Aspectos microscópicos da interação feijoeiro-Colletotrichum lindemuthianum mediados pelo silício

Microscopic aspects of the interaction bean-Colletotrichum lindemuthianum mediated by silicon

Aspectos microscópicos da interação feijoeiro-Colletotrichum lindemuthianum mediados pelo silício

Microscopic aspects of the interaction bean-Colletotrichum lindemuthianum mediated by silicon

Maria Fernanda Antunes Cruz; Leonardo Araujo; Leonora Rodriguez Polanco; Fabrício de Ávila Rodrigues^*

Universidade Federal de Viçosa (UFV), Departamento de Fitopatologia, Avenida Peter Henry Rolfs, s/n, 36570-900 Viçosa (MG), Brasil

RESUMO

A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum, é uma das doenças mais destrutivas que afetam a cultura do feijoeiro. Com o objetivo de encontrar alternativas para o controle dessa doença, o presente trabalho investigou, em nível microscópico, o efeito do silício (Si) na resistência do feijoeiro à infecção por C. lindemuthianum. Plantas de feijoeiro (cv. Pérola) foram cultivadas em solução nutritiva contendo 0 (-Si) ou 2 mM (+Si) de Si e inoculadas no estádio de crescimento V4 com uma suspensão de conídios de C. lindemuthianum. A severidade da antracnose decresceu cerca de 52% nas folhas das plantas supridas com Si (4,4%) em relação às folhas das plantas não supridas (8,5%). Observações de folhas de feijoeiro das plantas não supridas com Si no microscópio eletrônico de varredura revelaram alterações morfológicas nas nervuras em contraste com as folhas de plantas supridas com Si. Utilizando-se a microanálise de raios-X, verificou-se maior concentração dos minerais enxofre, potássio e Si nas folhas das plantas supridas com Si. Em conclusão, o suprimento de Si em plantas de feijoeiro foi importante para reduzir os sintomas da antracnose.

Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum, Phaseolus vulgaris L., microscopia eletronica de varredura, microanálise de raios-X, nutrição mineral.

ABSTRACT

The anthracnose, caused by the fungus Colletotrichum lindemuthianum, is one of the most destructive diseases affecting bean crop. With the objective to find alternative to the control this disease, this study investigated, at the microscopic level, the effect of silicon (Si) on bean resistance to infection by C. lindemuthianum. Bean plants (cv. 'Pérola') were grown in nutrient solution containing 0 (-Si) or 2 mM (+ Si) of Si and inoculated in the V4 growth stage with a suspension of conidia of C. lindemuthianum. The disease severity decreased by 52% in the leaves of plants supplied with Si (4.4%) in relation to the leaves of non supplied plants (8.5%). Observations of bean leaves of plants not supplied with Si by scanning electron microscopy revealed morphological changes in the veins in contrast with the leaves of plants supplied with Si. By using the X-ray microanalysis, it was found higher concentrations of the minerals sulfur, potassium and Si in the leaves of plants supplied with Si. In conclusion, the supply of Si in bean plants was important to reduce the symptoms of anthracnose.

Key words: Colletotrichum lindemuthianum, Phaseolus vulgaris L., scanning electron microscopy, X-ray microanalysis, mineral nutrition.

1. INTRODUÇÃO

A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Scrib., é uma das doenças mais destrutivas que afetam a cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) em regiões tropicais e subtropicais da América Latina e África Central e Oriental (Pastor-Corrales, 1985). Em tais áreas, perdas na produção podem atingir 100% quando são utilizadas sementes infectadas com o patógeno ou cultivares suscetíveis sob condições ambientais favoráveis ao progresso das epidemias dessa doença (Peloso, 1992).

O fungo C. lindemuthianum é capaz de infectar folhas, caule, ramos, vagens e sementes de plantas de feijoeiro em todos os estágios de desenvolvimento (Hall, 1991). Plantas jovens geralmente são mais suscetíveis à infecção pelo patógeno do que as plantas adultas por possuírem tecidos menos lignificados (Hall, 1991). Nas plântulas, os sintomas da antracnose são lesões escuras nos cotilédones e no hipocótilo (Hall, 1991). Em plantas adultas, as lesões ocorrem com maior frequência nos pecíolos e nas nervuras (Hall, 1991). Tais regiões apresentam manchas de coloração marrom-escuro ou pardas que atingem inicialmente as nervuras principais, chegando às secundárias à medida que a doença progride (Hall, 1991). Nas vagens, as lesões são arredondadas, deprimidas, de tamanho variável e com o centro claro, sendo delimitadas por um anel negro, saliente, com borda marrom-avermelhada (Hall, 1991). Quando as condições de umidade e temperatura são favoráveis, uma massa de conídios de coloração rosada é formada no centro das lesões (Pria et al., 1999).

