A RIFAMPICINA NA DESCONTAMINAÇÃO BACTERIANA DE EXPLANTES DE MAMOEIRO PROVENIENTES DO CAMPO

NOTA

A RIFAMPICINA NA DESCONTAMINAÇÃO BACTERIANA DE EXPLANTES DE MAMOEIRO PROVENIENTES DO CAMPO(¹)

GIOVANNI RODRIGUES VIANNA(²), FLÁVIO A. A. COUTO(³), ALUÍZIO B. DE OLIVEIRA(²), LAÉRCIO ZAMBOLIM(²) e JOSÉ MARIA(²)

RESUMO

Observou-se alta contaminação bacteriana nos explantes de mamoeiro introduzidos in vitro, a partir de plantas matrizes desenvolvidas no campo, independentemente da época do ano em que se realizaram as coletas. O uso de desinfestantes superficiais, como álcool e hipoclorito de sódio, garantiram níveis aceitáveis de controle apenas para fungos, não para bactérias. A rifampicina, por tratamento de imersão ou introdução em meio de cultura, controlou satisfatoriamente as contaminações de caráter endofítico, obtendo-se 70% de explantes sadios, sem sinais de fitotoxicidade.

Termos de indexação: rifampicina, mamoeiro, Carica papaya L., cultura de tecidos, desinfecção bacteriana.

ABSTRACT

USE OF RIFAMPICIN ON BACTERIAL DESCONTAMINATION OF PAPAYA FIELD-GROWN TISSUE CUTTINGS FOR IN VITRO CULTURE

High contamination by bacteria was observed in papaya tissue cuttings introduced in vitro from plants grown in the field, independent of the period of the year that samples were collected. The use of alcohol and sodium hypoclorite did not guarantee good bacteria control. Rifampicin, added as an immersion solution treatment or in the culture media, controlled the internal contamination of explants, without damaging the cuttings. Up to 70% of healthy tissue explants were obtained by the use of rifampicin.

Index terms: rifampicin, Carica papaya L., tissue culture, bacterial descontamination.

Entre as formas de propagação do mamoeiro (Carica papaya L.), a mais utilizada é aquela por sementes (Drew, 1987). A estaquia e a enxertia não são métodos eficientes para sua propagação em larga escala (Litz, 1984; Winnaar, 1988). Entretanto, nos mamoeirais formados por sementes, em vista de se tratar de uma espécie de fecundação cruzada, observa-se segregação nas progênies obtidas.

Dessa forma, o desenvolvimento de protocolos de micropropagação, pela técnica de cultura de tecidos, é de grande importância, pois constitui um recurso útil na formação rápida de clones com características superiores.

As plantas doadoras de explantes para a micropropagação são obtidas em condições controladas de casa de vegetação ou laboratório e, embora mostrem segregação e tenham sexo indefinido, apresentam menor contaminação fúngica e bacteriana e presença de ácaros, do que as cultivadas no campo. Segundo Litz & Conover (1977, 1978), 95% dos explantes provenientes de plantas do campo, introduzidos in vitro, revelaram contaminação microbiana, mesmo após a descontaminação. Isso mostra a importância de estabelecer protocolos visando determinar o tipo, a concentração e o tempo adequados do tratamento descontaminante ou do grupo de descontaminantes.

O antibiótico rifampicina tem sido considerado eficiente para controlar ou suprimir contaminação endofítica em cultura de tecidos de várias espécies de plantas (Phillips et al., 1981; Pollock et al., 1983; Young et al., 1984; Haldeman et al., 1987). Segundo Phillips et al. (1981), apenas a rifampicina, entre seis antibióticos analisados, controlou a contaminação bacteriana sem alterar a taxa de divisão celular vegetal, em explantes de Helianthus tuberosus.

A rifampicina, um antibiótico do grupo das rifamidas, é indicada para controlar bactérias gram-positivas (Pollock et al., 1983) e gram-negativas (Young et al., 1984, Haldeman et al., 1987).

Tendo em vista tais problemas, objetivou-se, neste trabalho, verificar sua eficiência no controle de contaminação bacteriana em explantes provenientes de plantas de mamoeiro selecionadas diretamente no campo de produção.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se plantas de mamoeiro do cv. Formosa, em fase de produção comercial, mantidas nos campos experimentais da Universidade Federal de Viçosa (MG).

