bactéria foi feita por PCR e as impressões digitais de DNA foram estabelecidas pelo método de RAPD-PCR.

RESULTADOS: Os resultados obtidos indicam que houve uma associação significativa entre úlcera duodenal e o mosaico vacA s1m1. Analisando-se os padrões de bandas geradas pelo RAPD-PCR, sete diferentes dendogramas foram construídos e não foi possível detectar associação significativa entre os agrupamentos, sugerindo que as amostras não possuem perfil clonal.

CONCLUSÃO: Os resultados reforçam a importância do gene vacA como um marcador de virulência do H. pylori. O RAPD da impressão digital de DNA realizado foi incapaz de associar o padrão de bandas com as enfermidades e os genótipos de vacA e cagA.

Descritores: Impressões digitais de DNA. Helicobacter pylori. Infecções por Helicobacter. Antígenos de bactérias. Proteínas de bactérias.

ABSTRACT

BACKGROUND: Helicobacter pylori is now accepted as the most important agent of gastritis in humans, as well as a risk factor for peptic ulcer disease and gastric carcinoma. The outcome of the infection is related to several factors, among them bacterial ones such as cagA and vacA s1m1 genotype. Random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR, has been used to generate DNA fingerprints to evaluate similarity among strains within a bacterial species.

AIM: To assess the association between RAPD fingerprinting, virulence factors and the disease.

METHODS: H. pylori was isolated from 112 patients (41 with gastritis; 19 with gastric ulcers; 38 with duodenal ulcer disease; and 14 with gastroesophageal reflux disease). Allelic variants of cagA and vacA were identified using the polymerase chain reaction (PCR) and the fingerprints were generated by RAPD-PCR.

RESULTS: There was a strong association between the genotype vacA s1m1 and duodenal ulcers. Although RADP-PCR is a very useful tool in genotyping H. pylori, no significant correlation between the diseases studied and DNA fingerprint was detected neither with fingerprint and different vacA and, cagA genotypes.

CONCLUSIONS: The extension of our analysis to patients with well-characterized gastric diseases may provide significant information on the relationship between vacA genotypes and clinical outcomes of H. pylori infection.

Headings: DNA fingerprints. Helicobacter pylori. Helicobacter infections. Antigens. Bacterial. Bacterial proteins.

INTRODUÇÃO

Helicobacter pylori tem sido associado à etiopatogenia de diversas doenças do sistema digestório⁽³⁵⁾. Atualmente, o microrganismo é considerado o mais importante agente causador de gastrite, fator essencial na gênese da úlcera péptica e fator de risco para o desenvolvimento de câncer gástrico⁽¹⁹⁾. Há, ainda, evidências de sua associação com o linfoma MALT (linfoma do tecido linfóide associado à mucosa) e com o linfoma não-Hodgkin gástrico⁽¹⁵⁾.

Isolados clínicos obtidos de diferentes pacientes têm mostrado grande diversidade genética^{(25, 34)}. Nesse sentido, estudos baseados nas seqüências genômicas de duas cepas de H. pylori (26695 e J99) revelaram que 22% dos genes não são essenciais e aproximadamente 6% são únicos a cada linhagem^{(7, 50)}. Além disso, é notável a variação na seqüência de alguns genes ou regiões, como a ilha de patogenicidade cag (PAI)^{(14, 43)} e genes de resistência a drogas^{(43, 47)}.

Nos últimos anos vem se intensificando a pesquisa de marcadores de patogenicidade na tentativa de detectar linhagens bacterianas associadas a cada uma das doenças. O antígeno CagA é um fator de virulência do H. pylori que é codificado pelo gene cagA. A maioria das funções desempenhadas pelas proteínas produzidas por cagPAI ainda não foi determinada, no entanto, sabe-se que sua presença está associada ao aumento da secreção de interleucina 8 (IL-8), o que é importante para a quimiotaxia e para a ativação de neutrófilos. O cagPAI também é responsável pela remodelação da superfície celular e formação de pedestal, fosforilação de tirosina das células do hospedeiro, ativação do fator transcripcional AP-1 e expressão de protooncogenes c-fos e c-jun por ativação da cascata quinase ERK/MAP^{(23, 52, 53)}. Por essa razão, a produção dessa proteína tem sido associada à progressão das doenças gastrointestinais⁽⁸⁾. Parsonnet et al.⁽⁴¹⁾ mostraram que pacientes infectados por linhagens mais virulentas (cagA⁺) teriam um risco 3 vezes maior de desenvolver câncer gástrico.