O uso de cultivares resistentes é considerado a opção mais viável para o controle da antracnose (Singh et al., 1992; Vidigal et al., 2007; Vieira, 1988). No entanto, a existência de várias raças fisiológicas do patógeno representa um obstáculo para a obtenção de novas cultivares de feijoeiro resistentes à antracnose (Rava et al., 1993). A aplicação de fungicidas também é uma medida de controle bastante utilizada pelos agricultores, mesmo levando em consideração o impacto negativo ao ambiente e a possibilidade do fungo desenvolver resistência aos defensivos agrícolas devido à alta variabilidade genética do C. lindemuthianum (Rava et al., 1993; Vidigal et al., 2007). Diante dessas preocupações, faz-se necessário encontrar métodos alternativos de controle da antracnose para diminuir as perdas ocasionadas por essa doença na cultura do feijoeiro. O silício (Si), apesar de não ser considerado um nutriente essencial às plantas, destaca-se por reduzir a intensidade de doenças importantes em várias culturas, principalmente gramíneas e algumas dicotiledôneas como café, pepino e soja (Cruz et al., 2012; 2013; Datnoff et al., 2007; Domiciano et al., 2013; Rodrigues et al., 2003; 2005; Sousa et al., 2013). Na interação arroz-Pyricularia grisea, o aumento na resistência das plantas pela aplicação de Si foi associado com um aumento na densidade de células silicatadas na epiderme foliar ou à formação de uma espessa camada de sílica abaixo da cutícula, formando uma barreira física que impediu ou atrasou a penetração do fungo (Kim et al., 2004). Dentre os mecanismos fisiológicos e/ou bioquímicos potencializados pelo Si, tem-se constatado um aumento na concentração de compostos fenólicos e fitoalexinas e maior atividade de enzimas de defesa como quitinases e β;-1,3-glucanases e a rápida e intensa transcrição de genes associados com a resistência da planta (Liang et al., 2006; Rodrigues et al., 2003; 2005).

Plantas supridas com Si, e infectadas por diferentes patógenos geralmente respondem de forma mais rápida e intensa à infecção através do acúmulo de compostos fenólicos (Chérif et al., 1992; Menzies et al., 1992). Ao contrário da barreira física formada por células silicatadas, o acúmulo dos fenóis nos tecidos exerce um efeito tóxico, impedindo o ingresso do patógeno no sistema vascular (Chérif et al., 1992). Em outro estudo, Chérif et al. (1994) observaram aumento na atividade das enzimas quitinases, peroxidases e polifenoloxidases nas raízes de plantas de pepino supridas com Si e inoculadas com Pythium ultimum, ao contrário do que foi observado em plantas não supridas com Si. No patossistema feijoeiro-C. lindemuthianum, o Si reduziu a área abaixo da curva do progresso da incidência e severidade da antracnose (Moraes et al., 2006). De acordo com Polanco et al. (2012), plantas de feijão supridas com Si apresentaram um aumento de 55% no período de incubação e diminuição significativa de 32% na área abaixo da curva de progresso da doença em relação às plantas não supridas com Si. O aumento na concentração de lignina assim como a maior atividade de fenilalanina-amonia liase e lipoxigenase foram importantes para a resistência de plantas supridas com Si em resposta à infecção por C. lindemuthianum (Polanco et al., 2012). Apesar desses resultados promissores, é desconhecido como as plantas de feijoeiro supridas com Si respondem à infecção por C. lindemuthianum em nível microscópico. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar microscopicamente o efeito do Si na resistência do feijoeiro à infecção por C. lindemuthianum.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Preparação da solução nutritiva

A solução nutritiva utilizada para o crescimento das plantas de feijoeiro, constituída de: 3 mM KNO₃; 2 mM Ca(NO₃)₂.4H₂O; 0,5 mM MgSO₄.7H₂O; 0,25 mM (NH₄)₂SO₄; 0,5 mM NH₄H₂PO₄; 12,5 µM H₃BO₃; 1 µM ZnSO₄.7H₂O; 0,25 µM CuSO₄.5H₂O; 0,25 µM MnCl₂.4H₂O; 0,25 µM (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O; 25 µM FeSO₄.7H₂O e 25 µM EDTA bisódico, foi preparada de acordo com Liao et al. (2004). O Si, fornecido como ácido monossilícico foi obtido pela passagem do silicato de potássio através da resina de troca de cátions (Amberlite IR-120B, H⁺ forma, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) (Ma et al., 2002). As concentrações de Si utilizadas foram de 0 e 2 mM.