As plantas foram recepadas a 1 m do solo, para induzir a formação de brotações laterais, pela quebra da dominância apical. Os ramos desenvolvidos foram também recepados quando estavam com cerca de 20 cm e os ápices caulinares, surgidos após a segunda poda de rejuvenescimento, foram usados como explantes, sendo retirados com cerca de 1,5 cm e reduzidos, após a descontaminação em condições assépticas, para 0,5 cm.

Para estabelecimento de um método eficaz de descontaminação, efetuaram-se, em diferentes épocas, dez introduções de explantes in vitro, como testes preliminares, onde eles foram submetidos a diferentes tratamentos, de agosto de 1994 a janeiro de 1995, representados pela letra inicial do mês do ano da sua realização.

Antes de iniciar os tratamentos, os explantes foram enxaguados em água corrente, imersos em solução de Tween 20 (uma gota/100 mL de solução), por três minutos, lavados seis vezes em água deionizada autoclavada e, em seguida, imersos em solução de álcool 70% por um minuto.

Na primeira época (agosto - A₁), os explantes foram tratados, por dez minutos, apenas com hipoclorito de sódio 1% como substância desconta-minante. Na época A₂, utilizou-se hipoclorito de sódio 1% por vinte minutos e imersão dos explantes em solução de antibiótico microfiltrada (Power & Chapman, 1985): ampicilina (400 mg/L), tetraciclina (10 mg/L) e gentamicina (10 mg/L). Na época S (setembro), empregou-se também apenas hipoclorito de sódio 1% por vinte minutos. Na época O₁ (outubro), os explantes permaneceram 24 horas em imersão com agitação a 80 rpm, em solução com 50 mg/L de rifampicina, e receberam também 50 mg/L de rifampicina microfiltrada em meio de cultura, após serem submetidos a hipoclorito de sódio 1% por um minuto. Na época O₂, os explantes receberam o mesmo tratamento que em O₁, mas o tempo de exposição ao hipoclorito de sódio foi de quinze minutos.

Na época N (novembro), os explantes foram submetidos à imersão por 24 horas em solução de rifampicina a 300 mg/L. Aqueles descontaminados na época N₁ tiveram também 50 mg/L de rifampicina em meio de cultura, enquanto os da N₂ não receberam. Na época D (dezembro), os explantes tiveram o mesmo tratamento que em A₁ e S, e, nas épocas J₁ e J₂ (janeiro), foram submetidos ao mesmo tratamento da N₂.

No experimento definitivo de descontami-nação, os explantes foram submetidos, em grupo, a cinco diferentes tratamentos (Quadro 1).

A rifampicina foi microfiltrada em filtro "Milipore" de 0,22 mm e acrescentada após a autoclavagem a 50 mg/L, quando utilizada em meio de cultura (I e II). Os explantes dos tratamentos I e III foram imersos por 24 horas, sob agitação de 80 rpm, em solução com 300 mg/L de rifampicina microfiltrada.

Os explantes dos tratamentos I, II, III e IV foram imersos em solução que continha o fungicida benomyl (Benlate 500 - 3 g/L) e o acaricida abamectin (Vertimec 18 CE - 0,3 mL/L), por quinze minutos, com agitação a 80 rpm e, em seguida, em uma solução de álcool 70% por, no máximo, um minuto. Os explantes do tratamento V serviram como controle e receberam descontaminação de rotina, empregando-se hipoclorito de sódio e solução de abamectin como substâncias descontaminantes. Os explantes de todos os tratamentos passaram por uma solução de hipoclorito de sódio a 1%, por quinze minutos, com agitação.

Todo o processo, a partir da imersão em solução de Tween 20, foi realizado em câmara de fluxo contínuo de ar estéril.

Após a descontaminação, prepararam-se os explantes, cortando-se todos os pecíolos em sua base, e inoculando-os, individualmente, em tubos de ensaio contendo 20 mL do meio MS (Murashige & Skoog, 1962), e mantendo-os sob intensidade luminosa de 9,2 mmol/m^-2 s^-1 com 16 horas de luz, à temperatura média de 27ºC.