A produção da citotoxina vacuolizante (VacA), codificada pelo gene vacA, induz à formação de vacúolos nas células epiteliais⁽¹²⁾. Além disso, a VacA produz efeitos prejudiciais diretos nas células como, a alteração do citoesqueleto, a eliminação da proliferação celular, a migração e a apoptose^{(13, 40)}. Outros efeitos observados foram a inibição, a ativação e proliferação dos linfócitos T, e a modulação da citocina responsável pela modulação das células T sendo, assim, uma potente toxina imunodepressora, tendo como alvo o sistema imune adaptativo⁽²²⁾. Estudo recente⁽⁶¹⁾ demonstrou que isolados clínicos infectados por linhagens com genótipo vacA s1m1 tem a capacidade de mediar a formação de canais ativos e a intoxicação celular, que resulta em redução do potencial transmenbranar das mitocôndrias e liberação de citocromos C.

O estudo de marcadores genéticos e técnicas de genotipagem bacteriana são importantes ferramentas para análises epidemiológicas, patogênicas e de susceptibilidade bacteriana. As técnicas mais freqüentemente usadas para as tipagens de isolados de H. pylori são "restriction fragment length polymorphisms" (PCR-RFLP), "random amplified polimorphic" DNA-PCR (RAPD) e ribotipagem, porém seus desempenhos não têm sido avaliados com perspicácia⁽¹⁰⁾. O RAPD⁽⁶²⁾ tem sido aplicado para a distinção entre os isolados de H. pylori, entretanto existem problemas quando a estabilidade e reprodutibilidade da técnica, podendo apresentar amplificação instável para fragmentos pequenos, especialmente por não apresentar bandas visíveis⁽²⁸⁾.

Neste estudo avaliou-se o perfil genético dos isolados clínicos de H. pylori através da as impressões digitais de DNA obtido pela técnica de RAPD-PCR e comparou-se com as manifestações clinicas dos pacientes e também com a genotipagem dos fatores de virulência vacA e cagA, além de associar os fatores de virulências com as doenças manifestadas nos pacientes envolvidos.

MÉTODOS

Casuística

As amostras de H. pylori pertencem ao banco de linhagens da Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia (UNIFAG) da Universidade São Francisco de Bragança Paulista, SP e foram obtidas de biopsias coletada de voluntários participantes de estudos anteriores previamente aprovados pelo comitê de ética médica (CEP-USF).

Foram incluídas no presente estudo 112 amostras provenientes de pacientes com diferentes laudos endoscópicos: gastrite (n = 41), esofagite de refluxo (n = 14), úlcera gástrica (n = 19) e úlcera duodenal (n = 38). Dentre os isolados clínicos, 64 eram de pacientes do sexo masculino com idades variando entre 21 a 83 ( = 39,2 e DP = 13,41) e 48 do feminino, com idades entre 20 e 87 anos ( = 47,58 e DP = 16,55).

Cultivo em meio sólido

As linhagens estocadas foram reativadas em meio seletivo BHI agar (Merck, Darmstadt, Alemanha), suplementada com 5% sangue de carneiro desfibrinado, 6 mg/L vancomicina (Sigma Aldritch Chemie, St Louis, MO, EUA), 20 mg/L ácido nalidíxico (Sigma Aldritch Chemie), 10 mg/L anfotericina B (Sigma Aldritch Chemie), 40 mg/L TTC (Sigma Aldritch Chemie) e incubadas em condições de microaerofilia por 3-5 dias, como previamente descrito^{(37, 44)}.