Crescimento das plantas e aplicação dos tratamentos

Sementes de feijoeiro (cv. Pérola) foram desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio 10% (vol/vol), posteriormente lavadas em água estéril por 2 min e germinadas em papel filtro embebido com água estéril por dois dias a 25 ºC. As plântulas foram mantidas por dois dias em solução nutritiva meia força iônica sem adição de Si. Após esse período, as plântulas foram transferidas para novos vasos plásticos contendo 5 L de solução nutritiva com ou sem a presença de Si, sob aeração, até o final do experimento. A solução nutritiva foi trocada a cada quatro dias ou quando a condutividade elétrica atingiu 85% do valor inicial. O pH da solução nutritiva foi verificado diariamente e mantido a 5,5 empregando-se soluções de NaOH ou HCl (1 M), quando necessário.

Procedimento de inoculação

O isolado C15 da raça 81 de C. lindemuthianum utilizado para inocular as plantas foi preservado em tiras de papel de filtro dentro de tubos de vidro contendo sílica gel a 4 ºC. Pedaços de papel filtro contendo micélio do fungo foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA). Para a produção do inóculo, pedaços de meio BDA (5 mm de diâmetro) contendo micélio do fungo foram colocados na superfície de vagens de feijoeiro esterilizadas cujas bases foram inseridas em meio ágar-água a 3% (vol/vol) contido em tubos de ensaio (Pastor-Corrales, 1985). Esses tubos foram armazenados em câmara de crescimento a 25 ºC com fotoperíodo de 12 h luz/12 h escuro por 10 dias. Após o crescimento micelial e a produção de acérvulos contendo conídios, adicionou-se água destilada aos tubos para se obter a suspensão de conídios. A suspensão foi filtrada em gaze dupla e ajustada para a concentração de 1,2 × 10⁶ conídios mL^-1 em hemacitômetro.

Plantas de feijoeiro no estádio de crescimento V4 (Vieira, 1998) foram inoculadas com a suspensão de conídios, em ambas as faces das folhas, utilizando-se atomizador De Vilbiss n. 15. Gelatina a 1% (peso/vol) foi adicionada à água estéril utilizada para preparar a suspensão de conídios para auxiliar a adesão dos conídios às folhas. Imediatamente após a inoculação, as plantas foram transferidas para câmara de nevoeiro a 20 ± 2 ºC com umidade relativa de 90% e fotoperíodo de 12 h luz/12 h escuro por 24 horas. Após esse período, as plantas foram mantidas em câmara de crescimento com temperatura de 21 ± 2 ºC, umidade relativa de 95% ± 2% e fotoperíodo de 225 µE m^-2 s^-1 fornecido por lâmpadas fluorescentes brancas. As plantas foram mantidas nessa câmara até o término dos experimentos.

Avaliação da severidade da antracnose e determinação da concentração foliar de Si

Os folíolos da terceira folha de 36 plantas de cada tratamento foram selecionados para avaliar a severidade da antracnose às 96 horas após inoculação (hai) de acordo com a escala diagramática proposta por Godoy et al. (1997). Para a determinação da concentração foliar de Si, após o término dos experimentos, as folhas das plantas das repetições de cada tratamento foram coletadas, lavadas em água deionizada e secas a 65 ºC durante 72 horas. Posteriormente, as folhas foram moídas em moinho tipo Thomas-Wiley com peneira de 40 mesh. A concentração foliar de Si foi determinada por análise colorimétrica da digestão alcalina de 0,1 g de tecido foliar seco (Korndörfer et al., 2004).