O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado, com vinte repetições, sendo os dados coletados em porcentagem, transformados para arco seno (), visando à análise da variância. Compararam-se as médias dos tratamentos pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, sendo as avaliações diárias até o 36^o dia de cultura, quando ocorreu o primeiro subcultivo e, posteriormente, a cada subcultivo mensal, observando o aparecimento ou não de contaminações.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na figura 1, encontra-se a evolução do método de descontaminação de explantes provenientes de mamoeiro adulto do campo, para introdução in vitro, desde o início de agosto de 1994, quando se obteve 100% de contaminação fúngica e bacteriana, até meados de janeiro de 1995, quando houve 69% de explantes sadios. Nesse período, realizaram-se dez introduções de explantes seqüenciadas pelas letras A até J.

Figura 1.
Evolução dos tratamentos de descontaminação, para explantes de mamoeiro adulto, oriundos do campo, em diferentes épocas do ano (A: agosto; J: janeiro).

Na primeira introdução (A₁), usando-se como descontaminante apenas hipoclorito de sódio 1% por dez minutos, foi impossível conseguir explantes que não apresentassem sinais visíveis de contaminação, principalmente por bactéria. Resultados semelhantes foram obtidos na época S, em que se utilizou hipoclorito de sódio 1% por vinte minutos, e na D, quando se banharam os explantes em água deionizada autoclavada por 24 horas com agitação a 80 rpm e imersão em hipoclorito de sódio 1% por quinze minutos, também com agitação.

Descontaminantes à base de hipoclorito de sódio na assepsia de explantes de mamoeiro, com variação no binômio tempo-concentração, foram utilizados por diferentes autores. Drew & Smith (1986), Drew (1987), Carrer (1988), Winnaar (1988) e Schmildt (1994) utilizaram hipoclorito de sódio 1% com tempo variando de dez a vinte minutos, para descontaminar explantes provenientes de plântulas, e Litz & Conover (1977, 1978) e Litz (1984), para explantes de plantas adultas. Os autores não discutiram, em termos quantitativos, o efeito dos tratamentos, nem revelaram as condições ambientais em que foram mantidas as plantas matrizes. Litz & Conover (1977, 1978) observaram, respectivamente, 80 e 95% de contaminação. Winnaar (1988), 4 a 29% de contaminação, dependendo da estação do ano em que se retiravam os explantes, resultado considerado satisfatório pelo próprio autor, enquanto Schmildt (1994) encontrou apenas 7,5 e 10% de contaminação microbiana, respectivamente, para os cultivares Solo e Formosa, taxa bastante baixa, mesmo considerando que as plântulas eram mantidas em casa de vegetação.

Álcool e hipoclorito de sódio promovem a descontaminação na superfície dos explantes, mas não controlam a contaminação endofítica (Reuveni et al., 1990).

Esta deve ter sido a causa da contaminação apresentada nas épocas A₁, S e D deste trabalho (Figura 1). Os resultados começaram a se tornar expressivos em agosto, época A₂ (Figura 1), quando se utilizou, pela primeira vez, antibiótico na descontaminação. Antes de serem inoculados em meio de cultura, os explantes ficaram imersos em solução contendo ampicilina (400 mg/L), tetraciclina (10 mg/L) e gentamicina (10 mg/L) (Power & Chapman, 1985). Isso permitiu que 23% do material introduzido in vitro permanecesse sem contaminação aparente; entretanto, reduziu significativamente a viabilidade dos explantes.

Na época O₁ (Figura 1), os explantes permaneceram 24 horas em imersão com agitação a 80 rpm, em solução com 50 mg/L de rifampicina, recebendo também 50 mg/L de rifampicina microfiltrada em meio de cultura. A baixa taxa de material sadio (6%) deveu-se, provavelmente, ao curto tempo de exposição em hipoclorito de sódio 1%, um minuto, dando-se a contaminação mais por ataque de fungo que de bactéria. Com o mesmo método, porém aumentando o tempo de exposição em hipoclorito de sódio 1% para quinze minutos, pôde-se elevar a taxa de material aparentemente sadio para 38% (época O₂ - Figura 1).