Análises moleculares

A partir da cultura bacteriana, o DNA genômico dos isolados clínicos foram extraídos usando o protocolo de fenol-clorofórmio, adaptado por FOX et al.⁽²⁰⁾. A PCR⁽⁴⁹⁾ foi realizada com 25 µl de volume final, contendo 100 ng de DNA genômico, 50 pmol de cada iniciador, 1.0 mmol/L de cada dNTPs (Invitrogen^TM Life Technologies, Alemeda, CA, EUA), 1,5% de MgCl₂, 2,5 unidades de enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen^TM Life Technologies) e tampão de reação para a enzima. A identificação da bactéria foi confirmada através amplificação do gene que codificou o RNA r16S e glmM usando iniciadores específicos para cada um dos genes^{(6, 29)}. O gene cagA foi analisado através dos iniciadores D008 e R008⁽¹¹⁾ . Para a amplificação da região m do gene vacA foram usados os iniciadores VA3-R e VA3-F para amplificar o tipo m1 e VA4-R e VA4-F para o tipo m2 e para a região s os iniciadores usados foram VA1-R e VA2- F⁽⁵⁴⁾. As impressões digitais de DNA genômicas dos isolados clínicos estudados foram obtidas através da técnica de RAPD-PCR. A reação foi feita com 25 µl de volume final contendo 2,5 µl de DNA genômico, 20 rmol de iniciador, 200 µM de cada dNTP, 1,5% de MgCl₂, 2,5 unidades de enzima Taq DNA polimerase e tampão de reação para a enzima. A reação foi realizada em triplicata para garantir a reprodutibilidade do método. Três iniciadores universais, considerados altamente discriminativos (1281, D11344 e D9355)⁽¹⁾ foram usados para obtenção dos diferentes padrões de bandas. Os produtos amplificados foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose 2%.

Análise dos dados

A possível associação entre os genes vacA e cagA do H. pylori com as diferentes doenças foi analisada por meio do teste Qui-quadrado (c²) com correção de Yates e Exato de Fisher com o auxilio do "software" Biostat 2,0. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes para P <0,05. A possível associação entre o padrão de bandas oriundas do RAPD da bactéria com os fatores de virulência e as doenças foi analisada com o auxilio do "software" GelCompair 4.1 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica).

RESULTADOS

Apenas amostras de pacientes com monoinfecção pelo H. pylori foram incluídas neste estudo. Deste modo, 17 amostras com genótipo múltiplo foram excluídos das análises, restando 95 isolados clínicos (33 de pacientes com gastrite, 12 com esofagite, 17 com úlcera gástrica e 33 com úlcera duodenal).

A genotipagem para vacA foi determinada por PCR, o alelo s1 foi identificado em amostras obtidas de 58 pacientes (61%) enquanto que isolados clínicos de 37 pacientes apresentaram o alelo s2 (39%). Para o polimorfismo da região mediana do gene, em 26 (27%) foi possível detectar o alelo m1, e o m2 foi identificado em amostras obtidas de 69 pacientes (73%). Para a associação em mosaico dos alelos s e m, obtiveram-se taxas de 27% (26/95), 34%(32/95) e 39% (37/95) para os genótipos s1m1, s1m2 e s2m2, respectivamente (Tabela 1).

Comparando-se as diferentes manifestações clínicas (gastrite, esofagite, úlcera gástrica e úlcera duodenal) com os genótipos de vacA através do teste c², observou-se associação significativa entre úlcera duodenal (UD) e o mosaico alélico vacA s1m1 (c² =10,41; P = 0,005; OR = 4,1; 95% CI = 1,57 < µ <10,6), devido a maior freqüência do alelo s1 (c² = 10,16; P = 0,003; OR = 12,14; 95% CI = 3,35 < µ <44,02). Por outro lado, foi detectada também uma associação entre o alelo s2 e a esofagite (c² = 5,65; P = 0,038; OR= 5,89; 95% CI = 1,47 < µ <23,5).

Em relação ao gene cagA foi possível detectar a presença deste gene em 68% (65/95) das amostras. Quando se compara a presença desse gene com as doenças estudadas, não foi observada associação significativa. Porém o genótipo cagA + vacA s1m1 foi mais freqüentemente observado em pacientes com UD (c² = 11,95; P = 0,0354; OR = 5; 95% CI = 1,87 < µ <13,37).