Microscopia eletrônica de varredura e microanálise de raios-X em tecidos foliares

Amostras dos folíolos da terceira folha de 36 plantas (≈ 5 cm²) foram coletadas às 96 hai e processadas de acordo com Araujo et al. (2014) para microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de raios-X por dispersão em energia (EDS). As amostras foram mantidas em solução de fixativo composto de glutaraldeído 2,5% (v/v) preparado em tampão cacodilato de sódio (0,05 M, pH 7,2) por 7 dias em geladeira a 4 oC. Após essa etapa, o fixativo foi removido, os espécimes foram lavados em tampão cacodilato de sódio (por 15 min, três vezes), pósfixados em tetróxido de ósmio 0,5% em água por 1 hora e lavados duas vezes por 15 min em água destilada. Em seguida, os espécimes foram desidratados em gradiente de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100%, duas vezes, por 15 min cada). Após a desidratação, os espécimes foram submetidos à secagem ao ponto crítico no aparelho Critical Point Dryer (Bal-Tec, Modelo CPD030), montados em stubs e recobertos com um filme de ouro paládio (60 nm) por meio de pulverização catódica. Para a microanálise de raios-X, as amostras foram recobertas com uma fina camada de carbono (Quorum Q150 T, East Grinstead, West Sussex, Inglaterra, UK). Ao final dessa etapa, os espécimes foram observados no MEV (LEO modelo VP1430), o qual foi operado entre 15-20 kV para obtenção das eletromicrografias. Os elementos silício (Si), potássio (K), cálcio (Ca), enxofre (S), ferro (Fe), magnésio (Mg) e manganês (Mn) foram detectados por EDS (Tracor TN5502, Middleton, WI, USA) associado ao MEV. Para cada tratamento, três stubs com quatro amostras de tecido foliar foram examinados no MEV e um total de dez imagens foram obtidas a partir de cada amostra.

Delineamento experimental e análises estatísticas

Dois experimentos foram instalados em delineamento inteiramente casualizado com dois tratamentos [ausência (-Si) ou presença (+Si) de Si na solução nutritiva] e 12 repetições para avaliação da severidade da antracnose e da concentração foliar de Si. Os dados dos dois experimentos foram combinados após determinação da homogeneidade de variância pelo teste de Cochran (Gomez e Gomez, 1984). Cada unidade experimental correspondeu a um vaso plástico contendo 5 L de solução nutritiva e três plantas de feijoeiro.

3. RESULTADOS

Concentração de Si foliar e severidade da antracnose

A concentração foliar de Si foi significativamente maior para as plantas supridas com Si (1,25 dag/kg) em relação às plantas não supridas com Si (0,42 dag/kg). A severidade da antracnose decresceu cerca de 52% nas folhas das plantas supridas com Si (4,4%) em relação às folhas das plantas não supridas (8,5%).

Microscopia eletrônica de varredura

Pelas eletromicrografias de varredura foi possível observar alterações morfológicas (destruição do tecido vascular resultando em perda de conformação) nas nervuras das folhas das plantas não supridas com Si em comparação com as nervuras das plantas supridas com Si, as quais se mostraram menos danificadas (Figura 1).

Microanálise de raios-X

Pela microanálise de raios-X verificou-se maior concentração dos elementos Si, K e S nas folhas das plantas supridas com Si em relação às folhas das plantas não supridas com esse elemento (Tabela 1). Houve um aumento de 114% na concentração de Si nas folhas das plantas supridas com esse elemento (Tabela 1). Níveis elevados de deposição de Si, K e S foram observados próximo das nervuras das folhas das plantas supridas com Si em comparação com as folhas das plantas não supridas com esse elemento (Figuras 2 e 3).

4. DISCUSSÃO

O presente trabalho apresenta as primeiras evidências, em nível microscópico, de que a resistência do feijoeiro à antracnose é potencializada pelo silício. É reconhecida a importância do Si na redução da intensidade de várias doenças em importantes culturas comerciais (Cruz et al., 2012; 2013; Datnoff et al., 2007; Domiciano et al., 2013; Sousa et al., 2013). De acordo com Polanco et al. (2012), uma maior concentração de Si nas folhas de plantas de feijoeiro supridas com Si reduziu a área abaixo da curva do progresso da antracnose e contribuiu para o aumento do período de incubação. Dados similares foram encontrados em outras dicotiledôneas, por exemplo, no patossistema soja- Phakopsora pachyrhizi (Lemes et al., 2011). Lemes et al. (2011) verificaram aumento no período de incubação e redução na área abaixo da curva de progresso da ferrugem asiática em plantas supridas com silício em comparação a plantas não supridas com esse elemento. Curvêlo et al. (2013) verificaram aumento no período de incubação e no período latente da ramulose em folhas de plantas de algodoeiro das cultivares NuOpal e BRS Buriti supridas com Si. No presente estudo, a maior concentração foliar de Si contribuiu para reduzir a severidade da antracnose em plantas de feijoeiro supridas com este elemento, de forma semelhante ao que ocorre em outros patossistemas (Datnoff et al., 2007).