Na época N, a concentração de rifampicina no banho foi aumentada de 50 para 300 mg/L, conforme sugerido por Reuveni et al. (1990). Os explantes descontaminados na N₁ receberam 50 mg/L de rifampicina no meio de cultura, enquanto os da época N₂ não receberam. Nesses casos, a taxa de aproveitamento de material foi, respectivamente, de 63 e 60%, evidenciando ser desnecessário acrescentar o antibió-tico em meio de cultura.

Em dezembro, com altas temperaturas e umidade também elevada, apresentando as plantas desenvolvimento vigoroso, introduziu-se material com o mesmo método das épocas A₁ e S (Figura 1), sem uso de antibióticos: ocorreu 100% de contaminação (época D - Figura 1). Segundo Litz & Conover (1977, 1978), a contaminação fúngica e bacteriana foi um sério problema durante o inverno, principalmente em explantes de mamoeiro que não receberam fertilização suficiente. As colônias bacterianas isoladas e estudadas eram não patogênicas, com flutuação periódica em sua taxa de contaminação, relacionada com a taxa de crescimento da planta. O pico máximo de contaminação ocorreu durante os meses secos do inverno, quando as plantas no campo crescem mais lentamente. As contaminações bacterianas mais comumente encontradas foram as causadas por espécies de Pseudomonas, as quais, segundo os autores acima, não têm nenhum efeito aparente sobre o vigor das culturas.

Em janeiro de 1995 (épocas J₁ e J₂), de novo, colocou-se em teste a eficácia do processo usando o antibiótico rifampicina, aproveitando-se, respectivamente, 53 e 69% dos explantes introduzidos.

No experimento definitivo, naqueles tratamentos contendo rifampicina, houve satisfatório controle das bactérias dos explantes de mamoeiro, proporcionando 70 a 75% de explantes sadios. As contaminações bacterianas surgiram a partir do 3^° dia, prolongando-se até o 12^o. Não houve diferença significativa entre os tratamentos I, II e III, mostrando que 24 horas foram suficientes para que ocorresse o efluxo das bactérias presentes no sistema vascular do explante e para translocação e ação do antibiótico nos tecidos internos (Figura 2). Assim, o uso do antibiótico sob imersão mostrou-se a melhor opção para descon-taminar os explantes oriundos do campo.

* Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Figura 2. Porcentagem de explantes sadios dos tratamentos de descontaminação, a partir de mamoeiro cv. Formosa: I. Imersão em rifampicina (300 mg/L) + rifampicina (50 mg/L) no meio de cultura; II. Imersão em água deionizada autoclavada + rifampicina (50 mg/L) em meio de cultura; III. Imersão em rifampicina (300 mg/L); IV. Imersão em água deionizada autoclavada, e V. Controle.

Tais resultados são semelhantes aos obtidos por Reuveni et al. (1990), que utilizaram rifampicina, nas mesmas condições deste trabalho. Empregando, como controle, explantes não tratados e não contaminados, observaram que esses haviam crescido mais lentamente que aqueles tratados com o antibiótico, concluindo que, além de reduzir o nível de contaminação, a rifampicina não prejudica o desenvolvimento do explante, não sendo fitotóxica para aqueles de mamoeiro (Reuveni et al., 1990) e Camellia (Haldeman et al., 1987), a exemplo do que ocorreu no presente trabalho.

Segundo Phillips et al. (1981) e Grattapaglia & Machado (1990), os antibióticos geralmente usados em cultura de tecidos vegetais possuem ação bacteriostática e não bactericida. No entanto, nesta pesquisa, os explantes descontaminados com rifampicina puderam ser subcultivados por sete meses no laboratório, sem sinais de contaminação bacteriana. Reuveni et al. (1990) mantiveram explantes sadios de mamoeiro por, pelo menos, dez subcultivos, cerca de um ano, após descontaminá-los com rifampicina.

Esta, independentemente da forma de seu emprego, por tratamento dos explantes em imersão ou introduzida em meio de cultura, controlou satisfatoriamente as contaminações bacterianas de caráter endofítico, sem apresentar sinais de fitotoxicidade aos explantes de mamoeiro sob as condições presentes.