Para a obtenção das impressões digitais de DNA genômicas das linhagens estudadas foi utilizado o RAPD-PCR, e com a ajuda do software GelCompair 4.1. Foram realizados três ensaios em dias alternados, mostrando que os padrões de banda se mantiveram iguais, sendo, assim, considerados estáveis. Sete diferentes dendogramas foram construídos através da comparação do padrão de bandas. Cada dendograma gerou dois agrupamentos distintos e totalmente heterogêneos.

Ao comparar as doenças desenvolvidas pelos pacientes e a genotipagem de cagA e vacA dos isolados clínicos com o agrupamento dos dendogramas, não foi possível detectar associação significativa entre os grupamentos de nenhum dos sete dendogramas construídos.

DISCUSSÃO

Algumas características das amostras de H. pylori parecem estar associadas à evolução da infecção para uma doença mais grave. Entre elas, alguns genótipos, como alelos s1 e m1 de vacA e presença de cagA, têm sido considerados marcadores de patogenicidade por estarem associados à produção e excreção de citotoxina, à indução de lesão epitelial e à resposta inflamatória, mais intensas^{(5, 12, 13, 23, 27, 40, 42, 52, 53, 55)}.

A distribuição geográfica dos alelos do vacA não é uniforme⁽⁵⁶⁾. A freqüência do alelo vacA s1 observada neste estudo foi de 61%, sendo condizente com os dados encontrados por esta mesma equipe em outros estudos e também com as descritas na França, Itália, Canadá e Estados Unidos e inferior à encontrada em países como Japão, México e África do Sul^{(26, 38, 46, 56, 58, 59)}. Por outro lado, estudos demonstraram que a distribuição dos alelos m é mais homogênea e, de maneira geral, metade das amostras é m1 e a outra metade é m2⁽⁵⁶⁾. No entanto, no presente estudo a freqüência do alelo vacA m2 (73%) foi superior às do tipo m1 (27%), como também foi observado em estudos anteriores^{(26, 46)}.

Estudos realizados anteriormente sugerem que o alelo m1 do gene vacA é responsável por promover alterações histológicas devido a sua associação com a degeneração epitelial, redução do muco e erosões microscópicas, contrastando com o observado no alelo m2. Além disso, os alelos s1m1 associados à presença de cagA aumentariam a inflamação tecidual e a migração neutrofílica⁽³⁹⁾. Estudos realizados na década de 90 sugerem que o genótipo s1m1 possa ser usado como marcador de amostras mais virulentas, em conformidade com o fato de que o alelo s1 está relacionado à produção de maior quantidade da citotoxina vacuolizante e que o alelo m1 está associado com produção de maior quantidade da toxina⁽⁴⁾. Neste estudo, foi observada associação entre genótipo s1m1 dos isolados e presença de úlcera duodenal, confirmando resultados descritos para amostras brasileiras e também de outras regiões mundiais^{(2, 4, 16, 17, 26, 27, 36, 46, 48, 55, 59)}.

A esofagite de refluxo é uma doença caracterizada por exposição anormal da mucosa ao conteúdo ácido do estômago. Recentemente, alguns trabalhos mostram que a infecção pelo H. pylori poderia ter um efeito protetor contra a doença^{(17, 18, 33, 45, 57)}. De modo complementar, mostrou-se que pacientes infectados por linhagens mais virulentas (cagA+, vacAs1) estariam inversamente associados com o desenvolvimento da doença. Deste modo, pacientes infectado por tais linhagens seriam protegidos contra complicações decorrentes do refluxo ácido^{(17, 33, 45, 57)}. Algumas hipóteses têm sido propostas para explicar tal fenômeno. Por um lado, postula-se que este efeito deva-se à redução da secreção ácida gerada pela infecção por linhagens mais virulentas^{(51, 57)}, por outro acredita-se que, além dos fatores de virulência da bactéria, alguns fatores genéticos do hospedeiro devem contribuir nesta proteção⁽⁴⁵⁾. Na presente série, detectou-se uma associação entre a presença de linhagens menos virulentas com esta doença ao se comparar o genótipo s2 do gene vacA da bactéria com o desenvolvimento de esofagite de refluxo, assim como observado por outros autores^{(18, 32, 44, 57)}.