Nas eletromicrografias de varredura foi possível observar deformação das nervuras principais nas folhas das plantas não supridas com Si enquanto que nas folhas das plantas supridas com Si as nervuras foram menos danificadas pela colonização por C. lindemuthianum. Durante o progresso da antracnose, ocorre inicialmente necrose da nervura principal, seguida de murcha dos folíolos devido à grande quantidade de hifas do fungo no interior dos vasos do xilema (Godoy et al., 1997). O fungo C. lindemuthianum produz enzimas líticas que degradam a parede celular do feijoeiro e toxinas não seletivas que danificam ainda mais as células do tecido foliar do hospedeiro, principalmente as nervuras (Bailey et al., 1992; O'Connell et al., 1985). No presente estudo, as alterações morfológicas nas nervuras das folhas das plantas não supridas com Si provavelmente comprometeram o transporte de água e nutrientes, o que foi comprovado pelo murchamento precoce dos folíolos dessas plantas. Ao contrário, a barreira física proporcionada pela deposição de Si nas nervuras das folhas das plantas supridas com Si pode ter afetado a penetração e a colonização de C. lindemuthianum nos tecidos foliares. Polanco et al. (2012) ressaltaram a importância da lignina e das enzimas fenilalanina-amonia liase e lipoxigenase para a maior resistência das plantas supridas com Si à antracnose.

Folhas das plantas de feijoeiro supridas com Si apresentaram altos níveis dos elementos Si, K e S próximo às nervuras. Isa et al. (2010) também encontraram altos níveis de Si, K e S em raízes, caule e folhas de plantas de arroz supridas com Si. Esses autores ainda verificaram que plantas de arroz supridas com Si apresentaram maior desenvolvimento de raízes laterais e aumento na concentração total de minerais (Isa et al., 2010). A concentração de alguns elementos químicos nos tecidos vegetais pode aumentar a resistência à infecção por patógenos (Haneklaus et al., 2007; Prabhu et al., 2007). Maiores concentrações de S sobre tecidos de caules de cacaueiro e mangueira foram associados com o aumento da resistência, respectivamente, a Verticillium dahliae e a Ceratocystis fimbriata (Cooper et al., 1996; Araujo et al., 2014). O S pode diminuir diretamente a intensidade de diversas doenças pela sua ação antimicrobiana ou, indiretamente, pelo aumento da resistência do hospedeiro (Haneklaus et al., 2007). Sugimoto et al. (2009) constataram que plantas de soja supridas com potássio apresentaram sintomas reduzidos de podridão radicular causada por Phytophthora sojae. A microanálise de raios-X mostrou acúmulo de K em torno do câmbio, xilema e floema no tecido da haste da soja, tecidos preferencialmente infectados por P. sojae (Sugimoto et al., 2009). Embora, ainda não seja bem compreendida a função fisiológica do K para os mecanismos de resistência das plantas às doenças, várias funções têm sido atribuídas a esse elemento, como: alterações na disponibilidade de proteínas ou aminoácidos, diminuição da permeabilidade celular e redução da suscetibilidade do tecido à maceração causada por enzimas líticas e penetração do patógeno através do espessamento da cutícula e paredes celulares (Prabhu et al., 2007). No presente estudo, os altos níveis de S nas folhas das plantas de feijoeiro supridas com Si podem ser associadas a um possível efeito antimicrobiano contra C. lindemuthianum. Além disso, altos níveis de Si e K nas folhas de feijoeiro podem ter contribuído para o fortalecimento das paredes celulares, que prejudicou a colonização por C. lindemuthianum, ajudando a explicar, assim, a redução nos sintomas da antracnose nas folhas das plantas supridas com Si.

5. CONCLUSÃO

A maior concentração foliar de Si contribuiu para reduzir os sintomas da antracnose nas nervuras das folhas das plantas supridas com esse elemento. Além disso, a resistência ao fungo C. lindemuthianum em plantas de feijoeiro supridas com Si parece estar associada com maiores concentrações foliares de S e K.

AGRADECIMENTOS

F.A. Rodrigues agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pela bolsa de produtividade em pesquisa. Os autores agradecem ao Núcleo de Microscopia e Microanálise da Universidade Federal de Viçosa pela utilização do MEV, EDS e os equipamentos auxiliares.

Recebido: 6/maio/2014

Aceito: 27/jun./2014

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Ago 2014
• Data do Fascículo
  Set 2014

Histórico

• Aceito
  27 Jun 2014
• Recebido
  06 Maio 2014