Foi observada pequena contaminação fúngica, em tubos já contaminados por bactéria, não sendo verificado o aparecimento de ácaros. O benomyl foi dispensável, visto que o tratamento V não recebeu fungicida, porém não apresentou considerável contaminação fúngica.

⁽²) CENARGEN/EMBRAPA, Caixa Postal 02372, 70770-900 Brasília (DF).

⁽³) Departamento de Fitotecnia de Viçosa, 35670-000 Viçosa (MG).

• CARRER, H. Controle da morfogęnese em mamăo (Carica papaya L.) "in vitro" Piracicaba, 1988. 138p. Tese (Mestrado) - ESALQ, 1988.
• DREW, R. A. The effects of medium composition and cultural conditions on in vitro root initiation and growth of papaya (Carica papaya L.). Journal of Horticultural Science, Ashford, 62: 551-556, 1987.
• DREW, R. A . & SMITH, N. G. Growth of apical and lateral buds of papaya (Carica papaya L.) as affected by nutritional and hormonal factors. Journal of Horticultural Science, Ashford, 61: 535-543, 1986.
• GRATTAPAGLIA, D. & MACHADO, M. A. Micropropagaçăo. In: TORRES, A. C. & CALDAS, L. S., eds. Técnicas e aplicaçőes da cultura de tecidos de plantas. Brasília, ABCTP, EMBRAPA-CNPH, 1990. p.99-169.
• HALDEMAN, J. H. ; THOMAS, R. L. & McKAMY, D. L. Use of benomyl and rifampicin for in vitro shoot tip culture of Camellia sinensis and C. japonica HortScience, Alexandria, 22:306-307, 1987.
• LITZ, R. E. Papaya. In: SHARP, D. A.; EVANS, D. A.; AMMIRATO, P. V. & YAMADA, Y., eds. Handbook of plant cell culture New York, MacMillan, 1984. p. 349-368.
• LITZ, R. E. & CONOVER, R. Tissue culture propagation of papaya. Proceedings of the Florida State Horticultural, Winter Haven, 90:245-246, 1977.
• LITZ, R. E. & CONOVER, R. In vitro propagation of papaya. HortScience, Alexandria, 13:241-242, 1978.
• MURASHIGE, T. & SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, 15: 473-497,1962.
• PHILLIPS, R.; ARNOTT, S. M. & KAPLAN, S. E. Antibiotics in plant tissue culture: rifampicin effectively controls bacterial contaminants without affecting the growth of short-term explant cultures of Helianthus tuberosus Plant Science Letters, Limerick, 21: 235-240, 1981.
• POLLOCK, K.; BARFIELD, D. G. & SHIELDS, R. The toxicity of antibiotics to plant cell cultures. Plant Cell Reports, Heidelberg, 2:36-39, 1983.
• POWER, J. B. & CHAPMAN, J. V. Isolation and genetic manipulation of plant protoplasts. In: DIXON, R. A., ed. Plant cell culture a practical approach Oxford, IRL Press, 1985. p.37-66.
• REUVENI, O.; SHLESINGER, D. R. & LAVI, U. In vitro clonal propagation of dioecious Carica papaya Plant Cell Tissue and Organ Culture, Dordrecht, 20:41-46, 1990.
• SCHMILDT, E. R. Enraizamento in vitro e ex vitro de ramos de mamoeiro (Carica papaya L.). Viçosa, UFV, 1994. 76p. Tese (Mestrado) - Universidade Federal de Viçosa (UFV), 1994.
• WINNAAR, W. Clonal propagation of papaya in vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Dordrecht, 12:305-310, 1988.
• YOUNG, P. M.; HUTCHINS, A. S. & CANFIELD, M. L. Use of antibiotics to control bacteria in shoot cultures of woody plants. Plant Science Letters, Limerick, 34:203-209, 1984.

⁽¹

) Parte da Tese de Mestrado apresentada pelo primeiro autor à Universidade Federal de Viçosa. Recebido para publicação em 6 de maio e aceito em 3 de setembro de 1997.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jun 1999
• Data do Fascículo
  1997

Histórico

• Recebido
  06 Maio 1997
• Aceito
  03 Set 1997