De forma semelhante ao que se observa para o vacA, a freqüência de amostras cagA positivas são heterogêneas, variando de uma região geográfica para outra. Em grande parte dos países da Europa ocidental e nos Estados Unidos, a freqüência de amostras cagA positivas varia entre 59% e 75%^{(55, 60)}, na Itália e em Portugal, as taxas são superiores a 80%⁽⁵⁵⁾ e, no México, praticamente 100% dos indivíduos apresentam-se colonizados por amostras que carreiam o gene⁽³⁸⁾. No presente estudo, amostras cagA positivas foram identificadas em 68% dos isolados, freqüência similar à observada em diversos países ocidentais e em várias regiões do Brasil, com exceção de Marília, cidade do interior do Estado de São Paulo, onde a taxa de amostras cagA positivas foi de apenas 48%^{(3, 16, 21, 26, 36, 46)}.

O genótipo cagA+ vacA s1m1 foi mais freqüentemente observado em pacientes com úlcera duodenal de acordo com o reportado por outros autores brasileiros^{(3, 16, 21, 26, 36, 46)}. Essa relação entre os genótipos ainda é pouco conhecida. Embora vários estudos tenham demonstrado a existência de uma relação entre cagA e vacA, a razão pela qual esses dois elementos genéticos estão fortemente associados não é clara mesmo porque eles não apresentam nenhuma ligação física no cromossomo do H. pylori⁽⁹⁾. Essa associação pode ser epidemiológica e/ou evolutiva; é possível, ainda, que tais associações tenham uma base funcional ainda não explicada.

O perfil genético (impressão digital de DNA) dos 95 isolados clínicos estudados foi analisado através da técnica de RAPD-PCR. Essa técnica tem sido usada para discriminar amostras de H. pylori associadas a diferentes doenças e com a resistência bacteriana aos antimicrobianos usados na terapia de erradicação. O RAPD tem capacidade discriminatória razoável e é eficaz para a genotipagem do H. pylori em larga escala, mas a estabilidade desse método deve ser levada em consideração, pois a reprodutibilidade interlaboratorial é muito baixa. BURUCOA et al.⁽¹⁰⁾, KUIPERS et al.³¹ e KIDD et al.⁽³⁰⁾ sugeriram que a técnica RAPD pode ser estável e reprodutível desde que esteja altamente padronizada, incluindo métodos criteriosos de preparo do DNA, o uso constante de polimerase termoestável, os volumes e concentrações dos reagentes que nunca devem variar e o procedimento adequado e padronizado do termociclador e do método de visualização das bandas. Neste estudo todas as reações de RAPD foram repetidas por 3 vezes em tempos diferentes e por operadores distintos para a garantia da reprodutibilidade.

Os resultados de RAPD observados neste estudo mostraram que os agrupamentos dos sete dendogramas construídos foram totalmente heterogêneos. A análise dos padrões de bandas obtidos foi incapaz de identificar associação entre agrupamento e potencial das doenças, estando de acordo com o observado por KIDD et al.⁽³⁰⁾. Outro estudo realizado nos Estados Unidos obteve resultados distintos onde, isolados clínicos provenientes de pacientes com UD foram agrupados⁽²⁴⁾.

Não houve associação significativa entre os fatores de virulência e a segregação dos dois agrupamentos de cada dendograma. Diferentemente do observado por outro estudo, que sugere haver associação entre RAPD das impressões digitais de DNA e as variações de vacA e a presença de cag PAI, porém esse mesmo estudo falhou em associar a segregação dos agrupamentos com o genótipo de iceA e da região m do gene vacA⁽³⁰⁾.

Os resultados desta casuística sugerem que RAPD das impressões digitais de DNA realizados com os iniciadores 1281, D1134 e D955 não deveriam ser usados como ferramenta para o estudo da virulência do H. pylori, sendo incapaz de associar o padrão de bandas com as doenças e os genótipos de vacA e cagA, que tiveram distribuição similar em ambos os agrupamentos dos dendogramas. Estes resultados também reforçam a importância do gene vacA como um marcador de virulência do H. pylori. A busca por novos marcadores é importante para o melhor entendimento da patogenicidade causada pela presença do H. pylori.

Recebido em 21/12/2005

Aprovado em 5/10/2006.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Out 2007
• Data do Fascículo
  Jun 2007

Histórico

• Aceito
  05 Out 2006
• Recebido
  21 Dez 2005